RAPPORTO S UL LAVORO DEL GRUPPO DI RICERCA SULL'EPATITE VIRA LE presentato dal Prof. BRENNO BAB UDIERI il 6 a prile 1965 Indagini sull'agente eziologico dell'epatite virale umana H anno partecipato alle ricer ch e qui riportate: BRENNO BA BU DIERI (Laboratori di Microbiologia) ; ENRICO FIASCHI (Istituto di P atologia medica dell'Università di Padova) ; REMo NACCARATO (I stituto di Patologia m edica dell'Università di Padova\; Lu oov1co A . SCURO (Istituto di Patologia m edica dell'Università di Padova); GENEVIÈVE PAPA ( Borsista dei Laboratori di Microbiologia); con l'assistenza tecnica di: }UTTA HAASE (Ospite dei Labor atori di Microbiolo gia) ; FRANCO T.\NGUCCI (Laboratori di fisica). Le ricer che sono state svolte dal 1963 al 1965 presso i Laboratori di Micr obi ologia ed i Laboratori di Fisica. PREMESSA L'epatite virale è certamente una delle m alattie infettive ch e maggiormente h anno attirato in questi ultimi anni l'attenzione del clinico e del virologo. Ciò per tre ragioni principalmente : p er la sua frequenza progr essivam ente crescente, non solo in Italia, ma in quasi tutti i paesi del mondo, p er la su a non rara t endenza ad evolver e ver so processi cirrotici, evoluzione prima inus uale o per lo m eno non riconosciuta, ed infine perchè essa è una delle poche m alattie infettive di m aggior importan za di cui sia ancora ignoto l'agente eziologico. Quest 'ultima affermazione potrà sorprendere chi, n on interessato dirett amente a questo argomento, ricordi le frequenti segnalazioni di questi ultimi anni, spesso riech eggiate dalla stampa d'informazione, sull'identificazione o l'isolamento d el «vero)) v irus dell'epatite infettiva. Molti «veri)) agenti d eli' epati te virai e sono st ati isolati, ma purtroppo, pur avendo ciascuno di essi argomenti validi in proprio favor e, essi sono, p er caratteri fondamentali, ciascuno diverso dall'altro . Nelle due riunioni ch e il Comitato degli esp erti dell'epatite virale dell'OMS h a tenuto, nel 1963 a Ginevra e nel 1964 a Praga, tutti questi r eperti sono stati criticamente considerati e p er nessuno di essi si è ritenuto ch e le preve addotte fossero sufficienti per con sider ar e .-1 11 >>. l st . .Supcr. Sani t à (1965) 1, H S·4 86. 479 EPATITE VHIALE risolto il problema eziologi co d ell'epatite v irale . Ciò vale anche p er il v irus, il cosidetto << Hemovirus n, isolato da RIGHTSEL et al. ( 1" 3 ) nei la boratori della Parke e Davis, studiato con grandi mezzi e considerato p er alcuni anni come il candidato provvisto di maggiori titoli. Ad alcune perplessità riguardanti alcune t ecniche seguite da quei ricer catori c certi risultati da essi ottenuti, si è aggiunto di recente il p eso n egativo della m an cata conferma da parte di altri laboratori che hanno voluto ripetere tali prove. Non è nostro intendimento enumerare qui i vari r ep erti virol ogici esist enti n ella letteratura; rinviamo p er questo alla b ella rassegn a fatta da DARDANONI (4 ) al congresso d ella Società italiana d 'igien e, tenuto a Catania n ell'autunno del 1963. Dopo tale data qualche altro reperto s'è aggiunto, come quello di LIEBHABER et al. (6 ) n egli Stati Uniti, di BucnNER e SuREEVE ( 6) n el Canadà, di CASSEL (1) in Getmania. Si tratta in gen ere di effetti citopatogeni ottenuti inoculando in colture cellulari estratti ottenuti da feci, urine o, in un caso, dal siero di pazienti. CASSEL invece h a ripreso precedenti ricerch e attribuendo significato v irale ad alcuni elementi che aveva già preced entemente descritto. Gli studi sulle lesioni subcellulari ch e l'e patite v irale umana determina nell'epatocita sono poco