Diagnostica di
laboratorio nello
studio delle patologie
immunoallergiche
La diagnosi delle patologie
allergiche è basata su:
• Anamnesi ed esame obiettivo
• Test specifici in vivo e in vitro
VALUTAZIONE
ANAMNESTICA
• Predisposizione familiare (atopia) o altre patologie
immunologiche;
• Attività lavorativa
• Abitudini di vita (sport, fumo, ambiente)
• Terapie in atto
• Stagionalità degli eventi allergici e modalità di
insorgenza
Le reazioni di ipersensibilità IgE
mediate determinano diversi tipi
sintomatologie
L’allergia costituisce l’aspetto patologico, che si traduce in
danno,con quadri clinici diversi secondo gli organi
interessati:
•
•
•
•
•
Rino
- congiuntivite
Asma
Orticaria
Allergie intestinali
Shock anafilattico
I TEST UTILIZZATI SONO:
IN VIVO
Test cutanei
PRICK E PATCH TEST
IN VITRO
PRIST o IgE totali
RAST o IgE specifiche
DOSAGGIO IgE TOTALI
Soggetti normali,
IL RISCONTRO DI
ELEVATI LIVELLI DI IgE
TOTALI NON AUTORIZZA
UNA DIAGNOSI DI
ALLERGIA, POICHE’
POSSONO ESSERE
ANCHE PRESENTI IN:
Patologie
Parassitarie
Connettiviti,
Infezioni batteriche
croniche
Malattie
Linfoproliferative
Rischio di allergia e Livelli di IgE
100
Percentuale
di soggetti
80
60
40
20
0
<60
60-200 200-450
>450
% di soggetti sani con un dato valore di IgE sieriche
% di soggetti atopici con un dato valore di IgE sieriche
Sistema di classificazione e cut-off
relativi alla classe di IgE Specifiche
•
Elaborati in base alla curva standard e alla calibrazione, forniti in kU/L
Classe
kU/L
0
<0,35
Assente o non rilevabile
I
0,35-0,69
Basso
II
0,70-3,49
Moderato
III
3,50- 17,49
Elevato
IV
17,5-52,49
Molto elevato
V
52,5-99,99
Molto elevato
VI
>100
Molto elevato
DOSAGGIO MEDIATORI E CITOCHINE
- Mast
cellule
T-LINFOCITI
EOSINOFILI
T
IL-x
EOS
BASOFILO
ISTAMINA
PGs - LTs
ECP
Basophil
PBM
TRIPTASI
CHEMOCHINE
Allergic rhinitis : Diagnosis
(II)
• Blood eosinophil count
• Nasal cytology (nasal smear) : eosinophilia
Fattori
Fattori genetici
Ambientali
(disregolazione del
network citochinico)
Allergeni
infezioni
Ipersensibilità bronchiale
ASMA
Patologia Multifattoriale
Rischio di allergia: Familiarità
50
40
percento
di figli con 30
Atopia
20
10
0
Zero
Uno
Due
Numero di genitori con storia clinica di allergia
Metodi per l’identificazione delle basi
genetiche di una malattia
Effetto
Patologie
monogeniche
Inverosimile
Linkage analysis
Studi di
Associazione
Difficile da
dimostrare
Patologie
multifattoriali
Frequenza
Genetica dell’Atopia
1.
Malattia Poligenica.
2.
Gemelli dizigoti: 15% concordanza
Gemelli monozigoti: 75% concordanza
3.
Studi di Associazione
Localizzazione
5q31-33
16p12
Gene Candidato
Type 2 cytokine cluster
IL-4Rα
α
Patologia Associata
Asma, atopia
Atopia
X
IL-13RA1, IL-13RA2
11q
FcεεRI β
Atopia
STAT6
Atopia
3q25
Bcl6
Atopia
13q14
CysLT2
Atopia
12q13-14
IgE, Asma
Altri studi hanno identificato associazioni positive per CD14, TLR4
Metalloproteinasi ed altri geni ancora….
