Metodi alternativi, cura e benessere degli animali da laboratorio

Evento informativo sulla
sperimentazione animale
Milano, 6 novembre 2015
Aula IZS – Via Celoria 12 - Milano
Dr. G. Lombardi
Centro di Referenza Nazionale
per i metodi alternativi, cura e benessere degli animali da
laboratorio (CRI3R)
06/11/15
Centro di Referenza Nazionale
per i metodi alternativi, cura e benessere degli
animali da laboratorio (CRI3R)
Dir 63/2010
Dlgs 26/42
Art. 47
Art. 37
06/11/15
Il Centro di Referenza

Riconosciuto il 20 Aprile 2011 (Decreto Ministeriale, G.U. n° 143)
nell’ZSLER

Centro di Referenza Nazionale per le Colture Cellulari

Centro di Referenza Nazionale per il Benessere Animale
Settori strategici

Metodi Alternativi
Cura e Benessere
Animali da Laboratorio

Ruolo cardine: coordinamento delle attività relative allo sviluppo di
Metodi Alternativi, promozione e divulgazione
3
Generalità
 Centro di Referenza : riconosciuto 20.04.2011 Ministero della Salute
Art. 1. Il Centro di cui al comma 1 svolge, in via prioritaria:
 a) progettazione e sviluppo di metodi alternativi alla sperimentazione animale;
 b) stesura e validazione di specifici metodi di prova;
 c) verifica della attendibilità e riproducibilità mediante analisi comparative ed in prove interlaboratorio dei metodi di prova;
 d) allestimento di standard di riferimento quali controlli positivi e negativi;
 e) attività di formazione nelle materie di specifica competenza;
 f) supporto tecnico scientifico co nelle materie di specifica competenza al Ministero della
Salute
 Principale ambito applicativo: settore biomedico
Formazione
 Organizzazione di corsi ed eventi finalizzati
- ad una diffusione delle conoscenze
- a definire lo stato dell’arte sulla tematica dei Metodi Alternativi
- a valutare le possibili metodologie tradizionali ed innovative quali potenziali
nuove strategie di laboratorio
- ad ampliare le conoscenze con le Istituzioni pubbliche e private nell’ottica
dello sviluppo di nuove sinergie
- ad una maggiore conoscenza delle esigenze del territorio
 Corsi mirati a Metodiche Alternative (teorici e pratici)
 Corsi sul monitoraggio sanitario degli animali utilizzati nella
sperimentazione
Attività di laboratorio
 Applicazione di metodi già validati (ECVAM)
 Test di trasformazione (operativo)
 Interesse volto alla determinazione della genotossicità: test del
micronucleo, saggio COMET, test di Ames (pannello suggerito
da ECVAM)
 Comparazione del test di citotossicità in vitro con l’esito nel
sistema in vivo “zebra fish”
Linee di ricerca
Principalmente
 CSM: caratteristiche biologiche e potenziali applicazione
terapeutiche (differenziamento, migrazione: test in vitro)
 Evoluzione oncogena di CSM indotta da nanoparticelle
 Modelli 3D in dinamico con cellule di tipo epatico e di tipo statico
con cellule limbali e CSM per la rigenerazione di lesioni oculari
Cura e benessere degli animali da
laboratorio
Attivazione di un servizio diagnostico per gli animali da
laboratorio




Roditori da laboratorio
Agenti virali e batterici
Reazioni sierologiche
Reazioni di biologia molecolare
Promozione e Attivazione di corsi di formazione per il personale
addetto agli impianti di allevamento e di utilizzazione di
animali da laboratorio
Monitoraggio sanitario animali da
laboratorio
Esigenza di disporre di metodologie diagnostiche
specifiche
 Specie: roditori, principalmente topi e ratti
 Agenti patogeni di interesse: agenti virali, batterici e, nel
futuro, parassiti
 Sviluppo di un pacchetto diagnostico basato su differenti
metodologie: biologia molecolare, indagini virologiche,
indagini sierologiche
 Servizio del Centro in graduale implementazione (sito
web)

