Lo screening dell`aplotiplo nella diagnosi della celiachia

Martedì 7 giugno 2011
Lo screening dell’aplotiplo nella diagnosi
della celiachia
Dott.ssa Lucia Terzuoli
Dipartimento di Medicina Interna, Scienze Endocrino-Metaboliche e Biochimica
Università degli Studi di Siena
CELIACHIA
malattia multifattoriale
Fattori ambientali
Fattori genetici
HLA
glutine
Altri geni
Nelle malattie complesse i test genetici sono predittivi o di
suscettibilità
NON DIAGNOSTICO
Il complesso HLA (Human Leukocyte Antigen)
Antigeni di istocompatibilità (trapianti)
Complesso maggiore di Istocompatibilità (MHC)
DP DQ DR
Espresse su:
Cellule B
APC
Macrofagi
Espresse su:
tutte le cellule nucleate
Glicoproteine di membrana espresse come eterodimeri
(catena α 34 Kda, catena β 29 Kda. Polimorfismo della tasca amminoacidica che determina
diversa affinità ai vari peptidi antigenici.)
La regione HLA è la più densa di geni e la più
polimorfica di tutto il genoma
Esiste una probabilità su decine di milioni che vi
sia un altro individuo con le stesse nostre
caratteristiche HLA
L’estrema variabilità dei geni HLA garantisce
maggiore resistenza agli agenti patogeni.
HLA
La regione HLA e il prefisso per un gene
HLA
HLADQ-B1
Un locus HLA specifico
HLADQ-B1*02
Un gruppo di alleli che codificano
l’antigene DQ
HLADQ-B1*02:01
HLADQ-B1*02:03
Uno specifico allele HLA
HLADQ-B1*02:04
HLADQ-B1*02:01:01
Un singolo allele
Allele
DRB1*04:01
forme alternative di uno stesso gene
Aplotipo
DRB1*04:01
DQB1*03:02
DRB1*04:01
DRB1*03:01
DQB1*03:02
DQB1*02:01
combinazioni di alleli di loci vicini
viene trasmesso su uno stesso cromosoma
Genotipo
Corredo genetico di un individuo
Nomenclatura HLA
Tipizzazione sierologica
Tipizzazione genica
Si identificano gli antigeni
Si identificano i geni
Sono relativamente pochi
Sono molti
La nomenclatura è relativamente
complessa
La nomenclatura è
esageratamente
complessa
http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/nomenclature/index.html
HLA II
1198
alleli con nomi ufficiali
∼90% dei pazienti celiaci
Eterodimero DQ2
HLA-DQA1*05/DQB1*02
∼10% dei pazienti celiaci
Eterodimero DQ8
HLA-DQA1*03/DQB1*03:02
Bassissimo
rischio
DQB1*
DQA1*
DQ2 cis
DQB1*
DQA1*
DQ2 trans
DQ8
A rischio
DQB1*
DQA1*
DQB1*
DQA1*
DQB1*
DQA1*
Alto
rischio
DQB1*
DQA1*
DQB1*
DQA1*
Alleli HLA: DQA1*…….,*….; DQB1*
;*….
Presenza dell’eterodimero DQ2 (DQA1*05, DQB1*02)
Stato DQB1*02 omozigote: presente
, assente , non determinato
Presenza della sola catena beta del dimero DQ2 (DQB1*02)
Presenza dell’eterodimero DQ8 (DQA1*03, DQB1*03:02)
La presenza di almeno una di tali condizioni è indicativa di
suscettibilità alla celiachia e non implica lo sviluppo della
malattia, la cui diagnosi deve essere verificata con test
sierologici e biopsia intestinale.
Assenza degli alleli HLA a rischio di celiachia
Tale condizione rende altamente improbabile la
comparsa della celiachia
Protocollo per la Diagnosi ed il Follow-up della Celiachia
Ministero della Salute (legge 123/05)
TEST DI I LIVELLO
ANTICORPI ANTI tTG UMANA IgA (IgG nei deficit di IgA);
EmA come test di conferma da eseguirsi in centri di riferimento nei
casi dubbi
AGA da ricercarsi solo nei bambini con età < 2 anni
BIOPSIA DUODENALE
Classificazione di Marsh, modificata da Oberhuber, da inquadrare nel
contesto clinico, anticorpale e genetico.
