Lo screening dell`aplotiplo nella diagnosi della celiachia
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Martedì 7 giugno 2011 Lo screening dell’aplotiplo nella diagnosi della celiachia Dott.ssa Lucia Terzuoli Dipartimento di Medicina Interna, Scienze Endocrino-Metaboliche e Biochimica Università degli Studi di Siena CELIACHIA malattia multifattoriale Fattori ambientali Fattori genetici HLA glutine Altri geni Nelle malattie complesse i test genetici sono predittivi o di suscettibilità NON DIAGNOSTICO Il complesso HLA (Human Leukocyte Antigen) Antigeni di istocompatibilità (trapianti) Complesso maggiore di Istocompatibilità (MHC) DP DQ DR Espresse su: Cellule B APC Macrofagi Espresse su: tutte le cellule nucleate Glicoproteine di membrana espresse come eterodimeri (catena α 34 Kda, catena β 29 Kda. Polimorfismo della tasca amminoacidica che determina diversa affinità ai vari peptidi antigenici.) La regione HLA è la più densa di geni e la più polimorfica di tutto il genoma Esiste una probabilità su decine di milioni che vi sia un altro individuo con le stesse nostre caratteristiche HLA L’estrema variabilità dei geni HLA garantisce maggiore resistenza agli agenti patogeni. HLA La regione HLA e il prefisso per un gene HLA HLADQ-B1 Un locus HLA specifico HLADQ-B1*02 Un gruppo di alleli che codificano l’antigene DQ HLADQ-B1*02:01 HLADQ-B1*02:03 Uno specifico allele HLA HLADQ-B1*02:04 HLADQ-B1*02:01:01 Un singolo allele Allele DRB1*04:01 forme alternative di uno stesso gene Aplotipo DRB1*04:01 DQB1*03:02 DRB1*04:01 DRB1*03:01 DQB1*03:02 DQB1*02:01 combinazioni di alleli di loci vicini viene trasmesso su uno stesso cromosoma Genotipo Corredo genetico di un individuo Nomenclatura HLA Tipizzazione sierologica Tipizzazione genica Si identificano gli antigeni Si identificano i geni Sono relativamente pochi Sono molti La nomenclatura è relativamente complessa La nomenclatura è esageratamente complessa http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/nomenclature/index.html HLA II 1198 alleli con nomi ufficiali ∼90% dei pazienti celiaci Eterodimero DQ2 HLA-DQA1*05/DQB1*02 ∼10% dei pazienti celiaci Eterodimero DQ8 HLA-DQA1*03/DQB1*03:02 Bassissimo rischio DQB1* DQA1* DQ2 cis DQB1* DQA1* DQ2 trans DQ8 A rischio DQB1* DQA1* DQB1* DQA1* DQB1* DQA1* Alto rischio DQB1* DQA1* DQB1* DQA1* Alleli HLA: DQA1*…….,*….; DQB1* ;*…. Presenza dell’eterodimero DQ2 (DQA1*05, DQB1*02) Stato DQB1*02 omozigote: presente , assente , non determinato Presenza della sola catena beta del dimero DQ2 (DQB1*02) Presenza dell’eterodimero DQ8 (DQA1*03, DQB1*03:02) La presenza di almeno una di tali condizioni è indicativa di suscettibilità alla celiachia e non implica lo sviluppo della malattia, la cui diagnosi deve essere verificata con test sierologici e biopsia intestinale. Assenza degli alleli HLA a rischio di celiachia Tale condizione rende altamente improbabile la comparsa della celiachia Protocollo per la Diagnosi ed il Follow-up della Celiachia Ministero della Salute (legge 123/05) TEST DI I LIVELLO ANTICORPI ANTI tTG UMANA IgA (IgG nei deficit di IgA); EmA come test di conferma da eseguirsi in centri di riferimento nei casi dubbi AGA da ricercarsi solo nei bambini con età < 2 anni BIOPSIA DUODENALE Classificazione di Marsh, modificata da Oberhuber, da inquadrare nel contesto clinico, anticorpale e genetico. TEST DI II LIVELLO: HLA (dopo anticorpi e/o biopsia non diagnostici) Test eseguito per escludere celiachia Negatività DQ2/DQ8 bassissima probabilità di celiachia Positività DQ2 o DQ8 predisposizione alla malattia http://www.sigu.net Raccomandazioni per l’esecuzione del test HLA Proposta congiunta Associazione