prostate-ic

PROSTATE-IC
PRODUCT PROFILE
Edizione Italiana
PROSTATE-IC
code XG007
Kit ELISA per il dosaggio degli Immunocomplessi dell’antigene prostatico
specifico (PSA-IgM) nel Carcinoma Prostatico
PRODUCT PROFILE
Il Carcinoma Prostatico: caratteristiche, cause e prevenzione ............................ 4
Diagnosi del Carcinoma Prostatico ........................................................................ 4
Prostate-IC ELISA Kit............................................................................................... 6
Referenze ................................................................................................................. 7
Prostate-IC - Product Data Sheet............................................................................ 8
3
Il Carcinoma Prostatico:
caratteristiche, cause e
prevenzione
Il carcinoma della prostata è oggi il tumore più diffuso nella
popolazione maschile ed è tra le principali cause di morte per
tumore. Pur non presentando una letalità particolarmente
elevata rispetto agli altri tumori, con una probabilità di
sopravvivenza superiore al 90% in caso di diagnosi positiva, il
costante aumento dell’incidenza, sia nelle popolazioni ad alto
che a basso rischio, permette di spiegare l’elevato numero di
decessi. La maggior parte di questi decessi dipende da
diagnosi tardive ed una diagnosi precoce può più che in altri
tumori determinare la differenza in termini di guarigione.
Il 95% dei tumori alla prostata sono adenocarcinomi, cioè
originano dalle cellule ghiandolari secretorie e la loro
evoluzione è influenzata dall'assetto ormonale del paziente. Il
restante 5% consiste di sarcomi, linfomi, carcinomi delle cellule
squamose e metastasi da altri siti tumorali. Nella maggioranza
dei casi la zona da cui si origina la neoplasia è la regione
periferica della ghiandola prostatica. La zona periferica non è a
contatto diretto con le vie urinarie ed è per questo che la
sintomatologia è pressoché assente negli stadi iniziali e può
peggiorare invece solo negli stadi avanzati della malattia,
quando cioè vengono coinvolti altri organi (1).
La classificazione del tumore alla prostata si effettua
attraverso il sistema TNM (Tumor Node Metastasis), ma il
sistema più utilizzato per la gradazione dell’adenocarcinoma
prostatico rimane la classificazione di Gleason. Questo metodo
può essere impiegato solamente con materiale di tipo bioptico
e consiste nella somma di due diversi pattern di crescita
tumorale, il pattern principale (predominante) e il secondario
(secondo più comune), e viene loro assegnato un punteggio da
1 a 5, indicando con 1 l'aspetto più differenziato e con 5 quello
meno differenziato. Il punteggio di Gleason comprende i valori
sulla scala da 2 a 10, dove 2 rappresenta la forma meno
aggressiva e 10 la forma più aggressiva.
Si calcola che un uomo su cinque sia a rischio di tumore alla
prostata nel corso della sua vita; questa percentuale varia in
numerosi casi:
• il rischio raddoppia nel caso di un parente stretto che abbia
manifestato la malattia, quintuplica con due parenti stretti
colpiti, con tre il rischio è del 97%.
• la popolazione nera presenta un’incidenza maggiore del 60%
rispetto a quella bianca e il doppio della letalità.
• uomini con un indice di massa corporea superiore a 32,5
(obesità) hanno un rischio maggiore del 33% rispetto alla
popolazione normale.
L'età avanzata (il PCa colpisce maggiormente sopra i 55 anni),
l’ereditarietà e la presenza di ormoni androgeni biologicamente
attivi in circolo e nel tessuto prostatico rappresentano i fattori
causali più rilevanti del carcinoma prostatico.
Non vi è dubbio tuttavia che, come per la maggior parte dei
tumori solidi, l'eziologia del carcinoma prostatico sia
multifattoriale e sia il risultato di una complessa interazione di
fattori genetici ed ambientali con l'età e lo stato ormonale dei
soggetti a rischio.
Il testosterone è strettamente legato allo sviluppo della
prostata e sembra che una produzione troppo elevata favorisca
il passaggio da una fase istologica ad una fase clinica del
tumore (2).
Secondo alcuni studi, anche pazienti sottoposti in precedenza
a vasectomia o con una storia clinica di iperplasia prostatica
benigna sono soggetti a un più elevato rischio di contrarre il
cancro. Inoltre, sono stati condotti diversi studi sulle differenze
tra fattori ambientali diversi per ricercare gli agenti eziologici
del tumore alla prostata; sembra che inquinanti, fattori
4
dietetici, fumo, alcolici, rapporti sessuali a rischio di infezioni,
malattie veneree e fattori ormonali siano tutti implicati nello
sviluppo della neoplasia (3-8).
