Valutazione e monitoraggio dello stato sanitario
e del benessere degli allevamenti mediante
l'applicazione di metodiche biomolecolari sul
latte di massa
Prof. Marco Pittau
Dipartimento di Medicina
Veterinaria
Sassari
Selezione pubblica per il reclutamento di ricercatori a tempo determinato finanziati
dalla Regione Sardegna, ai sensi della L.R. 3/2008
(RIENTRO CERVELLI)
Titolo del Progetto di Ricerca
Implementazione di metodiche diagnostiche biomolecolari per la
valutazione dello stato sanitario degli allevamenti ovi-caprini e bovini in
relazione a patologie ad alto impatto socio-economico
Area Scientifico - Disciplinare
Area della ricerca sanitaria sull’innovazione nell’assistenza e sul trasferimento
dei risultati della ricerca scientifica nella pratica clinica
Settori scientifico-disciplinari interessati nel Progetto di Ricerca
Vet/05: Malattie Infettive degli Animali Domestici
Coordinatore Scientifico: dott.ssa Tania Carta
Obiettivi generali, specifici e operativi
1.
Obiettivi
Allestimento, standardizzazione e validazione di metodiche biomolecolari
altamente sensibili che permettano, attraverso un singolo campione di latte
prelevato dal pool dell’intero allevamento (latte massale), l’identificazione degli
agenti eziologici di alcune patologie diffuse in Sardegna e difficilmente
rilevabili attraverso le classiche analisi batteriologiche;
2. Trasferimento delle conoscenze acquisite presso i laboratori A.R.A.S.
attraverso la realizzazione di protocolli dettagliati delle metodiche di
laboratorio e di tutte le informazioni necessarie per rendere le procedure
diagnostiche applicabili su larga scala;
3. Organizzazione e analisi epidemiologica dei dati raccolti in riferimento ai
differenti parametri (agenti eziologici, tipologia e caratteristiche degli
allevamenti, dimensioni, collocazione geografica, ecc.);
4. Realizzazione di protocolli operativi atti a ridurre, negli allevamenti, la
prevalenza delle infezioni determinate dai microrganismi oggetto dello studio.
Obiettivi generali, specifici e operativi
Obiettivi
Realizzazione, standardizzazione e validazione di nuove metodiche
biomolecolari, per l’identificazione di alcuni microrganismi presenti nel
latte e non rilevati attraverso le indagini batteriologiche di routine
•
•
•
•
Mycobacterium avium paratuberculosis
Mycoplasma agalactiae
Small Ruminant Lentivirus (SRLV)
Jaagsiekte Sheep Retrovirus (JSRV)
Conteggio cellule
Infezione
si/no
Ricerca
microrganismi
Poche specie
batteriche e nessun
virus
Non esistono al momento informazioni esaustive sulle caratteristiche
epidemiologiche delle patologie oggetto di studio nel territorio della Sardegna
Sensibilità dell’analisi batteriologica
Quantità dei microrganismi presenti nel campione
La percentuale dei capi infetti e la frequenza replicativa dei patogeni
condizionano l’attendibilità della prova
Micobatteri e micoplasmi sarebbero difficilmente isolabili dal pool di latte
dell’intera azienda
La ricerca di questi batteri è di primaria
importanza sia per consentire interventi
profilattici atti a contenere le patologie negli
animali, sia e soprattutto per identificare quegli
allevamenti dove la presenza di agenti zoonotici
possa rappresentare un serio pericolo per la
salute umana
Mycobacterium avium paratuberculosis (MAP)
Obiettivi
La paratuberculosi (PTBC) o malattia di Johne, è una malattia infettiva
cronica causata da Mycobacterium avium paratuberculosis (MAP)
Lluis Luján, Univ. Saragozza
Lluis Luján, Univ. Saragozza
La malattia è caratterizzata da una enterite cronica i cui sintomi
sono:diarrea, perdita di peso e dimagramento progressivo