Polimorfismi funzionali sia delle molecole recettoriali sia dei trasduttori
intacellulari modulano l’effetto delle citochine
IL4R +148 A>G (I50V)(+398 A>G,
I75V)
Allergy
Yes
IL4R +1902 G>T (Q551R)(Q576R)
allergic
asthma
Yes
IL4R +1902 G>T (Q551R)(Q576R)
allergic
asthma
No
{Richter 2004
#2166}
IL4R +1902 G>T (Q551R)(Q576R)
allergic
asthma
Yes
{Risma 2002
#111}
IL4R +1902 G>T (Q551R)(Q576R)
Allergy
Asthma
No
{Tam 2003 #1602}
allergic
rhinitis
IL13 -1111 C>T (-1024, -1112, allergic
-1055)
rhinitis
Yes
{Wang 2003
#666}
{Wang 2003
#666}
IL4 -590 C>T (-589)
Allergy
Yes
IL4 -590 C>T (-589)
allergic
asthma
No
IL13 +2044 (R130Q)
{Liu 2004 #1572}
{Cui 2003 #698}
No
{Liu 2004
#1572}
{Cui 2003
#698}
FcεεRI: Il giocatore chiave
IgE
+++
Kd = 10-10 M
α
γγ
β
P
Lyn
P
P
Syk
PI(3)K
LAT
AA
Btk/Itk
PLA-2
GADS/SLP-76
PLCγγ1
VAV
Ras
PIP3
Ca++
Rab
MAPK
PGD2
LTC4
TNF
IL-4
Modificazioni del
Citoscheletro
Esocitosi
dei granuli
Hasegawa et al.
J. Immunol. 2003, 171: 1927–1933.
Interazioni Gene-gene
Kabesch et al. J Allergy Clin Immunol 2006, 117: 269-274
La Malattia Celiaca: meccanismi fisiopatologici
Enzima transglutaminasi tissutale
(EC 2.3.2.13)
deaminazione della Gliadina
Associata ad antigeni HLA classe II
(DQ2 o DQ8)
Presentata a linfociti T della lamina propria
Stimolo cronico = attivazione immunologica
persistente
Trasformazione mucosale ad opera dei fibroblasti intestinali attivati
(infiltrazione linfocitaria, iperplasia cripte, atrofia villi)
villi
Genetics of Celiac Disease Genetics
of Celiac Disease
10 -- 12% of first degree relatives have celiac disease
Association of celiac disease with HLA
95% of CD possess DQB1* 0201 & DQA1* 0501
20 -- 30% of controls have DQB1* 0201 & DQA1* 0501
5% of CD patients negative for DQB1* 0201 possess DQA1* 0301&
DQB1* 0302
Increased risk of CD with DQB1* 0201 & DQA1* 0501 IS 50 FOLD
Relative risk of CD in siblings is 4 5 fold
La Malattia Celiaca: caratteristiche
Si presenta in diverse forme cliniche:
forma tipica (sintomi enterici, sierologia e biopsia intestinale POSITIVE)
forma atipica (manifestazioni extraintestinali,
sierologia e biopsia intestinale POSITIVE)
forma silente (soli riscontri sierologici e bioptici POSITIVI)
forma latente (sola sierologia POSITIVA)
forma potenziale (soggetti a rischio con predisposizione genetica)
In famiglie con un affetto da MC è presente un secondo affetto nel 17% dei casi
(nel 55% dei casi parente di 1° grado ma nel 40% dei casi ad altri gradi di parentela)
SCREENING FAMILIARE ESTESO
MORTALITA’ : PRIMA DI DIETA AGLUTINATA: 10 – 30%
CON DIETA AGLUTINATA
:
0,4%
La Malattia Celiaca: diagnosi
Diagnosi clinica
possibile
MC
Tipica
BIO POS
MC
Atipica
BIO POS
Sintomi clinici
assenti
+ glutine
MC
Silente
MC
Latente
BIO POS
BIO NEG
Parametri sierologici
positivi
MC
Potenziale
Predisposizione
genetica
Tissue transglutaminase (tTG)
Major autoantigen of celiac disease
ELISA tests based on human recombinant
or guinea pig tTG
Malattia Celiaca e laboratorio
Ricerca anticorpi
Anticorpi anti Endomisio (EMA, IgA e IgG1)
Autoanticorpi diretti contro proteina umana
Anticorpi anti Gliadina (AGA, IgA e IgG)