numerosi . Ricordiamo l e osservazioni di BRAUNSTEINER et al. ( 8 ), di CASSEL (1· 9) , di BEARCROFT et al. (1°· 11 ), di TAYLOR et al. (3 ) , tra di loro in complesso concordanti. Le l esioni più evidenti sono a carico dei mitocondri, ch e appaiono rigonfiati e con l e cristae ridotte o frammentate. I vacuoli del r eticolo citoplasmatico sono ipertrofici e si nota un aumento sp esso con sid er evole, n el r eticolo, d ei gr a nuli di Palade. Le aree ergastoplasmatiche sono di solito ridotte c male delimitabili. Il nucleo appar e scarsamente interessato dall'infezione. Gli scopi ch e ci siamo p roposti nelle nostr e ricerche sono stati due: studiare al microscopio elettronico l e l esioni d ell'epatocit a in corso di epatit e virale e identificare nelle cellule epatich e l ' a n cora ignoto virus responsabile d ell'infezione. PRELEVAMESTO E PREPARUIO:\E DELLE BrOP lE I pazienti da noi presi in considerazione provengono tutti da episodi epidemici di epatite v ira le, manifestatisi sia in Sard egna ch e n el Veneto. Non abbiamo preso in considerazione soggetti ammalatisi all'infuori d elle zone epidemiche, i quali avrebbero potuto offrir e qualche dubbio diagnostico . La diagnosi è stata posta in base a criteri clinici, biochimici (transaminasi, prove di fun zionalità ep a ti ca e di !abilità serica) e, almeno in parte, sierologici (reazione di H oyt-Morrison). Il material e di studio è stato prel evato mediante biopsia epatica praticata con l 'ago di Silvermann. II fra mmen to destinato a1l'esame ultramicroAll •l. l•t . Sapa. S fl>•iloì 0 9GJ) t , 4i8·!SG. 480 RAPPORTI DEI GRUPPI DI RICERCA scopico è stato immediatamente fissato con acido osinico all'l % in tampone di Michaelis a pH = 7,2, passato nella serie degli alcool-acetone e successivam ente incluso in m etacrilato o in araldite. L e inclusioni sono stat e sezionate con un ultramicrotomo P orter-Blum ed osservate con il microscopio elettronico Sicmens E liniskop I. Raramente le sezioni sono state osservate senza trattam ento ; più spesso sono state colorate con a cetato d'uranile o con Karnow ski. Altri frammenti di tessuto sono stati osservati con il microscopio ottico, impiegando le abituali tecniche istologich e o sono stati sottoposti all'osservazione al microscopio a fluorescenza dopo trattamento con acridin-orange o con gamma-globuline di convalescente coniugate con l'isotiocianato di fiuoresceina. Come controlli sono stati studiati frammenti bioptici tratti da fegati di soggetti affetti da malattie diverse dall'epatite virale. OSSERVAZIONI AL MICROSCOPIO ELETTRONICO Il nucleo della cellula epiteliale epatica non vien e particolarmente alterato dall 'infezione. Esso è ricco di cromatina come di norma e questa è uniformemente distribuita in esso. Contrariamente all' opinione di BEAR· CROFT (10), n on riteniamo ch e questa distribuzione uniforme sia caratteristica dell'epatite virale . Abbiamo osser vato aspetti perfettamente u guali anch e in nuclei di cellule epat ich e di controllo. Nei casi non gravi di ep atite virale le lesioni submicroscopich e del citoplasma della cellula ep atica non sono molto con siderevoli. L'alterazione più evidente consiste in un rigonfiam ento dei canalicoli costituenti il r eticolo citoplasmatico (Fig. l). Alle volte su sezioni trasverse essi appaiono come vacuoli vuoti. Il num ero dei Initocondri appare modicamente aumentato ed essi si presentano rigonfi e rotondeggianti. L e cristae sono diminuite di numero e spesso frammentate. Essi contengono uno scarso numero di gr anuli opachi, presenti del resto anche in cellule normali (Fig. 2). Nel citoplasma si osservano alcune