9
Coinvologimento internazionale
10




Punto di contatto in Europa per i Metodi Alternativi
(Ministero della Salute)
Membro della rete Europea «Preliminary Assessment
of Regulatory Relevance - PARERE» (EUR ECVAM)
Membro della rete Europea per la Validazione di
Nuovi Metodi Alternativi (NETVAL) (sistema qualità)
Componente del gruppo di lavoro permanente del
Consiglio Superiore di Sanità (valutazione di progetti
su primati non umani, cani e gatti)
Obiettivi del Centro di Referenza




Supporto nella standardizzazione di nuove tecnologie che possono
essere oggetto di commercializzazione e di attività diagnostiche
routinarie
Valutazione delle aree in cui è particolarmente elevato l’impiego
degli animali (malattie neurologiche, prodotti farmaceutici e presidi
immunizzanti, tossicologia, malattie croniche e oncologiche )
Promuovere la ricerca con uso di animali verso una sempre
maggiore attenzione al principio delle 3R
Raccolta e condivisione di procedure e linee guida relative al
benessere degli animali
11
Obiettivi di network



Creare sinergie fra Enti di Ricerca e Industria per lo sviluppo di nuove
tecnologie, scambio di dati e informazioni: attiva interazione multidisciplinare
Formazione ad ampio spettro per l’implementazione delle attività in
accordo alle 3R
Collaborazione nello sviluppo di sinergie con le autorità regolatorie per
una armonizzazione globale delle norme vigenti
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Database degli impianti e questionario
Conoscere le realtà nazionali, pubbliche e private
coinvolte in metodi in vitro ed in vivo
 Settore applicativo, metodologie adottate, sperimentazioni
svolte, disponibilità di stabulari e specie coinvolte,
innovazioni tecnologiche, pubblicazioni scientifiche,
associazione a Società Scientifiche, sistema qualità…
 Graduale implementazione ed aggiornamento periodico
 Gruppo di coordinamento: colleghi coinvolti in diversi
settori e appartenenti ad Enti pubblici e privati

Finalità:

Coinvolgimento in attività finalizzate allo sviluppo /
standardizzazione, validazione nazionale di Metodi
Alternativi
13
Settori applicativi
Tossicità d’organo
Citossicità di nanoparticelle
Metabolismo in vitro
Controllo tossicità anormale residua
Tossicità sistemica
Identificazione rapida presenza clostridi
tossigeni e limitazione utilizzo animali da
laboratorio
Cardio-tossicità (validazione di test di
attività di sostanze)
Classificazione e potenza degli allergeni
chimici
DL50 su embrione di pesce
Rendere più oggettivo, rapido e affidabile
il saggio in vitro esistente
Neuro-tossicità, neuro-sviluppo; tossicità
cutanea
Irritazione e corrosione cutanea
Vari end points tossicologici (irritazione
cutanea e oculare, cangerogenesi,
tossicità ripetuta, tossicità sullo sviluppo)
Classificazione di allergeni
Assobimento di sostanze in nanoforma
Tracciare il profilo di geni riconoscibili e
ripetuti
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Biobanca IZSLER e rete nazionale
biobanche veterinarie (www.ibvr.org)
 Raccolta e deposito di risorse biologiche: diversificate: standard
di riferimento
 Attualmente n° 20 tipologie di risorse biologiche
 Elevati criteri qualitativi
 Certificazione ISO 90012008
 Riconoscimenti:
 Office International des Epizooties (OIE) (Collaborating Centre,
2014)
 Biobanking and Biomolecular Resources Research Infrastructure
(BBMRI) (National and European level)
 Trattato di budapest (deposito per brevetti)
Deposito di risorse biologiche da
ricerche con animali
Risorse biologiche
diversificate (17 tipi): tessuti,
organi di animali sottoposti a
sperimentazioni
 Condivisione come da
Direttiva Europea (art. 27)
 Possibili collaborazioni /
convenzioni con le Istituzioni;
rispetto del principio delle 3R