Primi sintomi compaiono solitamente in animali di ~2-5 anni di età
•
•
Diminuzione della produzione lattea, ipofertilità, anemia, febbre
intermittente ed edema intermandibolare
Negli stadi più avanzati della malattia è costante la comparsa di diarrea,
talvolta profusa, cronica o intermittente, con periodi di remissione anche di
alcune settimane o mesi
Patogénesis
Mycobacterium avium paratuberculosis (MAP)
Revisión bibliográfíca
Obiettivi
Caratterizzata da un lungo periodo d’incubazione durante il quale si osserva la
trasmissione dei micobatteri paratubercolari attraverso il latte
Istopatologicamente si tratta di una enterite granulomatosa e linfoadenite,
particolarmente a livello del digiuno, ileo e linfonodi mesenterici associati¹
Meneguz
Lluis Luján, Univ. Saragozza
Meneguz
Lluis Luján, Univ. Saragozza
Lluis Luján, Univ. Saragozza
Lluis Luján, Univ. Saragozza
Negli USA i produttori hanno perdite annuali di circa 1,5 bilioni di euro
Il microrganismo sembra essere coinvolto nella eziologia di alcune gravi
patologie dell’uomo quali il morbo di Crohn e, a seguito di recenti ricerche, il
diabete mellito tipo 1², la sarcoidosi³ e la sclerosi multipla4
1. Balseiro et al. 2008 2. Dow et al., 2006; Sechi et al., 2007a, b, 2008 3. el Zaatari et al., 1996, 2008 4. ; Sechi et al.,
2011
Mycoplasma agalactiae
Obiettivi
Agente eziologico dell’agalassia contagiosa, malattia infettiva
altamente contagiosa caratterizzata da lesioni mammarie, articolari e
oculari
Rappresenta uno dei maggiori problemi
per l'economia rurale di molti paesi che
si affacciano sul bacino mediterraneo dove la pastorizia rappresenta la
principale risorsa economica nel settore zootecnico
Considerata seconda soltanto alla Brucellosi per le sue gravi ripercussioni
sanitarie ed economiche
Particolarmente colpite sono le femmine dopo il parto ma anche nei giovani
animali può manifestarsi in maniera cronica. La principale fonte di infezione è
rappresentata dal latte infetto proveniente da pecore malate o portatrici.
Sono ricettivi ovini e caprini
1. Carter & Chengappa, 1991
Mycoplasma agalactiae
3-4 gg
Obiettivi
Prove biochimiche
4-8 gg
Data la rapidità della diffusione dell'infezione in un gregge (se in lattazione) è
importante applicare delle procedure diagnostiche sensibili e rapide
ü
ü
La trasmissione avviene principalmente x via intracanicolare mammaria (mungitura)
L'agente patogeno è presente nel latte e in secrezioni di varia natura (liquido lacrimale)
Ancora non esistono degli strumenti di tipo profilattico e/o terapeutico in grado
di riuscire ad eliminare con certezza la patologia
A causa dei notevoli danni economici in numerosi Paesi sono in atto piani di
eradicazione e di controllo.
Small Ruminant Lentivirus (SRLV)
Obiettivi
Lentivirus
Maedi-Visna (MV)
Artrite encefalite virale (CAE)
L’infezione è caratterizzata da un lungo periodo d’incubazione, evoluzione lenta
e progressiva, esito invariabilmente letale
Gli animali sierologicamente positivi si
considerano permanentemente infetti a
causa dell’integrazione del genoma virale
nel DNA delle cellule bersaglio
Maedi Visna
Obiettivi
La trasmissione preclinica (da animali asintomatici) avviene per via orale,
attraverso il colostro e il latte, o per via iatrogena, attraverso l'impiego di aghi,
siringhe o altro materiale infetto
Nelle fasi iniziali dell’infezione, il virus si trova nel sangue associato ai monociti,
in uno stato di latenza
Con la maturazione dei monociti in macrofagi a
livello degli organi bersaglio, il virus è poi capace di riattivarsi
Polmonite interstiziale progressiva
(Maedi)
•
•
•
•
•
Graduale scadimento condizioni generali