inclusioni di notev ole opacità, prob abilmente costituite da lipidi. Esse sono di dimensioni notevolmente maggiori di quelle presenti n egli epatociti normali e talvolta comprendono n ella loro struttura un certo numero di vacuoli vuoti (Fig. 3) . I lisosoini sono piuttosto numerosi e raggiungono spesso dimensioni maggiori che nella cellula normale. Alcuni lisosoini alterati contengon o al loro centro un materiale di n otevole opacità, di probabile natura lipidica, circondato da una zona trasparente ch e è probabilmente da considerarsi un artefatto dovuto al trattamento subito dai t essuti con l' acetone (Fig. 4) . Altri lisosoini contengono invece ammassi di ferritina intensam ente opachi, .Jnn. ]$t. Su.per. Sanità (1965) 1, 478-486. e questi n on anche in celi Nel cito} m eni di aut• citoplasma p: frequenza qu vacuolo è con appena all'in I InicroS4 cogeno hann< Nel cito isolati ch e r : sezioni sono ! simili. Esse ! Accanto ribili a comi zioni che alt1 l'epatite infe1 zioni a rosett state da n oi 1 m ente a picc< con p olisomi. Abbiamc un diametro intensamente Queste forma quelli grandi siderati com• m ente l'asp e1 quello dell'es da SCHULZE a ch e vedere derazioni, il dell'epatite • Mc CoLLUM 1 del filtrato a Del r estc artefatti, in sopradescritt< Un aspe corso di epa1 con il viru s ( 481 EPATITE VI RALE ; in tampone te e su ccessi) st at e seziomicr oscopio 1te osservate ) d 'uranile o ;copio ottico, lsti all' osser;ridin-orange :iocianato di tti da fegati ticolarmente ma e questa ne di B EAR.ia caratteri· 1ente u guali ch e del citoerazione più ti il r eticolo Jaiono com e .ato ed essi e di numer o muli opachi, •p acità, prolmente mag:ndono nella dimensioni ntengono al ur a lipidica, ,siderarsi un me (Fig. 4) . ente opachi, 65) 1, 478·486. e questi non differiscono in manier a apprezzabile d a quelli, simili , pr esenti anche in cellule normali. Nel citoplasm a si possono osser var e anch e alcuni vacu oli dovuti a fenom eni di autolisi. E ssi contengono abitualmente una piccola p or zione di citoplasma più o m eno alter ato, racchiuso da una m embran a. Con not evole frequenza questi frammenti sono stipati di ribosomi (Fig. 5) . Alle v olte nel vacuolo è contenuto anch e un intero mitocondrio, in cui i processi litici sono appen a all'inizio (Fig. 6). I microsomi non m ostrano particolari alter azioni. Le zon e contenenti glicogeno hanno un aspetto normale ma sono r idotte di numero e di est ensione. Nel citoplasma si possono inoltre osserv are gr anuli di ferritina , sia isolati che r accolti in piccoli ammassi, all'infu or i dei lisosomi . In alcune sezioni sono st at e vist e inclusioni costituite d a lamelle concent rich e mielinosimili. E sse sono probabilmente formate da colest erolo. Accanto a quest e strutture più o m eno alterate, ma agevolmente riferibili a compon enti citoplasmatici not i, abbiamo osser vat o alcune formazioni ch e altri AA. hanno creduto di poter riferire al ricer cato agente dell'epatite infettiva. Abbiamo così osservato con una certa frequenza le formazioni a rosetta d escritte da BEARCROFT (10) . F orm azioni d el tutto simili sono state da noi trov at e anche in cellule normali . L e riteniam o dovute gen er alm ente a piccoli ammassi di granuli di glicogeno o, alle volte li identifichiamo con p olisomi, costituiti dall'aggregazione di un certo numer o di ribosomi. Abbiamo pure osser vato, n on raramente, in cellule lese, corpiccioli con un diam etro di 420-2500 A, circondati d a una m embrana singola o doppia, intensamente opaca (Fig . 