16
Rete Nazionale
delle biobanche veterinarie:
IZS delle Venezie
IZS Piemonte, Liguria e Valle D’Aosta
IZS Abruzzo e Molise
IZS della Sicilia (Palermo)
National, OIE Reference Centres: Avian influenza and
Newcastle Disease (Padova)
National Reference Centre: Animal encephalopathies
(TSE) (Torino)
National Reference Centre: veterinary oncology
(Genova)
National, OIE Reference Centre: Blue tongue infection
(Teramo)
National, OIE Reference Centres: infections from
parasites (Palermo): ticks, Leishmaniasis, Toxoplasma,
Anisakiasis
Nel prossimo futuro...
Incentivare il principio delle 3R relativamente all’impiego degli
animali nella ricerca e nel servizio diagnostico
 Sviluppo di metodi scientificamente «validi» alternativi
all’ospite vivente
 Promuovere linee di ricerca per lo sviluppo di tecnologie
innovative: tecniche di immagine, ricorso a specie di
invertebrati ed ittiche (zebra fish), organ- on-the chip
 Promuovere l’armonizzazione delle procedure delle 3R a livello
regolatorio per prodotti chimici e farmaceutici
 Operare in stretta sinergia con Centri di Riferimento di altri
Paesi

18
Principi delle 3R e metodi alternativi
Dr. G.Lombardi - CRI3R
Percorso





Dalla normativa alla pratica
Strategia delle 3R
Metodi aleternativi disponibili
Autorità e validazione dei metodi
Metodi alternativi in rete
Metodi alternativi
Dir. 63/2010 UE
 Raccomandazioni nei consideranda
(11,12)
 Uso obbligatorio (art.4, art.13)
 Oggetto di consulenze dell'OPBA (art.27)
 Promozione degli approcci (capo V)
Art. 4.1. Gli Stati membri assicurano che, ove possibile, un metodo o una strategia di
sperimentazione scientificamente soddisfacente che non comporti l’uso di animali vivi
possa essere utilizzato in sostituzione di una procedura
Art.13.1 ...gli Stati membri assicurano che una procedura non sia eseguita qualora la
legislazione dell’Unione riconosca altri metodi o strategie di sperimentazione per
ottenere il risultato ricercato che non prevedano l’impiego di animali vivi.
Metodi alternativi
Dlgs 26/2014
 Divieto espresso di utilizzo animali (art. 1
comma 2)
 Valutazione obbligatoria da parte
dell'OPBA (art.26)
 Promozione degli approcci alternativi
Art.1.2. È consentito l’utilizzo degli animali ai fini scientifici o educativi
soltanto quando, per ottenere il risultato ricercato, non sia possibile utilizzare
altro metodo o una strategia di sperimentazione scientificamente valida,
ragionevolmente e praticamente applicabile che non implichi l’impiego di
animali vivi
Art 26.2. Ai fini del rilascio del parere di cui al comma 1, lettera d) ,
l’organismo preposto al benessere degli animali valuta:..
d) la possibilità di sostituire una o più procedure con metodi alternativi di cui
all’articolo 1, comma 2;
“Alternative”
 Approcci: linee di ricerca e di indagine
 Metodi: procedure effettive validate o
meno
 Alternativo e basta, cioè diverso per
scelta
Strategia delle R
1959, Russell e Burch, “The Principles of Humane
Experimental Technique.”
Un'alternativa a un esperimento animale è
qualsiasi procedura - vale a dire, qualsiasi metodo
o tecnica, proposta o approccio - che è destinata
a sostituire un particolare procedura scientifica
che può ledere gli interessi degli animali, o ridurre
il numero di animali utilizzati, o perfezionare il
procedimento in modo tale che sia ottimizzato il
benessere degli animali nella procedura stessa o
nel suo contesto.
Sostituzione
Sostituzione degli animali nella
ricerca e nell'insegnamento, spesso
interpretata come sostituzione totale
della sperimentazione sugli animali,
fa riferimento alla sostituzione degli
animali con metodi che usano
