ORGANIZZAZIONE SINDROME DI ANGELMAN Via Bressa n° 8 31100 TREVISO Tel. 0422411132 Fax.0422319571 C.F.94047800266 http://www.sindromediangelman.org E mail: [email protected] Cari associati, vi ringrazio profondamente per la mia riconfermata a presidente di questa grande famiglia OR.S.A. e di tutto il direttivo uscente. Con questo voto mi dimostrate tutta la vostra fiducia che cercheremo di non deludere continuando nel miglior modo possibile il lavoro avviato. Si è appena concluso il 19º congresso nazionale che per i temi trattati e per il numero di persone che hanno partecipato è stato un bel successo, ma purtroppo come è a voi ben noto nella giornata conclusiva abbiamo avuto un grandissimo lutto che ha colpito l'OR.S.A., ovvero la perdita del piccolo Davide e del suo Nonno Danilo Giacometti. Alla sua mamma e al suo papà e a tutti i loro parenti va tutta la nostra solidarietà. Da qualche giorno si è anche concluso il meeting internazionale di Parigi, dove è stato presentato lo stato della ricerca mondiale e si è concluso il processo di valutazione dei bandi di concorso promossi da ASA. ASA, COME ANTICIPATO DURANTE L'ASSEMBLEA GENERALE, è un’ alleanza europea di associazioni, finalizzata al finanziamento della ricerca e allo scambio di esperienze e l'OR.S.A. ne è un promotore e sostenitore. Dopo aver pubblicato il bando di concorso, ad ASA sono arrivati 10 progetti da valutare. Dopo un lungo processo di valutazione da parte del comitato scientifico e dei promotori di ASA, a Parigi, si è arrivati alla proclamazione dei primi due vincitori che sono: • i ricercatori DR. Van Woerden e Prof. YPE Elgersma Eencore expertise center Rotterdam con il progetto : ‘Generation of E6AP isoform-specific mouse models for Angelman Syndrome’; • il ricercatore Ben Distel PhD Dept. of Medical Biochemistry Academic Medical Center Amsterdam con il progetto ‘Elucidating the molecular mechanisms underlying E6AP function in the brain’; §§ Iscr.Reg.Vol. TV 0209 - O.N.L.U.S. §§ C.C.Postale N.390310 §§ IBAN – IT 13 Y 02008 12011 000005467786 §§ ORGANIZZAZIONE SINDROME DI ANGELMAN Via Bressa n° 8 31100 TREVISO Tel. 0422411132 Fax.0422319571 C.F.94047800266 http://www.sindromediangelman.org E mail: [email protected] Durante il meeting di Parigi, abbiamo potuto invitare a nostro prossimo convegno nazionale, che sarà ad Assisi il 16/17 /18 ottobre 2015, alcuni fra i relatori che hanno presentato i lavori più interessanti e promettenti per la sindrome di Angelman. Relazione sui lavori presentati al Meeting Internazionale di Parigi I trasportatori delle monoamine come target per la CamKII alpha: implicazioni per la Sindrome di Angelman Harald H. Sitte, Ph.D. (Austria) Il sistema nervoso è l’organo primario per le manifestazioni della Sindrome di Angelman (SA). Abbiamo recentemente osservato che la carenza di Ube3A cambia l’attività del trasportatore della dopamina nei neuroni dopaminergici (Steingellner et al., J. Biol. Chem., 2012). Siamo passati poi ad esaminare un altro aspetto, cioè il fenomeno per cui la SA può spesso essere accompagnata da effetti collaterali sul sistema serotoninergico e che sono i principali fattori che causano una sintomatologia autistica. Così come per il sistema dopaminergico, abbiamo studiato se il trasportatore della serotonina, che è spesso coinvolto nella manifestazione della sintomatologia autistica, e il sistema serotoninergico per se possano rappresentare un target clinico farmacologico. Il trasportatore della serotonina è conosciuto per essere il target di un gruppo di diversi farmaci per varie importanti patologie (come per esempio la depressione). Nel