8). E ssi m ostrano al cen tro un gr anulo opaco. Queste formazioni corrispondono risp ettiv amente ai corpiccioli piccoli ed a quelli grandi descritti da BRAUNSTEINER et al. ( 8 ) e da CASSEL (1• 9), e con· siderati com e possibili elem enti virali. In effetti essi ricordano notevolm ente l'aspetto di alcuni virus di grosse o m edie dimen sioni e soprattutto quello dell'esantema coitale vescicolare dei bovini, descritto r ecentem ente da SCHULZE et al. (12) . Quest e formazioni, a nostro parer e, non h anno nulla a che vedere con il virus d ell'epatite infettiva, p er chè, a p arte altre considerazioni, il loro diametro è notevolmente m aggiore di quello che il virus dell'epatite deve avere in base alle prove di filtrazione eseguite da Mc CoLLUM (18 ) attraverso m embrane gradua te e successiva inocula zione del filtrato a v olontari umani. Del r esto già n ell958 DE HARVEN e F RIEND (u) hanno descritto, quali artefatti, in cellule epatiche normali, formazioni alquanto simili a queste sopradescritte. Un aspetto m orfologico molto caratteristico della cellula ep atica in corso di epatite virale, e ch e potrebbe an ch e aver e un certo riferimento con il virus della malattia, è quello ch e riguarda i ribosomi. Già altri AA. .4nn. l st. Supe:~·. Sanità (1965) 1, 47 8·486. 482 R APPORTI DEI GR l ' PPI D I RI CER CA e fra questi sp ecialmente B EARCROFT e PEACHEY (11) avevano n otato ch e nel citoplasm a degli epatociti in cor so di epatite virale c'è un forte aumento di R NA. P oich è lo R NA aumenta anch e in casi di intossica zione non eccessivamente gr ave da veleni epatotropi, qualcuno ha ritenuto ch e questo a umento potesse esser e m esso in rapporto con un aumentato passaggio n el citoplasma di RNA messaggero, in rapporto ai processi di sintesi proteica connessa a fenomeni rigen erativi d ella cellula danneggiata. N oi abbiamo p otuto confermar e questo aumento dello R NA citoplasmatico color ando le cellule ep atiche infette con acridin-oran ge dopo fissa zione con Carnoy . Abbiam o anche potuto constatare, e cr edo che questa sia una osserv a zione originale, ch e n ell'epatite virale le cellule epatich e colorate semplicem ente con ematossilina Caraz zi ed eosina, mostrano il loro citoplasma come velato da una granulosità basofila uniformem ente diffusa ed estremam ente fine. È p ossibile che essa sia dovuta allo RNA diffuso n el citoplasma. Pur non potendosi escluder e quest o presunto aumento dello R NA m essaggero, si deve riten ere ch e l'aumento dello R NA citoplasmatico sia essenzialmente legato ad un notevole aumento dei granuli di Palade . Questi spiccano con maggior nitidezza ch e di n orma, caratteristica questa rilevata anche da T AYLOR el al. (3 } , ed accanto a quelli ordinati come di norma lungo le p ar eti dei canalicoli del r eticolo o ader enti ai sa cchi m embranosi piatti d el citoplasma, se n e osser vano altri che formano piccoli aggregati n el citoplasma o ch e in certe zone si dispongono ordinatamente in più file parallele, con r egolari intervalli tra i singoli granuli, sì da assumer e alle v olte una struttura similcristallina ch e richiama strutture intracellulari similari caratteristich e di certi virus (Fig. 7) . Questo notevole e caratteristico aumento dei ribosomi ed il loro peculiare ordinamento in certe zone del citoplasma ci portano all'ipotesi ch e essi possano aver e rapporto con la sintesi del virus. Desideriamo infine descriver e un altro tipo di formazioni ch e riteniamo, sia pure con le debite riser ve, di poter identificare con il virus ricercato (Figg. 9, 10, ll, 13). Quest e formazioni sono state da noi ritrovat e in 6 soggetti, su puntati epatici praticati da un minimo eli 9 ad un massimo