materiale
insensibile
o
con
organismi minimamente senzienti
(Relative replacement)
Sostituzione
 Analisi critica dei dati esistenti, al fine di determinare se
esperimenti sono davvero necessari.
 Modelli matematici e informatici nel campo della ricerca.
 Gli audiovisivi e modelli fisici nell'insegnamento.
 L'uso di preparazioni di cellule umane.
 L'uso di sistemi in vitro basati su tessuti animali o cellule.
 L'uso della Toxicogenomica - di "gene chip” nei test di
tossicità
 L'uso di organismi minimamente senzienti
(microrganismi, invertebrati, piante, embrionali o forme
larvali)
Riduzione
Lo scopo della 'riduzione' è
quello di usare il minor
numero possibile di animali
per ottenere le informazioni
richieste, tuttavia questo non
deve andare a scapito di una
maggiore
sofferenza
a
qualsiasi singolo animale
Riduzione
 Eliminazione di inutili ripetizioni degli esperimenti.
 Validità statistica del numero di animali. Il numero
degli animali deve essere né scarso, né eccessivo.
 La condivisione di animali e tessuti animali.
 Uso delle specie adeguata, ceppo e sesso degli
animali.
 Progettazione di esperimenti in modo che gli animali
agiscono come i propri controlli.
Affinamento, perfezionamento
L'Affinamento (perfezionamento)
fa riferimento all'adozione di
strategie per eliminare o ridurre
il dolore e la sofferenza degli
animali utilizzati nella ricerca e
nell'insegnamento.
Affinamento, perfezionamento
 Adozione dei minimi possibili tempi di sopravvivenza
dopo l'induzione di malattie o stati dolorosi
 Monitoraggio dello stato di salute degli animali e
l'adozione di endpoint
 Modifica delle tecniche in modo che le condizioni
dolorose o stressanti sono minimizzate
 L'uso di analgesici, ove possibile
 Garantire ad ogni specie le esigenze comportamentali
specifiche: un alloggio adeguato, habitat collettivo in
specie sociale, e ambienti arricchiti.
Metodi alternativi disponibili
 Metodi alternativi in tossicologia
 Metodi alternativi per biologici
 Strategie e approcci per il futuro
Tossicologia
 Tossicologia topica
 Tossicologia sistemica
Tossicità Topica
Irritazione Cutanea e Corrosione:
Epidermide Umana Ricostruita con cheratinociti
umani, test con biomembrane per alcuni prodotti,
resistenza elettrica transcutanea su cute ex vivo
Irritazione Oculare
Fototossicità: metodi che utilizzano una linea
cellulare di fibroblasti murini (3T3) o linee cellulari
umane su modelli 3D
Sensibilizzazione Cutanea
Tossicità Topica
Irritazione Oculare:
1.Modelli organotipici basati su cornea o occhio
isolato, ex vivo
2.Modelli organotipici basati sulla membrana corionallantoidea dell’ uovo di pollo
3.Modelli su RhE, tessuti umani ricostruiti
4.Cell-based assays: Fluorescein Leakage (FL)
l’unico accettato a livello regolatorio
5.Saggi in chemico, basati su effetti fisico-chimici e
sistemi acellulari
6.Strategie integrate di metodi alternativi che
prevedono anche l’approccio il top down/bottom up e
Tossicità Topica
Irritazione Cutanea e Corrosione:
Epidermide Umana Ricostruita con cheratinociti
umani, test con biomembrane per alcuni prodotti,
resistenza elettrica transcutanea su cute ex vivo
Irritazione Oculare
Fototossicità: metodi che utilizzano una linea
cellulare di fibroblasti murini (3T3) o linee cellulari
umane su modelli 3D
Sensibilizzazione Cutanea
Sensibilizzazione cutanea
 Evento immunologico complesso in due
fasi: sensibilizzazione e attivazione
 Metodi refinement e reduction in vivo
 Metodi con strategia integrata (ITS)
Tossicità sistemica
Tossicità acuta sistemica o la tossicità dose
ripetuta, come anche la tossicocinetica valutazione dell’Assorbimento, Distribuzione,