corso dell’intervento è stato brevemente presentata lo stato attuale della ricerca insieme ad una panoramica delle possibilità basate sul coinvolgimento del sistema serotoninergico nella SA. Modelli per studiare la funzione di Ube3A/E6AP Ben Distel, Ph.D. (Olanda) Il gene dell’Ube3A codifica per la proteina ubiquitina ligasi E6AP, per cui il malfunzionamento del processo di ubiquitinizzazione mediata da E6AP dei suoi target è considerato la causa della Sindrome di Angelman (SA). Nonostante siano noti parecchi target potenziali dell’E6AP, bisogna ancora dimostrare se uno (e quale) di questi target contribuisca al fenotipo della SA. Pertanto, l’identificazione del/dei target (critici) dell’E6AP e la conoscenza del loro contributo §§ Iscr.Reg.Vol. TV 0209 - O.N.L.U.S. §§ C.C.Postale N.390310 §§ IBAN – IT 13 Y 02008 12011 000005467786 §§ ORGANIZZAZIONE SINDROME DI ANGELMAN Via Bressa n° 8 31100 TREVISO Tel. 0422411132 Fax.0422319571 C.F.94047800266 http://www.sindromediangelman.org E mail: [email protected] meccanicistico alla patologia è il primo passo verso lo sviluppo di una terapia per la SA. Tramite un sistema di screening a doppio ibrido di lievito (yeast two-hybrid system), abbiamo recentemente identificato varie proteine interagenti con E6AP (UBE3A) (UIPs), incluse una proteina nota per causare disabilità intellettuali con aspetti simili a quelli della SA e una proteina coinvolta nel traffico di vescicole nel cervello. Per confermare se queste proteine sono target veri e propri dell’E6AP, abbiamo messo appunto degli strumenti che ci permettono di: 1) valutare l’interazione fisica diretta di queste proteine con l’E6AP; 2) determinare come la loro ubiquitinizzazione e stabilità dipenda dall’attività dell’E6AP. E’ stata presentata la validazione di questi strumenti e la caratterizzazione iniziale delle proteine interagenti con l’E6AP recentemente identificate. Inoltre, è stato discusso di come questi strumenti possano essere utilizzati per sviluppare approcci innovativi mirati ad identificare nuovi substrati neuronali e attivatori dell’E6AP. Un ruolo critico per l’UBE3A nello sviluppo cerebrale Ype Elgersma, Ph.D. (Olanda) Ype nella presentazione ha fornito un aggiornamento sulle sue linee di ricerca per la SA. In particolar modo, si è concentrato sui dati ottenuti dal modello del topo con SA inducibile, nel quale cioè è possibile accendere il gene dell’UBE3A in qualsiasi momento. I suoi esperimenti suggeriscono che alcuni fenotipi, anche se non tutti, del topo con SA sono reversibili quando il gene è acceso nell’animale in età post-natale. Questo indica che c’è una finestra critica in cui si può ottenere la reversibilità, e che la finestra critica non è la stessa per tutti i fenotipi. Meccanismi dell’imprinting dell’Ube3a Angela Mabb, ph.D. (USA) La Sindrome di Angelman (SA) è provocata da delezioni ereditarie o mutazioni nella copia materna dell’UBE3A. Nei neuroni, la copia materna dell’UBE3A è espressa, ma la copia paterna è silenziata. Una terapia potenziale per pazienti affetti dalla SA è ripristinare l’espressione della copia paterna dell’UBE3A per mezzo farmacologico. Grazie a test di imaging ad alto rendimento, §§ Iscr.Reg.Vol. TV 0209 - O.N.L.U.S. §§ C.C.Postale N.390310 §§ IBAN – IT 13 Y 02008 12011 000005467786 §§ ORGANIZZAZIONE SINDROME DI ANGELMAN Via Bressa n° 8 31100 TREVISO Tel. 0422411132 Fax.0422319571 C.F.94047800266 http://www.sindromediangelman.org E mail: [email protected] abbiamo identificato alcuni farmaci (già approvati dalla FDA) inibitori della topoisomerasi che attivano la copia paterna dell’Ube3a nei topi. Ciò suggerisce