Italiana Celiachia (AIC) Associazione Italiana Immunogenetica e Biologia dei Trapianti (AIBT) Società Italiana di Genetica Umana (SIGU) In caso di incertezza anticorpi e/o biopsia dubbio e discrepanti In soggetti appartenenti a categorie a rischio Familiari di primo grado degli affetti per decidere se continuare il follow-up in caso di sierologia negativa PROCEDURA DIAGNOSTICA IN SOGGETTI CON MANIFESTAZIONI CLINICHE ED ETA’ INFERIORE A 5 ANNI PROCEDURA DIAGNOSTICA IN SOGGETTI CON MANIFESTAZIONI CLINICHE ED ETA’ SUPERIORE A 5 ANNI Anticorpi anti-tTG IgA e IgA totali sieriche Anticorpi anti-tTG IgA, IgA totali sieriche, AGA IgA e AGA IgG Anticorpi anti-tTG IgA positivi IgA normali Anticorpi anti-tTG IgA negativi deficit IgA (<5mg/dl) Anticorpi anti-tTG IgA positivi IgA normali Anticorpi anti-tTG IgA negativi deficit IgA (<5mg/dl) Anticorpi anti-tTG IgA negativi IgA normali Anticorpi anti-tTG IgA negativi, AGA IgA e AGA IgG negativi IgA normali Quadro clinico associabile celiachia EMA IgA Anticorpi anti-tTG IgG e AGA IgG EMA IgA Anticorpi anti-tTG IgG e AGA IgG Elevata probabilità di NO MC Ripetere i marcatori sierologici anche più di una volta, fino all’età di 5 anni. Anticorpi anti-tTG IgG positivi e AGA IgG positivi Anticorpi anti-tTG IgG positivi e AGA IgG positivi Anticorpi anti-tTG IgG negativi e AGA IgG negativi EMA IgA positivo EMA IgA positivo Anticorpi anti-tTG IgG negativi e AGA IgG negativi EMA IgA negativo EMA IgA negativo SI biopsia duodenale SI biopsia duodenale NO biopsia duodenale Diagnosi praticamente certa di MC Ripetere a distanza di qualche mese Diagnosi praticamente certa di MC Anticorpi anti-tTG IgG positivi o AGA IgG positivi HLA DQ2/DQ8 positivo SI biopsia duodenale HLA DQ2/DQ8 positivo DQ2/DQ8 negativo NO biopsia duodenale NO biopsia duodenale Anticorpi anti-tTG IgG positivi o AGA IgG positivi SI biopsia duodenale RICERCA ALLELI DQ2/DQ8 SI biopsia duodenale Ripetere a distanza di qualche mese SI biopsia duodenale DQ2/DQ8 negativo NO biopsia duodenale L'estrazione del DNA, l'amplificazione, la deposizione dell'amplificato sulle membrane di reazione, l'ibridazione e la relativa rivelazione, la lettura dell'avvenuta reazione costituiscono passaggi delicati e relativamente lunghi. Un'esecuzione non ottimale di uno di essi può compromettere definitivamente il risultato della tipizzazione. Operatore esperto. Laboratori accreditati dalla Federazione Europea di Immunogenetica (EFI) Laboratori di Genetica Medica Laboratori con documentata esperienza nel campo della Biologia Molecolare Il costo della tipizzazione è alto. Limitato aOperatore Difficoltà di laboratoriesperto interpretazione specializzati dei risultati Tempo di esecuzione Costo molto lungo elevato Celiac Gene Screen: suscettibilità, escludendo populazione generale, che CD. Il limite di questo dicriminare l’aplotipo DQ2 e Celiac Gene Typing: associati con CD. identifica la il 70% della non svilupperà test è di non DQ8. identifica gli alleli Reagenti pronti all’uso Stabilità 1 anno Trasporto a temperatura ambiente Temperatura di stoccaggio +4 °C Velocità esecuzione Estrazione DNA non purificato, ma altamente ottimizzato per amplificazione. Stessa procedura di estrazione per i due kit. Lettura Estrazione e lisi DNA cartina pungidito Buffer di estrazione pronto all’uso 200 µl sangue raccolto in provette con EDTA DNA 10 µl Tempo = 1 minuto Cera per PCR pronta all’uso Preparazione PCR 30 µl 26 µl lisato 20 µl Taq Mix 18 µl Taq Mix + Primer mix. 12 provette da 0,2 ml contenenti i primer/sonde liofili. + 2 µl lisato Primer mix = Agitare molto bene Amplificazione Attivazione Tempo = 2h Lettura dei risultati Lettore di