Mentre non è ovviamente possibile interferire con i fattori
genetici, esiste la possibilità, almeno teorica, di ridurre
l'esposizione ai fattori ambientali che favoriscono lo sviluppo
del carcinoma prostatico, riducendo così l'incidenza di questa
malattia.
L’aumento del rischio provocato dalla maggior assunzione di
lipidi è, probabilmente, legato all’aumento della produzione del
testosterone ed alla diminuzione dell’assorbimento di vitamina
A. La vitamina A, a sua volta, ha un ruolo contraddittorio: pare,
infatti, che la vitamina A di origine vegetale abbassi il rischio di
tumore, mentre quella di origine animale addirittura lo
aumenti. Questo è in accordo con le differenze di incidenza fra
occidente ed estremo oriente, dove la vitamina A assunta è
fondamentalmente di origine vegetale. La bassa incidenza di
carcinoma prostatico nelle popolazioni asiatiche potrebbe
pertanto essere messa in relazione con una dieta a basso
contenuto lipidico e ad alto contenuto in fibre e fitoestrogeni,
che a loro volta potrebbero svolgere un ruolo protettivo (3-9).
Diagnosi del Carcinoma Prostatico
Attualmente, tra i diversi metodi diagnostici per il carcinoma
prostatico che presentano una certa efficacia esiste il
problema della specificità diagnostica. Questo problema
rappresenta un impedimento alla possibilità di pianificare uno
screening totale di popolazione che, di fatto, ridurrebbe
ipoteticamente a zero i decessi causati da questa malattia.
Nella pratica clinica si utilizzano diversi esami per una corretta
diagnosi del tumore, tra cui il dosaggio dell’antigene prostatico
specifico (PSA), l'esplorazione rettale (DRE) e l'ecografia
prostatica trans-rettale.
L’esito di uno o più di questi esami può indurre nel medico il
sospetto di una neoplasia e in questo caso la
raccomandazione è di eseguire una biopsia prostatica
ecoguidata sulle zone sospette o random, qualora non sia stata
individuata una zona specifica.
L’esplorazione rettale
L’esplorazione rettale (DRE) è l'accertamento indispensabile
per lo studio di qualsiasi patologia alla prostata. E’ il primo
approccio obiettivo del paziente con disturbi minzionali riferibili
alla prostata.
La DRE fa parte di una regolare valutazione del paziente ed
insieme alla valutazione del livello di PSA rappresenta il criterio
clinico discriminante per decidere sulla opportunità di eseguire
una biopsia (10).
I valori di sensibilità e di specificità dell’esplorazione rettale
non sono ottimali principalmente perché con la DRE si riescono
ad apprezzare solo tumori che originano nella zona periferica
della ghiandola, che rappresentano comunque il 70-80% dei
carcinomi totali (11).
Nel 18% dei casi il carcinoma prostatico viene rilevato
solamente attraverso un’esplorazione rettale sospetta,
indifferentemente dal livello del PSA.
In conclusione, ai vantaggi della semplicità e della non
invasività, la DRE, presa isolatamente, contrappone gli
svantaggi della variabilità soggettiva e dell'impossibilità di
apprezzare l'intera prostata.
L’ecotomografia transrettale
L'ecografia prostatica trans-rettale (TRUS) è un banale esame
ecografico che permette uno studio dettagliato della prostata.
La TRUS permette di misurare in maniera precisa il volume
della prostata e di visualizzarne la morfologia, l'aspetto
ecografico interno, nonché quello delle strutture adiacenti.
Essa è in grado di documentare l'aumento volumetrico della
ghiandola, la presenza di adenoma intraprostatico, i segni di
infiammazione sia acuta che cronica ed eventuali zone
sospette per neoplasia prostatica (12).
Attualmente, per la bassa sensibilità e specificità, la TRUS ha
un ruolo marginale sia nella diagnosi di carcinoma che nella
vigilanza della malattia in fase avanzata. Il suo ruolo è, al
contrario, insostituibile nell'esecuzione di biopsie per ottenere
una conferma istologica di un sospetto carcinoma della
prostata.
La biopsia
La biopsia viene eseguita in tutti i casi in cui vi sia il sospetto di
neoplasia prostatica alla DRE, alla TRUS o nel caso vi sia una
variazione sospetta del livello di PSA. In genere, viene eseguita
per via transperineale o transrettale, quasi sempre sotto guida
ecografica. La biopsia prostatica viene raccomandata anche
nei casi in cui la diagnosi di carcinoma appare ovvia per diversi
motivi (quadro palpatorio tipico con estensione extracapsulare,
PSA elevato, con o senza metastasi ossee) per avere,
comunque, la definizione dell'istotipo e del grading, elementi
necessari per la prognosi e la previsione di ormonosensibilità
(13).