una via per normalizzare l’espressione dell’UBE3A nei pazienti affetti dalla SA e offre, quindi, una opportunità terapeutica unica. Abbiamo cercato di scoprire i meccanismi della riattivazione dell’Ube3a tramite manipolazioni dirette della Topoisomerasi mediante l’uso di inibitori della topoisomerasi, trasduzione virale e linee di topi transgenici. L’elaborazione di questi studi ci ha dato una visione più chiara su come la Topoisomerasi regoli l’attività dell’Ube3a e ci ha permesso di capire meglio l’impatto delle manipolazioni della Topoisomerasi durante il neurosviluppo. Le nostre scoperte mirano a determinare se gli inibitori di topoisomerasi siano validi candidati per trial clinici per la SA. Caratterizzazione delle mutazioni di UBE3A nei pazienti affetti da Sindrome di Angelman Silvia Russo, Ph.D. (Italia) Mutazioni e evidenti delezioni nel gene UBE3A rappresentano circa il 10% dei difetti coinvolti nella Sindrome di Angelman, una grave patologia caratterizzata da ritardo mentale, particolare elettroencefalogramma, assenza di linguaggio, atassia e contegno felice. Il gene codifica per l’ubiquitina ligasi E6AP ed è soggetto a imprinting genomico con una espressione materna specifica nel cervello, più precisamente nei neuroni. D’altra parte, le duplicazioni interstiziali materne del cromosoma 15q11-113 causano l’Autismo. Da un gruppo di 163 pazienti con la SA ,con una diagnosi genetica, abbiamo identificato 41 diverse mutazioni di UBE3A nel gene. La maggior parte delle alterazioni di sequenza sono troncanti, una è un difetto di splicing, 3 sono delezioni in frame e 6 variazioni missenso. Allo scopo di individuare la relazione genotipo-fenotipo, è stato analizzato il decadimento mediato da un nonsenso dell’RNA nelle mutazioni troncanti, mentre le previsioni e modelling delle mutazioni missenso verranno discusse. Mappare le mutazioni missenso può essere utile per scoprire il sito cruciale della proteina Ube3a. §§ Iscr.Reg.Vol. TV 0209 - O.N.L.U.S. §§ C.C.Postale N.390310 §§ IBAN – IT 13 Y 02008 12011 000005467786 §§ ORGANIZZAZIONE SINDROME DI ANGELMAN Via Bressa n° 8 31100 TREVISO Tel. 0422411132 Fax.0422319571 C.F.94047800266 http://www.sindromediangelman.org E mail: [email protected] Il ruolo dell’UBE3A nei modelli della Sindrome di Angelman: la regolazione dell’omeostasi della proteine Ugo Mayor, Ph.D. (Spagna) I livelli dell’ubiquitina E3 ligasi (UBE3A) sono critici per il corretto sviluppo e funzionamento del cervello. La Sindrome di Angelman nasce da una carenza di questa proteina nel cervello. Tuttavia, la ricerca sta ancora indagando su quali proteine siano regolate dall’UBE3A nel cervello. Facendo uso di una tecnologia innovativa per l’isolamento, l’identificazione e la validazione dei substrati dell’ubiquitinazione in un modello di Drosophila abbiamo individuato la diretta ubiquitinazione da parte dell’Ube3a di Rpn10, un fattore shuttle (navetta) del proteasoma, e tre altre proteine. Solo l’Rpn10 è diretto verso la degradazione dopo l’ubiquitinazione da parte dell’Ube3a e ciò ci suggerisce che la degradazione può non essere l’unico effetto dell’azione di Ube3a sui suoi substrati. Inoltre, abbiamo individuato l’interazione genetica in vivo tra l’Ube3a e la parte Cterminale dell’Rpn10. La sovra espressione di queste proteine porta ad una accumulo delle proteine ubiquitinate, cosa che evidenzia ulteriormente l’interazione a livello biochimico ottenuta nelle cellule neuronali. Tramite il nostro topo bioUb recentemente sviluppato, utilizzato qui per caratterizzare i target dell’ubiquitinazione per una specifica E3 ligasi nel contesto dell’intero