TEST DI II LIVELLO: HLA
(dopo anticorpi e/o biopsia non diagnostici)
Test eseguito per escludere celiachia
Negatività DQ2/DQ8 bassissima probabilità di celiachia
Positività DQ2 o DQ8 predisposizione alla malattia
http://www.sigu.net
Raccomandazioni per l’esecuzione del test HLA
Proposta congiunta
Associazione Italiana Celiachia (AIC)
Associazione Italiana Immunogenetica e Biologia dei Trapianti (AIBT)
Società Italiana di Genetica Umana (SIGU)
In caso di incertezza
anticorpi e/o biopsia dubbio e discrepanti
In soggetti appartenenti a categorie a rischio
Familiari di primo grado degli affetti per decidere se
continuare il follow-up in caso di sierologia negativa
PROCEDURA DIAGNOSTICA IN SOGGETTI CON
MANIFESTAZIONI CLINICHE ED ETA’ INFERIORE A 5 ANNI
PROCEDURA DIAGNOSTICA IN SOGGETTI CON MANIFESTAZIONI
CLINICHE ED ETA’ SUPERIORE A 5 ANNI
Anticorpi anti-tTG IgA
e IgA totali sieriche
Anticorpi anti-tTG IgA, IgA totali sieriche, AGA IgA e AGA IgG
Anticorpi anti-tTG IgA positivi
IgA normali
Anticorpi anti-tTG IgA negativi
deficit IgA (<5mg/dl)
Anticorpi anti-tTG IgA positivi
IgA normali
Anticorpi anti-tTG IgA negativi
deficit IgA (<5mg/dl)
Anticorpi anti-tTG IgA negativi
IgA normali
Anticorpi anti-tTG IgA negativi, AGA IgA e AGA IgG negativi
IgA normali
Quadro clinico associabile celiachia
EMA IgA
Anticorpi anti-tTG IgG
e AGA IgG
EMA IgA
Anticorpi anti-tTG IgG
e AGA IgG
Elevata probabilità di
NO MC
Ripetere i marcatori sierologici anche più di una volta, fino all’età di 5 anni.
Anticorpi anti-tTG IgG positivi
e AGA IgG positivi
Anticorpi anti-tTG IgG positivi
e AGA IgG positivi
Anticorpi anti-tTG IgG negativi
e AGA IgG negativi
EMA IgA positivo
EMA IgA positivo
Anticorpi anti-tTG IgG negativi
e AGA IgG negativi
EMA IgA negativo
EMA IgA negativo
SI
biopsia duodenale
SI
biopsia duodenale
NO
biopsia duodenale
Diagnosi praticamente certa
di MC
Ripetere a distanza di qualche mese
Diagnosi praticamente certa di MC
Anticorpi anti-tTG IgG positivi o AGA IgG positivi
HLA
DQ2/DQ8
positivo
SI
biopsia
duodenale
HLA
DQ2/DQ8
positivo
DQ2/DQ8
negativo
NO
biopsia
duodenale
NO
biopsia duodenale
Anticorpi anti-tTG IgG positivi o AGA IgG positivi
SI
biopsia duodenale
RICERCA ALLELI DQ2/DQ8
SI
biopsia duodenale
Ripetere a distanza di qualche
mese
SI
biopsia
duodenale
DQ2/DQ8
negativo
NO
biopsia
duodenale
L'estrazione del DNA, l'amplificazione, la deposizione
dell'amplificato sulle membrane di reazione, l'ibridazione e la
relativa rivelazione, la lettura dell'avvenuta reazione
costituiscono passaggi delicati e relativamente lunghi.
Un'esecuzione non ottimale di uno di essi può compromettere
definitivamente il risultato della tipizzazione. Operatore esperto.
Laboratori accreditati dalla Federazione Europea di Immunogenetica (EFI)
Laboratori di Genetica Medica
Laboratori con documentata esperienza nel campo della Biologia Molecolare
Il costo della tipizzazione è alto.
Limitato aOperatore
Difficoltà di
laboratoriesperto
interpretazione
specializzati
dei risultati
Tempo di
esecuzione
Costo molto
lungo
elevato
Celiac
Gene
Screen:
suscettibilità, escludendo
populazione generale, che
CD. Il limite di questo
dicriminare l’aplotipo DQ2 e
Celiac Gene Typing:
associati con CD.
identifica
la
il 70% della
non svilupperà
test è di non
DQ8.
identifica
gli
alleli
Reagenti pronti all’uso
Stabilità 1 anno
Trasporto a temperatura ambiente
Temperatura di stoccaggio +4 °C
Velocità esecuzione
Estrazione
DNA non purificato, ma
altamente ottimizzato per
amplificazione.
Stessa
procedura di estrazione
per i due kit.
Lettura
Estrazione e lisi DNA
cartina
pungidito
Buffer di
estrazione
pronto all’uso
200 µl
sangue raccolto in
provette con EDTA
DNA
10 µl
Tempo = 1 minuto
Cera per PCR
pronta all’uso
Preparazione PCR
30 µl
26 µl lisato
20 µl
Taq Mix
18 µl
Taq Mix
+
Primer mix.
12 provette da 0,2 ml
contenenti i
primer/sonde liofili.