fluorescenza BioRun Interpretazione automatica dei risultati Screen Typing Tempo = 1 min Dott. Elio Tonutti, Immunopatologia e Allergologia, Azienda Ospedaliero-Universitaria di Udine P.za S.Maria della Misericordia 15, 33100 Udine in collaborazione con la Clinica Pediatrica della stessa Azienda Dott.ssa Maria Teresa Trevisan e Dott.ssa Alicia Benedetti, UOA di Laboratorio, Ospedale G. Fracastoro, Via della Circonvallazione, 37047 Verona BioDiagene S.r.l. Via Aquileia 34 90144 Palermo 74 campioni Celiac Gene Screen Celiac Gene Typing Concordanza 100% Precedente tipizzazione (kit Eurospital) Concordanza 100% 21 campioni Celiac Gene Screen/Celiac Gene Typing DR3-DQ2 eterozigote DR3-DQ2 Non eterozigote suscettibili Concordanza 100% DR3-DQ2 eterozigote Celiaco DR3-DQ2 eterozigote DR3-DQ2 omozigote Un risultato DQ2/DQ8 negativo permette l’eliminazione di periodici controlli clinici e sierologici e tranquillizza pazienti e familiari. Scopo Determinare se la tipizzazione HLA possa ridurre i costi, grazie all’eliminazione di continui controlli periodici in pazienti a rischio, eliminando i pazienti risultati negativi. Colonna verde: costo attuale Colonna rossa: costo pari alla metà Colonna blu: costo pari ad un quarto Limitato aOperatore laboratoriesperto specializzati Tempo di esecuzione lungo Facilità e velocità esecuzione. Estrazione veloce DNA, non purificato ma altamente ottimizzato per amplificazione. Tutto pronto uso. Kit CE IVD marcato CE0318 (Dichiarazione CE di conformità. Sistema di garanzia di qualità totale) Difficoltà di interpretazione dei risultati Lo strumento in automatico da la risposta. Bassa risoluzione per identificare i gruppi allelici, meno DQB1*03 media risoluzione. Costo molto elevato Screen: 96 pazienti - 20 euro singolo test Typing: 8 pazienti - 55 euro singolo test Ministero della Salute (legge 123/05) TEST DI II LIVELLO: HLA http://www.sigu.net In soggetti appartenenti a categorie a rischio Familiari di primo grado degli affetti per decidere se continuare il follow-up in caso di sierologia negativa In caso di incertezza anticorpi e/o biopsia dubbio e discrepanti Anticorpi anti-tTG IgA e IgA totali sieriche Anticorpi anti-tTG IgA, IgA totali sieriche, AGA IgA e AGA IgG Anticorpi anti-tTG IgA positivi IgA normali Anticorpi anti-tTG IgA negativi deficit IgA (<5mg/dl) Anticorpi anti-tTG IgA positivi IgA normali Anticorpi anti-tTG IgA negativi deficit IgA (<5mg/dl) Anticorpi anti-tTG IgG e AGA IgG EMA IgA EMA IgA Anticorpi anti-tTG IgA negativi IgA normali Anticorpi anti-tTG IgA negativi, AGA IgA e AGA IgG negativi IgA normali Quadro clinico associabile celiachia Anticorpi anti-tTG IgG e AGA IgG Elevata probabilità di NO MC Ripetere i marcatori sierologici anche più di una volta, fino all’età di 5 anni. Anticorpi anti-tTG IgG positivi e AGA IgG positivi EMA IgA positivo Anticorpi anti-tTG IgG negativi e AGA IgG negativi EMA IgA negativo SI biopsia duodenale NO biopsia duodenale Ripetere a distanza di qualche mese Diagnosi praticamente certa di MC Anticorpi anti-tTG IgG positivi o AGA IgG positivi DQ2/DQ8 positivo SI biopsia duodenale Diagnosi praticamente certa di MC EMA IgA negativo Ripetere a distanza di qualche mese SI biopsia duodenale SI biopsia duodenale RICERCA ALLELI DQ2/DQ8 SI biopsia duodenale EMA IgA positivo Anticorpi anti-tTG IgG positivi e AGA IgG positivi DQ2/DQ8 negativo NO biopsia duodenale DQ2/DQ8 positivo SI biopsia duodenale Anticorpi anti-tTG IgG negativi e AGA IgG negativi NO biopsia duodenale Anticorpi anti-tTG IgG positivi o AGA IgG positivi H L A DQ2/DQ8 negativo NO biopsia duodenale SCREENING DELL’APLOTIPO TEST I LIVELLO Grazie per l’attenzione