di 33 giorni d all'inizio clinico della m alattia. Si tratta di formazioni gr anulari, rotondeggianti, con un di am etro che s'aggira intorno ai 200 A. Ri cordiamo ch e Mc COLLUM (13) ha valutato con prove di filtrazione, ch e il virus dell'epatite B deve misurare circa 260 A di diametro. Qualora si tenga presente che n ei processi di disidratazione conseguenti alla fissazione e n ell'inclusione del preparato per l'osservazione al microscopio elettronico, le particelle virali subiscono u na riduzione del loro diametro che arriva fino al 20 %, si constata che le n ostre formazioni granulari misurano esattamente quanto t eoricamente ci si doveva attendere . .Min. l st . Su ptr. Sanità (1965) 1, 478·486. Qu esti gr sati, m a p iù s tico rotondeg1 diametro di O che delimita ; p r esunti elem• nu mero di essi I n un caso ab come lo st adio citoplasm a tic:; n on b en e defi d' asp ett o. P er non circondati con le caratt€ Questi sa alle immagini dell'anatra afJ r espon sabile è I granuli p er le loro di ordinamento r da una m emb ribosomi assu An che un Ad ogni mode m ento d elle S{ t am ente il gli( diast asi. Qu es· n oi descritti. Non abbi epatiche di cc L e fo r ma2 ma la presen z' fa ritener e che citaria, forse iJ R fCER P er accer1 riferibili a quel abbiamo fatt o abbiamo estra 483 EPAT ITE VIRA LE o notato che nte aum ento te non ecces• che questo )assaggio nel ttesi proteica ~NA citoplae dopo fìssa he questa sia .ich e colorate ro citoplasma t ed estrema:! citoplasma . o RNA mesico sia essentlade. Questi esta rilevat a te di norma m embranosi oli aggregati te in più file ssumer e alle intracellulari il loro p ecu )tesi che essi oni ch e rite1 virus riceri, su puntati ni dall'inizio liametro che valutato con o ·ca 260 A di .tazione con.ervazione al iduzione del e formazioni ra attendere. 965) t , 478-486. Questi granuli, in qualche caso notevolmente e irregolarmente addensati, m a più sp esso r elativam ente disper si, occupano uno spazio citoplasmat ico rotondeggiante od ovalare, scarsament e opaco ai raggi elettronici, del diametro di 0,3-1 fi, racchiuso da una m embrana semplice, simile a quella che delimita abitualmente i vacuoli citoplasmatici. La massima parte dei presunti elementi virali si trova r acchiusa in questi sacculi, ma uno scarso numero di essi si trova irregolarmente disseminato n el citoplasma circostante. In un ca so abbiamo osservato quello che potrebbe forse esser e con siderato come lo stadio iniziale di formazione di un ammasso virale. Si tratta di un' area citoplasmatica simile a quelle sopra descritte, delimitata da una membrana non b en e definita in tutta la sua estensione, opaca e piuttosto omogen ea d'asp etto. P erò alle due estremità di tale spazio si osser vano due vacuoli, non circondati da m embrana, chiari e contenenti un certo numero di granuli con le caratteristich e di quelli sopra descritti ~Fig. 12). Questi sacculi contenenti granuli da noi osservati, sono molto simili alle immagini descritte r ecentem ent e da RICHTER et al. (15} negli epatociti dell'anatra affetta da epatite virale, e considerate com e ammassi del virus r esponsabile di quella infezione (Fig. 14). I granuli da noi descritti si distinguono agevolmente dai ribosomi, sia per le loro dimensioni lievemente superiori, sia perchè non mostrano un ordinamento r egolare in linee, sia perchè sono contenuti in sacculi delimitati da un a m embrana. Inoltre essi sono chiaramente rotondeggianti, m entre i riliosomi assumono spesso una forma triangolare molto caratteristica. Anche una confusione con granuli di glicogeno è facilmente evitabile. Ad ogni modo, p er