+
2 µl lisato Primer mix
=
Agitare
molto
bene
Amplificazione
Attivazione
Tempo = 2h
Lettura dei risultati
Lettore di
fluorescenza
BioRun
Interpretazione automatica dei risultati
Screen
Typing
Tempo = 1 min
Dott. Elio Tonutti, Immunopatologia e Allergologia, Azienda Ospedaliero-Universitaria di
Udine
P.za S.Maria della Misericordia 15, 33100 Udine in collaborazione con la Clinica
Pediatrica della stessa Azienda
Dott.ssa Maria Teresa Trevisan e Dott.ssa Alicia
Benedetti, UOA di Laboratorio,
Ospedale G. Fracastoro, Via della Circonvallazione,
37047 Verona
BioDiagene S.r.l.
Via Aquileia 34
90144 Palermo
74 campioni
Celiac Gene Screen
Celiac Gene Typing
Concordanza 100%
Precedente tipizzazione (kit Eurospital)
Concordanza 100%
21 campioni
Celiac Gene Screen/Celiac Gene Typing
DR3-DQ2
eterozigote
DR3-DQ2
Non
eterozigote suscettibili
Concordanza 100%
DR3-DQ2
eterozigote
Celiaco
DR3-DQ2
eterozigote
DR3-DQ2
omozigote
Un risultato DQ2/DQ8
negativo
permette
l’eliminazione di periodici
controlli
clinici
e
sierologici e tranquillizza
pazienti e familiari.
Scopo
Determinare se la tipizzazione HLA possa ridurre i costi, grazie all’eliminazione di
continui controlli periodici in pazienti a rischio, eliminando i pazienti risultati
negativi.
Colonna verde: costo attuale
Colonna rossa: costo pari alla metà
Colonna blu: costo pari ad un quarto
Limitato aOperatore
laboratoriesperto
specializzati
Tempo di
esecuzione
lungo
Facilità e velocità esecuzione. Estrazione veloce DNA, non purificato ma
altamente ottimizzato per amplificazione.
Tutto pronto uso.
Kit CE IVD marcato CE0318
(Dichiarazione CE di conformità. Sistema di garanzia di qualità totale)
Difficoltà di
interpretazione
dei risultati
Lo strumento in automatico da la risposta. Bassa risoluzione per
identificare i gruppi allelici, meno DQB1*03 media risoluzione.
Costo molto
elevato
Screen: 96 pazienti - 20 euro singolo test
Typing: 8 pazienti - 55 euro singolo test
Ministero della Salute (legge 123/05)
TEST DI II LIVELLO: HLA
http://www.sigu.net
In soggetti appartenenti a categorie a rischio
Familiari di primo grado degli affetti per decidere se
continuare il follow-up in caso di sierologia negativa
In caso di incertezza
anticorpi e/o biopsia dubbio e discrepanti
Anticorpi anti-tTG IgA
e IgA totali sieriche
Anticorpi anti-tTG IgA, IgA totali sieriche, AGA IgA e AGA IgG
Anticorpi anti-tTG IgA positivi
IgA normali
Anticorpi anti-tTG IgA negativi
deficit IgA (<5mg/dl)
Anticorpi anti-tTG IgA positivi
IgA normali
Anticorpi anti-tTG IgA negativi
deficit IgA (<5mg/dl)
Anticorpi anti-tTG IgG
e AGA IgG
EMA IgA
EMA IgA
Anticorpi anti-tTG IgA negativi
IgA normali
Anticorpi anti-tTG IgA negativi, AGA IgA e AGA IgG negativi
IgA normali
Quadro clinico associabile celiachia
Anticorpi anti-tTG IgG
e AGA IgG
Elevata probabilità di
NO MC
Ripetere i marcatori sierologici anche più di una volta, fino all’età di 5 anni.
Anticorpi anti-tTG IgG positivi
e AGA IgG positivi
EMA IgA positivo
Anticorpi anti-tTG IgG negativi
e AGA IgG negativi
EMA IgA negativo
SI
biopsia duodenale
NO
biopsia duodenale
Ripetere a distanza di qualche mese
Diagnosi praticamente certa di MC
Anticorpi anti-tTG IgG positivi o AGA IgG positivi
DQ2/DQ8
positivo
SI
biopsia
duodenale
Diagnosi
praticamente
certa di MC
EMA IgA
negativo
Ripetere a distanza
di qualche mese
SI
biopsia duodenale
SI
biopsia
duodenale
RICERCA ALLELI DQ2/DQ8
SI
biopsia duodenale
EMA IgA
positivo
Anticorpi anti-tTG IgG positivi
e AGA IgG positivi
DQ2/DQ8
negativo
NO
biopsia
duodenale
DQ2/DQ8
positivo
SI
biopsia
duodenale
Anticorpi anti-tTG IgG negativi
e AGA IgG negativi
NO
biopsia
duodenale
Anticorpi anti-tTG IgG positivi o AGA IgG
positivi
H
L
A
DQ2/DQ8
negativo
NO
biopsia
duodenale
SCREENING DELL’APLOTIPO
TEST I LIVELLO
Grazie per l’attenzione