Metabolismo ed Escrezione (ADME) - sono in via di
sviluppo,
Genotossicità e Mutagenicità
Cancerogenesi
Tossicologia Riproduttiva
Genotossicità e Mutagenicità
endpoint di mutazione genica
aberrazione cromosomica strutturale,
aberrazione cromosomica numerica
si richiede una batteria di test in vitro (test del
micronucleo, test di Ames) seguita a volte da test in
vivo (chromosome aberration test), a seconda delle
esigenze regolatorie. Modelli in silico
Tossicità sistemica
Tossicità acuta sistemica o la tossicità dose
ripetuta, come anche la tossicocinetica valutazione dell’Assorbimento, Distribuzione,
Metabolismo ed Escrezione (ADME) - sono in via di
sviluppo,
Genotossicità e Mutagenicità
Cancerogenesi
Tossicologia Riproduttiva
Tossicologia riproduttiva
 il Micromass assay, per la valutazione di sostanze
altamente embriotossiche,
 l’ Embryonic Stem Cell Test (EST), 3 endpoint:
inibizione del differenziamento in cardiomiociti e
citotossicità valutata su cellule staminali e
fibroblasti 3T3.
 il Whole Embryo Culture (WEC),
EST e WEC possono essere impiegati per classificare
le sostanze in altamente/ moderatamente e non
embriotossiche
Metodi alternativi per biologici
 Vaccini : sicurezza, efficacia, purezza,
effetto della presenza di adiuvanti
 Valutazione pirogenicità
Test di pirogenicità
 Valutazione della presenza di endotossine, sul coniglio
(rabbit pyrogen test), si basa sul monitoraggio della
temperatura corporea del soggetto dopo l’iniezione del
composto.
 Alternativa in vitro è il LAL test, sfrutta la reazione
dell’emolinfa del Limulus polyphemus. La quantificazione
è possibile mediante la comparazione con un reagente
pirogeno di riferimento. Il LAL test è più sensibile di
almeno 100 volte rispetto al rabbit pyrogen test, LAL test è
altamente riproducibile ed affidabile
 Monociti di sangue periferico di coniglio dopo
stimolazione con prostaglandine E2 (PGE2)
Vaccini
 Potency test: minima dose antigenica in
grado di evidenziare un effetto protettivo
statisticamente e clinicamente significativo
– Titolazione del prodotto (vivo, inattivato)
– Misurazione dell'effetto (scelta dell'effetto,
end point)
– Metodi vari: Colture batteriche, colture
cellulari, sierologia, refinement con end
point
Strategie future per i biologici
 Miglioramento delle metodiche, altre
tecnologie
 Standardizzazione e produzione di standard
 Armonizzazione delle legislazioni (richiesta
di test, accettabilità dei test e delle prove
eseguite)
Metodi alternativi
Metodo
Cos'è?
Per cosa si usa?
Limiti
Studi di
Imaging
Una vasta gamma di
tecnologie per vedere
all'interno del corpo,
tra cui la risonanza
magnetica (MRI),
MRI funzionale
(fMRI), la tomografia
ad emissione di
positroni (PET), e
tomografia
computerizzata a
emissione di fotoni
(SPECT)
Osservare gli effetti
dei farmaci nel
corpo, studiare la
struttura e la
funzione del
cervello, studio
delle malattie del
cervello e di altri
disturbi neurologici
Non può rivelare tutti
gli effetti del
medicinale sull'intero
oganismo; si basa su
dati di
sperimentazione
animale.
Digital Imaging system (photo camera)
Pharmacological tests and
tumorigenic tests
Metodi alternativi
Metodo
Cos'è?
Per cosa si usa?
Limiti
Microdosaggi
Questo metodo
consente a volontari
umani di sostituire in
modo sicuro gli animali,
in alcuni test su
medicinali. Consiste nel
somministrare a esseri
umani dosi di un
farmaco abbastanza
alte da causare effetti
cellulari, ma troppo
basse per interessare
l'intero organismo
Test su farmaci
Considerato solo per la
fase 0 del trial clinico di un
farmaco, la fase più
precoce; la