organismo, stiamo attualmente progettando di caratterizzare i meccanismi molecolari interrotti nella Sindrome di Angelman. Utilizzare le cellule staminali umane pluripotenti indotte per creare un modello per la Sindrome di Angelman Stormy J. Chamberlain (USA) Mentre tanto si può apprendere ed è già stato appreso dai modelli di topo della Sindrome di Angelman (SA), ci possono essere delle differenze tra topi e umani che possono non venire considerate se ci si focalizza unicamente sui modelli di topo. Abbiamo generato cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) da individui affetti da SA. Le iPSC, che sono a livello funzionale equivalenti alle cellule staminali embrionali umane, possono essere convertite in neuroni. Così, possiamo studiare la SA nei neuroni umani vivi che crescono in vitro su piastra. Stiamo utilizzando questi neuroni con SA con tre principali scopi: 1) capire come si stabilisce l’imprinting §§ Iscr.Reg.Vol. TV 0209 - O.N.L.U.S. §§ C.C.Postale N.390310 §§ IBAN – IT 13 Y 02008 12011 000005467786 §§ ORGANIZZAZIONE SINDROME DI ANGELMAN Via Bressa n° 8 31100 TREVISO Tel. 0422411132 Fax.0422319571 C.F.94047800266 http://www.sindromediangelman.org E mail: [email protected] dell’Ube3anel neurone, 2) capire i cambiamenti nell’espressione del gene neuronale che accompagna la SA, e 3) testare potenziali terapie per la SA. Verso una terapia per la Sindrome di Angelman mediante il knockdown di un RNA repressivo non codificante Arthur L. Beaudet, M. D. (USA) La Sindrome di Angelman (SA) è una grave patologia del neurosviluppo causata dalla mancanza materna del gene imprinting UBE3A. Nonostante i meccanismi molecolari della mancanza del gene materno siano vari, tutti i pazienti affetti da SA portano almeno una copia dell’UBE3A paterno, che è silenziata, ma intatta. Il nostro obiettivo è correggere il livello di espressione dell’UBE3A attivando l’allele paterno silenziato come terapia per la SA. L’UBE3A-ATS è il transcript antisenso dell’UBE3A che regola negativamente la sua espressione. Troncando questo RNA antisenso nei topi, abbiamo mostrato che l’eliminazione di Ube3a-ATS è sufficiente per attivare una espressione dell’Ube3a paterno e recuperare i difetti nel fenotipo del modello di topo con SA, inclusi i problemi motori, il deficit cognitivo e il ridotto potenziamento a lungo termine nei neuroni. Per ripristinare i livelli di Ube3a nella SA, abbiamo cercato di attivare l’Ube3a paterno tramite un knockdown di Ube3A-ATS con oligonucleotidi antisenso (ASO). Tramite screening su neuroni coltivati in vitro, abbiamo identificato con successo alcuni ASO che possono attivare completamente l’Ube3a paterno nei topi. A differenza dal trattamento con inibitori della topoisomerasi, gli ASO sono specifici e producono un effetto minimo sui geni paterni espressi nelle vicinanze Snrpn, Snord115 e Snord116. Abbiamo poi testato gli effetti degli ASO in vivo tramite iniezioni intracerebroventricolari. Se paragonati agli animali trattati con PBS, i topi trattati con gli ASO mostrato un knockdown significativo dell’Ube3a-ATS e una attivazione dell’Ube3a paterno nella corteccia e in altre regioni del cervello quattro settimane dopo l’iniezione, cosa che suggerisce che gli ASO funzioni attivamente in vivo. Gli attuali studi mirano a fornire ulteriori dettagli nella visione meccanicistica della funzione repressiva degli Ube3a-ATS, a raggiungere un miglioramento fenotipico nel modello di topo con §§ Iscr.Reg.Vol. TV 0209 - O.N.L.U.S. §§ C.C.Postale N.390310 §§ IBAN – IT 13 Y 02008 12011 000005467786 §§ ORGANIZZAZIONE SINDROME DI ANGELMAN Via Bressa n° 8 31100 