La biopsia è però una procedura altamente invasiva che può
provocare numerose complicazioni (13). Pertanto è
fondamentale migliorare l’accuratezza dei saggi diagnostici
non invasivi come nel caso del dosaggio dei biomarcatori
tumorali così da ridurre il numero delle biopsie.
Il test del PSA
Il test del PSA misura i livelli di antigene prostatico specifico nel
circolo sanguigno. In presenza di cancro, i valori del PSA
aumentano perché le cellule ghiandolari tumorali producono
molto più PSA delle cellule normali. Il valore sopra il quale deve
essere destata l’attenzione del medico è di 4 nanogrammi per
millilitro (ng/mL) in quanto possibile segno di patologia
neoplastica (14-17).
Il dosaggio sierologico dei livelli di PSA ha rivoluzionato la
diagnosi del carcinoma prostatico, ma ha anche aumentato i
problemi di sovradiagnosi a causa dell’inadeguata accuratezza
diagnostica del marcatore. Infatti, il PSA è un marcatore
organo-specifico ma non tumore-specifico poiché i livelli
circolanti di PSA sono elevati anche in caso di ipertrofia
prostatica benigna (BPH), di infiammazioni batteriche della
prostata, e in caso di manipolazione o trauma prostatico.
Nel tentativo di ottimizzare l’accuratezza diagnostica del test
del PSA, in particolare per valori di PSA compresi tra 4 e 10
ng/mL, cioè la cosiddetta “zona d’ombra” in cui si ha una
sostanziale sovrapposizione dei risultati tra malati di cancro e
pazienti affetti da BPH (14), sono stati proposti diversi altri
parametri correlati al PSA, quali la concentrazione del PSA
rispetto al volume ghiandolare (PSA density), la velocità di
crescita annuale del PSA (PSA velocity), il rapporto del PSA
rispetto all'età del paziente ed il rapporto tra PSA libero e PSA
totale, tuttavia l’utilizzo di questi parametri diagnostici non ha
portato quel miglioramento significativo della diagnosi del
carcinoma prostatico tale da ridurre il numero di biopsie
diagnostiche da effettuare (15-17).
Densità di PSA
La densità del PSA esprime il rapporto fra il livello sierico di
PSA e le dimensioni misurate ecograficamente della ghiandola
prostatica, e si basa sul fatto che la quantità di PSA prodotto
per grammo di tessuto è molto maggiore nel cancro che non
nell'ipertrofia. Tuttavia, la sua interpretazione è complicata da
alcune variabili: il differente rapporto, in soggetti diversi, fra
tessuto ghiandolare (che produce PSA) e stroma (che non
produce PSA), il possibile errore nella determinazione
ecografica del volume prostatico e il diverso rapporto, con l'età,
fra l'incremento del PSA e l'incremento delle dimensioni della
ghiandola (14, 15).
Velocità del PSA
Un altro criterio diagnostico sviluppato è il tasso d'incremento
del livello sierico di PSA nel tempo. Sembra, infatti, che la
variazione quantitativa su base annuale tra prelievi seriali di
uno stesso paziente sia più significativa del valore assoluto del
PSA nella diagnosi differenziale tra cancro ed ipertrofia. Nel
cancro della prostata, l'incremento del PSA di solito supera
0,75 ng/ml per anno o comunque mostra incrementi annui del
20% rispetto ai valori iniziali.
Va tuttavia tenuto presente che questo approccio richiede un
buon controllo della variabilità analitica del metodo e la
conoscenza delle fluttuazioni intraindividuali del marcatore non
legate alla presenza di malattia. La PSA velocity è pertanto un
approccio diagnostico interessante dal punto di vista biologico,
che però necessita di un'accurata standardizzazione prima di
un possibile impiego routinario. Per adottare questo criterio,
sono necessarie ripetute determinazioni del PSA,
preferibilmente ad intervalli trimestrali, per un periodo minimo
di un anno, ma preferibilmente per diversi anni. È ovvio che
tale principio non consente conclusioni in tempi brevi (15).
Rapporto PSA libero/totale
Si ritiene che la differente produzione da parte di cellule
epiteliali prostatiche e cellule epiteliali cancerose di PSA libero
(fPSA) sia la causa delle differenze riscontrate tra sieri di
uomini con IPB e uomini con tumore. Un livello di PSA totale
(tPSA) elevato, unito a una bassa percentuale di fPSA, è indice
di un tumore più aggressivo.
l’uso del fPSA ha portato a un miglioramento della specificità
nel range 4-10 ng/mL con una riduzione delle biopsie non
necessarie. Il cut-off usato è una percentuale di fPSA circa del
25%.