maggior sicurezza, abbiamo fatto ricorso sia al trattamento delle se7.ioni con l'acetato d 'uranile ch e, com'è noto, differenzia n et tamente il glicogeno dagli acidi nucleici, sia al trattamento d ei tessuti con diastasi. Questa, che dissolve il glicogeno, non intacca invece i granuli da noi descritti. Non abbiamo mai osservato formazioni di questo gener e in cellule epatich e di controllo, prelevate a pazienti affetti da altre malattie. Le formazioni da noi descritte sono generalmente situate negli epatociti, ma la presenza, in qualche caso, nelle cellule infette, di numerose fini fibrille, fa riten er e che esse possano essere situate anche in elementi di natura istiocitaria, forse in cellule di Kupffer. R ICERCHE CO IL METODO DELLA fMM U OFLUORESCENZA P er accertare se questo presunto virus abbia caratteristich e antigeniche riferibili a quelle ch e dovrebbero esser e proprie del virus dell'epatite infettiva, a bbiamo fatto ricorso alla tecnica dell'immunofluorescenza. A questo scopo abbiamo estratto le gamma-globuline dal siero di alcuni soggetti convale.Ann. 1st. Super. Sanitd (1965) t , 478·486 . 484 RAPPORTI DEI GRUPPI DI RI CER CA scenti di epatite virale tipica, con r eazion e di Hoyt-Morrison nettamente positiva. Le gamma-globuline son o stat e coniugat e con isotiocianato di fluoresceina e, previo adsorbimento con polver e di fegato umano normale, esse sono stat e m esse a contatto, sia con sezioni, sia con preparati per impronta di frammenti epatici prelevati per biopsia da quei pazienti in cui avevamo visto al microscopio elettronico il presunto virus. Abbiamo così ottenuto delle aree di fluorescenza intracellulare, aree ch e molto spesso risultano costituite da un insieme di piccoli spazi rotondeggianti, ch e potrebbero corrispondere ai sacculi da noi osservati al microscopio elettronico. (Figg. 15 e 16) TE "TATIVI DI COLTIVA ZfONE DEL VIRUS I COLTURE DI CELLULE Il passo su ccessivo al quale ci siamo accinti è stato quello di tent ar e la coltivazione del virus su colture cellulari. Questi t entativi sono ancora in corso e non ci hanno dato finora risultati definitivi. Gli stipiti cellulari impiegati per questo scopo sono stati soprattutto quelli H eL a, KB e lo stipite RC, gentilmente fornitoci d al Prof. Rita. Questo ceppo, le cui cellule sopravvivono in coltura per molti giorni, è quello ch e ci ha dato i risultati più incoraggianti. Prem ettiamo che in n essun caso abbiamo osservato un effetto citopatogeno, m a a questo risultato n egativo non abbiamo dato eccessiva importanza perchè, a parte la dimostrata possibilità ch e un virus si sviluppi in cellule senza portarle alla degenerazione, ci siamo prosp ettati la possibilità ch e il virus dell'epatite virale, in considerazione anche del lungo periodo d'incubazione caratteristico di questa m alattia, si sviluppi molto lentamente nelle cellule, sì ch e l'eventuale effetto citopatogeno potrebb e anch e coincidere con i fatti degenerativi che normalmente si manifest ano n elle colture cellulari eccessivamente invecchiate. Non volendo ricorrere, p er ragioni etich e, all'impiego dei cosidetti (( volontari umani n e non potendo utilizzare, per la loro non ricettività, gli animali di laboratorio, abbiamo fatto ricorso, anche in questo caso alla tecnica dell'immunofluorescenza. Diciamo brevemente ch e siamo riusciti ad identificare zone di fluorescenza anche in colture al 2° o 40 passaggio. Queste compaiono in genere verso la 15a giornata e raggiungono il massimo verso la 20a-2sa. D evo dire però ch e in qualch e caso abbiamo avuto fluorescenza anch e con l'impiego di gamma-globuline provenienti da un siero di soggetto presumibilmente sano. A questo riguardo, data la grande diffusione delle form e clinicamente mute dell'epatite virale, occorre osservare che è molto difficile poter essere certi che un siero prelevato ad un soggetto ritenuto sano non contenga anticorpi per il virus epatitico. Ricordiamo a questo riguardo le r ecenti indagini di SPo G ( 16) che trovò valori di transaminasi superiori alla norma nel Amo. 1st. Sr.per. Sani tà (1 965) l , 478-486. 