TREVISO Tel. 0422411132 Fax.0422319571 C.F.94047800266 http://www.sindromediangelman.org E mail: [email protected] SA somministrando gli ASO al sistema nervoso centrale ed a identificare ASO specifici per gli esseri umani utili nel trattamento della SA. Reazioni selettive dell’UBE3A in un modello di topo con Sindrome di Angelman David Segal, Ph.D. (USA) La Sindrome di Angelman è causata da una perdita dell’espressione dell’UBE3A materno nei neuroni del sistema nervoso centrale. Il nostro obiettivo è riattivare l’UBE3A paterno, che è silenziato a causa dell’espressione del trascript di un UBE3A-AT antisenso. Stiamo facendo uso di Fattori di Trascrizione Artificiali (ATF) di tipo zinc-finger, che possono essere programmati per legare un sito specifico del DNA. Attaccandosi a un dominio di attivazione o di repressione, gli ATF possono rispettivamente aumentare o sopprimere l’attività di trascrizione. Un repressore ATF progettato per silenziare l’Ube3a-ATS è stato descritto, esso è in grado di essere iniettato mediante iniezione intraperitoneale come proteina purificata, attraversare la barriera ematoencefalica e attivare l’espressione dell’Ube3a nei neuroni di un modello di topo della Sindrome di Angelman. Verranno discussi il nostro attuale progresso e i nostri progetti per il futuro sviluppo di questo approccio. Trial clinici con Leovodopa applicati alla Sindrome di Angelman: obiettivi, metodologia, criteri di valutazione e follow-up Perrine Charles, M. D., Ph.D. (Francia) La Sindrome di Angelman è una patologia genetica del neurosviluppo caratterizzata da gravi problemi di apprendimento, atassia, attacchi epilettici (con un caratteristico elettroencefalogramma) e un contegno felice per la quale al momento non esiste un trattamento specifico. I modelli di animali ci permettono meglio di capire la fisiopatologia della malattia. Nei topi eterozigoti con una mutazione di Ube3a ereditaria materna che riproduce fedelmente la patologia umana: • I deficit motori possono essere attribuiti alla disfunzione della via Nigrostriatale (Mulherkar et al, 2010) §§ Iscr.Reg.Vol. TV 0209 - O.N.L.U.S. §§ C.C.Postale N.390310 §§ IBAN – IT 13 Y 02008 12011 000005467786 §§ ORGANIZZAZIONE SINDROME DI ANGELMAN Via Bressa n° 8 31100 TREVISO Tel. 0422411132 Fax.0422319571 C.F.94047800266 http://www.sindromediangelman.org E mail: [email protected] • I deficit comportamentali sono correlati alla attività disregolata del sistema della dopamina (diminuzione del rilascio di dopamina nella via Nigrostriatale e aumento di rilascio di dopamina nella via Mesolimbica) (Riday et al, 2012) • La regolazione sbagliata di CAMKII è una delle cause molecolari per i deficit neurocomportamentali (Weeber et al, 2003) • I deficit neurologici possono essere recuperati da una riduzione della fosforilazione inibitoria di alphaCAMKII • Il trattamento a base di Levodopa è anche in grado di normalizzare l’autofosforilazione di alphaCAMKII (Picconi et al, 2004) Inoltre, nel 2001 Harbord ha riportato che il Parkinsonismo in due adulti con la Sindrome di Angelman rispondeva alla Levodopa. Le caratteristiche extrapiramidali non erano dovute ai farmaci e sono state drasticamente migliorate con la terapia a base di Levodopa. Queste scoperte possono portare allo sviluppo di nuove prospettive terapeutiche per la Sindrome di Angelman. Con l’augurio che la realizzazione di questi propositi possa portare serenità nell’affrontare le problematiche giornaliere, vi saluto affettuosamente. Treviso 24 Ottobre 2014 §§ Iscr.Reg.Vol. TV 0209 - O.N.L.U.S. §§ C.C.Postale N.390310 §§ IBAN – IT 13 Y 02008 12011 000005467786 §§