Anticorpi diretti contro la Gliadina introdotta con la dieta
Anticorpi anti Transglutaminasi tissutale (tTG, IgA e IgG)
Identici agli anticorpi anti Endomisio il cui Ag determinante è stato
identificato nella TG tessutale
(Dieterich et al, Nat Med 1997; 3: 797)
Anticorpi di uso non routinario:
anti reticolina (ARA – R1): specificità buona, sensibilità inadeguata
anti digiuno (JAB) : specificità assoluta, sensibilità elevata
costo elevato e notevole difficoltà lettura
Malattia Celiaca e laboratorio: EMA
Anticorpi anti Endomisio (EMA, IgA e IgG1)
Autoanticorpi diretti contro proteine della matrice del collagene;
complesso in cui l’autoantigene maggiore è la transglutaminasi ma
ove sono presenti anche anti muscolo liscio ed anti ANA
Presenti nel siero di soggetti che assumono glutine di cui sono
essenziali due brevi sequenze NH2 terminali (peptidi 31-43)
Alterano interazione fibroblasti – cellule epiteliali compromettendo
la struttura del villo
METODI DETERMINAZIONE
Immunofluorescenza indiretta usando come
substrati:
Endomisio muscolo liscio del terzo distale di
esofago* o vescica di
scimmia Cordone ombelicale umano (HUC)
Atrofia dei villi con iperplasia delle cripte in soggetto a dieta libera
Positività Ab AGA e/o EMA
Remissione clinica dopo dieta
European Society for Pediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition (ESPGAN).1990
Revisione 2005
bambini < 5 anni: AGA
solo IgA tTG
HLA DQ2-DQ8
MC – Percorso diagnostico e monitoraggio
Soggetti con manifestazioni cliniche ed età > 2 anni
Soggetti appartenenti a gruppi di rischio
tTG IgA + IgA totali
tTG neg
tIgA nn
Possibile
escludere
MC con
elevata
probabilità
tTG POS
tIgA nn
tTG IgA neg
deficit tIgA
EMA IgA
AGA* IgA/IgG
EMA POS
BIOPSIA
EMA neg
tTG IgG
tTG IgG
POS
DQ2-DQ8
* Completamento diagnostico – Dato di base per monitoraggio dieta
tTG IgG
neg
Sorveglianza
clinica
MC – Percorso diagnostico e monitoraggio
Monitoraggio soggetti in dieta priva di glutine
AGA IgA e IgG + tTG IgA (se POS alla diagnosi)
AGA IgA/IgG neg
tTG neg
Patologia sotto
controllo
AGA IgA o IgG POS
o tTG IgA POS *
Rivedere
comportamento
dietetico
* Porre attenzione ai diversi tempi di negativizzazione
I difetti dell’immunità specifica sono
dovuti ad un
anomalo sviluppo, attivazione o funzione
dei linfociti T o B, o di entrambe le
popolazioni
IMMUNODEFICIENZE PRIMARIE A
CARICO DEI LINFOCITI B
ANOMALIE CONGENITE DI SVILUPPO E FUNZIONE DEI
LINFOCITI B
DEFICIT DELLA PRODUZIONE DI Ab
INFEZIONI RICORRENTI DA BATTERI CAPSULATI PIOGENI
Meningococco
Pneumococco
Haemophilus influenzae
Streptococco
IMMUNODEFICIENZE PRIMARIE A
CARICO DEI LINFOCITI T
DIFETTI NELL’ATTIVAZIONE E NELLA FUNZIONE
DEI LINFOCITI T
DEFICIT A CARICO DELL’IMMUNITA’ CELLULO-MEDIATA
AUMENTO DELLA SUSCETTIBILITA’ ALLE INFEZIONI DA
Virus
Miceti
Batteri intra-cellulari
Protozoi
Complement deficiencies
Clinical presentation
Infection
Bacteric recurrent diseases
Autoimmune disease
Lupus
L'immunodeficienza può essere secondaria
perdita di proteine come si verifica nel caso di gravi ustioni, nelle enteropatie
proteino-disperdenti, nella sindrome nefrosica.