76% di 737 S O! dove c'erano : Ad ogni 1 sono incompl< E sse debbono in questo cam biologiche del ter apeutiche { va di giorno Esprimia1 ciar elli per i Riasstmt di epatite vir. framment aziOJ canalicoli del n enti pigmen1 che invadono Nel citopl di 200 A. di d brana semplic all' agente dell Vengono tentativi di c1 Summar cell, in virai h< plasmic reticu of the mitocho Character large amount in more parall In many l border ed b y a a diameter of These ((s. areas observed of convalesce thiocyanate. The AA. l human virai l l n n ettamente •tiocianato di tano normale, per impronta cui avevamo così ottenuto sultano costiero corrispon15 e 16) CELLULE lo di t entare >no ancora In ·llulari impielo stipite RC, ule sopravvi:ati più incoetto citopatoa importanza ppi in cellule sibilità che il odo d'incuba:a m ente n elle be coincidere ~ colture celagioni etiche, Ltilizzare, per ricorso, anche 1 brevem ente colture al 20 ta e r aggiun:aso abbiamo rovenienti da clinicamente · poter esser e on contenga recenti indalla norma nel 965) l , 47 8-486. EPATITE VIRALE 485 76% di 737 soggetti apparent emente sani, ch e avevano vissuto in un ambiente dove c'erano stati casi di epatite virale. Ad ogni modo quest e nostr e ricerche culturali, anche se incoraggianti, sono incomplete e non possono essere assolutamente considerate probative . Esse debbono esser e proseguite perchè solo un risultato sicuramente positivo in questo campo ci potrebbe aprire la strada allo studio delle caratteristich e biologich e del virus, primo passo verso ricerche indirizzate a trovar e armi terapeutiche e profilattich e contro una malattia la cui importanza pratica va di giorno in giorno aumentando. E sprimiamo la nostra più viva riconoscenza alla Prof. D. Steve Bocciarelli per i consigli datici n el corso delle nostre ricer che. Riassunto. - Le lesioni submicroscopiche della cellula epatica in corso di epatite virale consistono in un rigonfiamento dei mitocondri ed in una frammentazione e diminuzione delle loro cristae, in una dilatazione dei canalicoli del reticolo citoplasmatico, in una ipertrofia dei lisosomi contenenti pigmenti lipidici ed in un forte aumento d el numero dei ribosomi, che inv adono alcune zone citoplasmatiche disponendosi su più file parallele. Nel citoplasma delle cellule infette ven gono descritti ammassi di granuli di 200 A di diametro, racchiusi in sacculi ovalari circondati da una membrana semplice. Gli AA. ritengono ch e questi granuli possano corrispondere all'agent e dell'epatite virale. Vengono descritti i risultati di prove di immunoflu orescenza e dei primi t entativi di cultura del presunto virus su cellule . Summary. - The most evident lesions of the human epit h elial liver celi, in viral hepatitis, consist in an enlargem ent of the canalicula of the endoplasmic r eticulum and in an increase of the size and, perhaps, of the number of the mitochondria, which contain only some scarce and fragmented << cristae ». Characterist ic of the liver celi in the coursc of virai hepatitis is also the large amount of ribosomes, which constitute many clust ers or ar e ordered in more parallel lines, v.ith a r egular interval