sperimentazione animale
con l'intera dose di un
farmaco è necessaria per
determinare la sua
sicurezza ed efficacia e
per l'approvazione di un
medicinale.
Metodi alternativi
Metodo
Cos'è?
Per cosa si usa?
Limiti
In vitro
Cellule o campioni di
tessuto prelevati da
animali o esseri umani
e preparati per studio di
laboratorio
Ricerca sui
farmaci,
sperimentazione
di nuovi prodotti
per la cute
umana, test
tossicologici
Le tecniche in vitro si
concentrano sul livello
cellulare e quindi non
possono sostituire i test
sull'intero organismo; la
sicurezza e l'efficacia dei
farmaci richiedono test su
animali.
Test con
chip
microfludici
I Chip microfluidici
contengono campioni di
tessuto provenienti da
diverse parti del corpo
che sono legati da
microcanali attraverso i
quali scorre un
sostituto del sangue,
imitando percorsi e
processi del corpo.
Questo metodo di prova
fornisce informazioni
più complesse dei test
in vitro.
Lo studio dei
processi biologici
e di malattia, il
metabolismo dei
farmaci
Fornisce meno informazioni
rispetto al test sull'intero
organismo;la sicurezza e
l'efficacia dei farmaci
richiedono test su animali.
Uso dei computer
 Progettazione di farmaci e valutazione delle possibili varianti
tossiche di un prodotto
 Screening di prodotti in silico e quindi prove su animali
 Software noto come Computer Aided Drug Design (CADD) viene
usato per predire il recettore sito di legame per una potenziale
molecola
 Structure Activity Relationship (SARs), un altro software basato
sulla presenza di porzioni chimiche del composto progenitore
 Quantitative Structure Activity Relationship (QSAR) descrizione
matematica del rapporto tra proprietà fisico-chimiche di una
molecola e la sua attività biologica)
 Software interattivi di approccio ai problemi, - Computer assisted
learning (CAL)
Animali alternativi
Alternatives to animal testing: A review
Sonali K. Doke, Shashikant C. Dhawale
Breeding zebrafish and embryo test
Autorità regolatorie
 USA, Agenzia Federale permanente,
Interagency Coordinating Committee on the
Validation of Alternative Methods (ICCVAM)
 UE, Laboratorio di Referenza Europeo per i
Test Alternativi agli Animali (EURL-ECVAM)
 in Giappone è stato istituito il Japanase
Center for Validation of Alternative Methods
(JaCVAM).
Dir. 63/2010
 Direttiva Europea 63/2010 ha focalizzato molto l’attenzione sui
metodi alternativi, con particolare attenzione alla diffusione e
sviluppo delle metodiche in vitro in sostituzione all’utilizzo
degli animali.
 Costituzione a livello nazionale di Centri di Referenza
(Contact Point) a cui EURL-ECVAM possa fare riferimento.
 In Italia, è stato istituito il Centro di Referenza Nazionale per i
Metodi Alternativi, Benessere e Cura degli Animali da
Laboratorio(CRI3R), che ha sede presso L’Istituto
Zooprofilattico della Lombardia e dell’Emilia Romagna
(Brescia). Il Centro si prefigge di favorire la diffusione e la
formazione inerente i metodi alternativi.
Validazione dei metodi e sue
problematiche
 Tempi lunghi
 Qualità dei laboratori per la messa a
punto
 Qualità dei laboratori per i test
L.Gribaudo
Processo di validazione
Metodi alternativi in rete






Unione Europea e suoi centri
Università di tutto il mondo
Centri di riferimento nazionali
Imprese e aziende del settore
Progetti di ricerca europei
Riviste e pubblicaizoni internazionali
http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/3r/alternative_en.ht
m
www.3RGuide.info
https://awic.nal.usda.gov
/
http://alttox.org/mapp/table-of-validated-and-accepted-alternativemethods/
Principi delle 3R e metodi alternativi
Grazie
Dr. G.Lombardi - CRI3R