Le malattie da virus e batteri sono spesso accompagnate da immunodeficienza
riguardante soprattutto i linfociti T.
L’esempio più tipico è l’infezione da HIV
Anche virus diversi dall’HIV alterano la responsività immunologica come il
virus del morbillo e l’HTLV-1.
lebbra lepromatosa
Infezione da Mycobacterium tubercolosis
Funghi o di parassiti come il plasmodio della malaria.
L'immunodeficienza secondaria al morbillo può durare oltre due mesi e causare
riattivazione tubercolare.
ALTRE IMMUNODEFICIENZE ACQUISITE
1.
l’immunodeficit può essere la complicanza di un
processo morboso
2.
l’immunodeficit può essere la conseguenza di una
terapia, in tal caso si parla di immunodeficienza
iatrogena.
la senescenza
La malnutrizione proteica e calorica
La carenza di oligo elementi
Le neoplasie,
L’immunodepressione iatrogena è
dovuta nella maggior parte dei casi a
terapie farmacologiche che uccidono o
inattivano funzionalmente i linfociti
Corticosteroidi,
Ciclosporina A
Radiazioni e farmaci inibitori della
proliferazione cellulare
METODI DIAGNOSTICI IN CASO DI SOSPETTO
IMMUNODEFICIT – PRIMO LIVELLO
•ESAME EMOCROMOCITOMETRICO
CON FORMULA (VALORI RELATIVI ED
ASSOLUTI DELLE SINGOLE CELLULE)
•ELETTROFORESI SIERICA
•DOSAGGIO DELLE IMMUNOGLOBULINE
(IgG, IgA E IgM)
•DOSAGGIO DEL COMPLEMENTO
•RICERCA DI AUTOANTICORPI NONORGANO SPECIFICI
Which methods do we use?
• Electrophoresis
• Turbidimetry (Complement assays
– C3/C4)
• Nephelometry (Immunoglobulins)
• Gel Diffusion (Ig subclasses)
• ELISA (specific functional
antibodies)
Protein Chemistry
Protein Electrophoresis
Protein Chemistry
Evaluating Lymphocyte Functionality by
Immunoglobulin and Antibody Levels
• Ig levels (preferably relative to serum albumen as a marker for loss)
– by RID, ELISA; low or elevated
• Existing titers
– Isohemagglutinins, anti A and B isoagglutinins, T independent B
cell response
– heteroagglutinins/heterolysins (srbc)
– bactericidal (E. coli).
• IgG responses to vaccines (Never live ones!)
– T-dependent: DTP (tetanus), poliomyelitis, Hib-conjugate
– T-independent (over 5 years of age): Pneumococcal or Hib
polysaccharide, typhoid Vi
Measurements of Complement
• levels of individual components, e.g., C3
– RID, ELISA (EIA), nephelometry
• CH50
4. Abnormalities of cells and cell
function
• Primary Cellular Immunodeficiency e.g. Xlinked hypogammaglobulinaemia
• Secondary cellular deficiency e.g. HIV
infection
• Specific cytokine defects
Cells & Cytokines
What tests can we perform in
these cases?
• Lymphocyte subset measurement
• Tests of cellular function
• Cytokine assays
Cells & Cytokines
By Presence/Absence/Counting
• Complete blood count and differential
– totals and distribution of types of cells
• Fluorescent activated cell sorter (FACS) for
subpopulation counts
– B lymphocytes: CD19 or CD20
– T cells: CD3 (T and NK); CD4 and CD8
– Phagocytic functional deficit
Flow cytometry results
In vitro Mitogenesis
• Leukocytes are
collected from blood.
• White cells are
cultured in wells of
microplates with
appropriate
stimulants.
In Vitro Proliferation Tests
Compared
MLR
St i m u l a t o r s X - I r r a d i a t e d
Bl ast ogenesis
M it oge n
+
+
Re s p o nd e r s
R e s p o nd e r s
+
+
H 3 - T hy mi dine
H 3 - T hy midine
proliferating cells + radiolabel = labeled cells
Nitroblue Tetrazolium Test
+
Ce l l s w i t h
Intracellular
Re d u c e d Dy e
• neutrophils
• tests phagocytosis, and dye reduction during superoxide
production