Dispnea e tosse secca senza febbre e
scolo nasale
Polmonite interstiziale progressiva
Aborto, mastite interstiziale e artriti
Decorso 3-6 mesi ad esito mortale
Leucoencefalomielite (Visna)
•
•
•
•
•
Encefalite demielizzante
Portamento anormale di testa, tremori
e paralisi degli arti posteriori
Impossibilità a mantenere la stazione
quadrupedale
Rapido decadimento dello stato
generale
Esito letale
> Effetti collaterali vaccino vivo per la Blue Tongue/Maedi-Visna
Maedi Visna
Sassari
prevalenza
70% capi controllati
25% allevamenti testati
Obiettivi
L'Artrite-Encefalite caprina (AEC)
FORMA NERVOSA
+ rara
FORMA ARTICOLARE
mastite cronica
Capretti
Individui adulti
Trasmissione: aerogena, venerea, orale, transplacentare, iatrogena
Ø
Ø
§
§
Il secreto mammario (colostro e latte) è la via di trasmissione più frequente
Il latte infetto costituisce la modalità di trasmissione più frequente negli
adulti
Le femmine adulte infatti contraggono il virus per via mammaria
ascendente
Riflusso di latte infetto dalla mungitrice alla mammella
Nuoro
prevalenza
20,44% capi controllati
64,16% allevamenti testati
Jaagsiekte Sheep Retrovirus (JSRV)
Obiettivi
Virus a RNA esogeno¹ della famiglia Retroviridae
Retrovirus oncogeno, è l'agente eziologico dell'adenomatosi polmonare degli
ovini (APO), un carcinoma bronchiolo-alveolare contagioso degli ovini, molto
simile alla forma umana (BAC) spesso associato al SRLV
Cellule bersaglio: pneumociti di II tipo
•
•
Trasmissione attraverso le secrezioni bronchiali (molto abbandonanti nei
soggetti con manifestazioni cliniche)
Il genoma virale si ritrova in quantità modeste nel sangue e nel latte
Palmarini et al, 1999
Sorveglianza passiva Sorveglianza attiva
Sospetto di malattia
Veterinario
IZS
possibili scenari
Screening o monitoraggio
in autocontrollo
Definizione del problema
Diagnosi
Piani di controllo/eradicazione
volontari magari incentivati
Sierologia (anticorpi)
Acidi nucleici
(DNA ed RNA)
Acidi nucleici
(DNA ed RNA)
Estrazione automatizzata di DNA ed RNA
mediante biglie magnetiche
Materiali e metodi
Allestimento di metodiche diagnostiche
biomolecolari ad alta specificità e sensibilità
(Real time-PCR)
Real time-PCR
Campioni di RNA estratti
Campioni di DNA estratti
primers utilizzati in PCR
tradizionale
SRLV
JSRV
oppure
primers progettati ad hoc,
e accoppiati a sonde
Taqman
MAG
MAP
< tempi di esecuzione e materiale consumato
> SENSIBILITA’ E SPECIFICITA’
•
Controlli interni per la valutazione della qualità delle estrazioni e l’individuazione di
falsi negativi (beta actina)
Materiali e metodi
Elaborazione di protocolli operativi da applicare nella pratica
clinica degli allevamenti al fine di ridurre la prevalenza delle
infezioni, con l’obiettivo finale tendente all’eradicazione
Elaborazione dei risultati
•
•
•
Elaborazione di protocolli specifici di profilassi e controllo delle patologie rilevate
Valida raccolta di base di dati
ü
lndividuazione e interpretazione delle interazioni dei differenti determinanti epidemiologici
Monitorare l’andamento di queste malattie, allo
scopo di istituire una rete di sorveglianza che
permetta di incrementare l’efficacia dei programmi
di controllo e il valore predittivo dei protocolli da
implementare
Allevamenti ovi-caprini
Allevamenti campionati
Agalassia contagiosa
Schmallenberg
Sierologia Border disease
Virus sequenziati da latte
Chi è il colpevole ?
Chi è il padre ?
Mycoplasma (Agalassia contagiosa)
Mycobatteri (Paratubercolosi)
Lentivirus (Maedi-Visna)
Retrovirus (Adenomatosi polmonare)
Pestivirus (Border disease)
Bunyavirus (Schmallenberg)
BTV (Bluetongue)
Anaplasmi
Etc…
Grazie!