b etween th e granules. In roany patients the AA. have observed some cytoplasmatic u saccula », bordered by a simple m embran<', containing round virus-like particles, 'vit h a diamet er of about 200 A. These u saccula >> correspond, in size and aspect , to some Buorescent areas observed after treatment of human infect ed liver cells with y-globulins of convalescents from virai h epatitis, conjugated with fluorescei.n isothiocyanate. The AA. h clieve that t h ese hodics could corrcspond to the agent of the human virai h epatitis. Ann. I st. Supe1·. Sanità (1965) 1, 478 -4 86. RAPPORTI DEI GRUPPI DI RICERCA 486 BIBLIOGRAFIA 1 ( ) (2) { 8) (') (&) ( 6) (1) ( 8) (t) (10) ( 11 ) ( 12) (1 3) (14 ) ( 16) (16) RIGHTSEL, W. A., R . A. KELTSCB, F. M. T:EKUSHAN e l. W. Mc LEAN, Jr. - Science, 124, 226 (1956). RIGHTSEL, W. A., R. A. KELTSCB, A. R. TAYLOR, J. D. Boc;c;s e l. W. Mc LEAN, Jr. J. A m. Med. Assoc., t77, 671 (1961). TAYLOR, A. R., W. A. RIGHTSEL, R. A. KELTSCH e M. I·I. ]ONES. - J. Appl. 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SPIEGAZIONE DELLE FIGURE l. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9, 12. 13. 14. 15. 16. Rigonfiamento d ei canalicoli del reticolo citoplasmat ico. lpertrofìa dei mitoeondri e frammentazione delle a eristae ». - Rigonfiamento dei mitocondri e frammentazione delle « cristae ». - Inclusioni citoplasmatiche costituite presumihilmente da lipidi. - Lisosomi alterati contenenti pigmento. - Fenomeni di autolisi di porzioni citoplasmatiche stipate di ribosomi. - Vacuolo da citolisi contenente un mitocondrio. - Aumento numerico dei ribos01ni e loro disposizione in file parallele. - Formazioni pseudovirali. 10, Il. - Sacculi contenenti elementi virus-simili. - Possibile stadio iniziale di un sacculo in una cellula di natura istiocitaria. - Sacculi contenenti elementi virus-simili. - Virus dell'epatite dell'anatra [ da Richter et al. (15) ]. - Striscio di puntato epatico di paziente 1.300 x. Fissazione con acetone. - Sezione di puntato epatico di paziente 1.300 x. Fissazione con Bouin. L e Figg. 1-13 riguardano cellule epatiche di pazienti affetti da epatite virale (complessivamente 8 soggetti). Le sezioni di cui alle Figg. l , 2, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13 sono state colorate con Karnowski. I preparati delle Figg. 15 e 16 sono stati trattati con y-globuline coniugate con isotiocianato di fluoresceina, colorate per contrasto con Evans blu. Si notino le piccole aree circolari di fluorescenza, probabilmente corrispondenti ai « sacculi ». A nn. I st. Super. S anità. (1965) 1, ~78·486 . E PA TIT.F; VIRALE ]r. • Science, 124, ~- Mc LEAN, Jr.. ). Appl. Physiol., •gy, 24, 109 (1964). 1.). lin. Wochschr., 36, 3'13 (1962). iniirmed., 16, 375 :). t). F ig. L a dei mitocondri ti. le. it aria. one. n. al e (complessiva: con K arnowski. con isotiocianato iccole ar ee circo- F ig. 2. 1965) f , .7 8·486. Ann. I st. Super. Sanità. (1965) f , 478-486. € PATITE VlllALE F ig. 3. Fig. 4. Ann. I st . Super . Snni llì ( 1965 ) 1, 47 8-•l s r,. EPATIT E V IRAI.~. F ig. 5. F ig. 6. Ann. Ist. Super. Sanità (1965) t , 47 8·486. EPATITE V IRALE Fig. 7. "Jn n . f s/. Super . Sanità (1965) t , 4 78-4RG. E PATI TE V I RALE F ig. 8. Fig. 9. . lnn. 1st. Sllpcr. Sanità ( l !HI;;) 1, 478·~ 86. E P ATITE VIII A I.E Fig. I O. Fig. Il. Ann. ! st. Su71er. Sanilù. ( l%;;) t , 478·486. EPA T ITE VIRALE Fig. 12. .tJnn. Isl. Super. Sanità (1965) 1, 478·486 . EPAT 11'E V IRALE Fig. 13. Fig. 14. Ann. 1st. Super. Sanità ( 1965) 1, 47 8·48 G. EPATITE VIR A J, I" Fi g . 15. Fig. 16. • 11111. / $/. :Sttpet. Sanittl ( l9G:i) 1. 17 · I ~G