I dosaggi commerciali per il fPSA presentano tuttavia ancora un
livello non soddisfacente di standardizzazione. I risultati sono
quindi parzialmente metodo-dipendenti.
Bisogna inoltre tenere presente che il PSA libero non va usato
da solo, ma va sempre dosato in associazione con il PSA totale
ed espresso in rapporto a quest'ultimo. Il valore dato da questo
rapporto deve essere usato solo in fase di approccio
diagnostico; non deve essere usato nella stadiazione, nel postoperatorio, nel monitoraggio a lungo termine e nel
monitoraggio della terapia (radioterapia, endocrinoterapia,
chemioterapia), in quanto non esistono evidenze che ne
supportino una qualche efficacia in tali scenari clinici. In
aggiunta, il rapporto PSA libero/PSA totale va utilizzato solo nei
casi di valori di PSA totale compresi fra 2.5 e 20.0 ng/ml.
Infatti, nei casi con PSA <2.5 o >20 ng/ml la diagnosi è più
facile, mentre il rapporto PSA libero/PSA totale oltre questi
valori ha problemi d'interpretazione che devono ancora essere
valutati (16,17).
PSA-IgM
Recentemente è stato scoperto che nel siero dei pazienti affetti
da certe forme neoplastiche, i marcatori tumorali classici
possono essere rilevati oltre che in forma libera anche
sottoforma
di
immunocomplessi
associati
alle
immunoglobuline di classe M, (IgM) (18).
Le IgM sono considerate la principale componente
dell’immunità innata, poiché sono capaci di legarsi ad un
ampio spettro di antigeni tumorali . E’ stato stabilito che le IgM
hanno un ruolo importante nella prima linea di difesa contro gli
antigeni infettivi, nella regolazione e proliferazione delle cellule
immuni e nell’immunosorveglianza delle cellule tumorali.
Nel siero di numerosi pazienti con carcinoma prostatico è stata
dimostrata la presenza del PSA oltre che in forma libera anche
5
in forma immunocomplessata alle IgM (PSA-IgM). L’utilizzo
della
determinazione
dei
livelli
circolanti
degli
immunocomplessi PSA-IgM per la diagnosi del carcinoma alla
prostata è stato recentemente proposto, poiché tale dosaggio
si è dimostrato più accurato comparato all’analisi del PSA
totale (18-23).
Prostate-IC ELISA Kit
Kit
ELISA
per
il
dosaggio
degli
immunocomplessi dell’antigene prostatico
specifico (PSA-IgM) nel Carcinoma Prostatico
Xeptagen ha sviluppato Prostate-IC, saggio ELISA per il
dosaggio di PSA circolante sottoforma di immunocomplessi con
le IgM (PSA-IgM).
In uno studio prospettico il kit Prostate-IC è stato utilizzato per
analizzare i livelli sierici di PSA-IgM mentre in parallelo sugli
stessi campioni con un kit commerciale è stato determinato il
PSA totale. La popolazione studiata era composta da un
campione di 50 sieri di pazienti con cancro alla prostata, da 51
sieri di pazienti con iperplasia prostatica benigna e da 15 sieri
di donatori sani utilizzati come popolazione di controllo (18).
L’analisi comparativa ha evidenziato il vantaggio in termini di
sensibilità (SE) e specificità (SP) del dosaggio del PSA-IgM
rispetto alla determinazione di PSA totale per la diagnosi del
tumore (figura 1).
I livelli di PSA-IgM sono risultati sempre al di sotto del valore di
cut off di 145.1 AU/mL nel gruppo di donatori sani, mentre nel
gruppo dei tumori erano superiori al cut off in 20 casi dei 50
analizzati (SE = 40%) e nel gruppo degli iperplastici solo in 6
dei 51 campioni analizzati (SP = 88%). I livelli di PSA erano
elevati nel gruppo dei pazienti con cancro alla prostata in 44
casi, con cut-off di 4 ng/mL (SE = 88%), e in 11 campioni (SE =
22%), con cut-off di 10 ng/mL, ma con valori di specificità del
test inadeguati. Infatti, nel gruppo dei pazienti affetti da
iperplasia benigna il test del PSA ha dato esito positivo in 49
dei 51 campioni analizzati con cut off di 4 ng/mL (SP = 4%) e
in 15 campioni con cut-off di 10 ng/mL (SP = 71%).
I livelli sierici di PSA-IgM sono risultati al di sopra del cut off, nel
43% dei pazienti con tumore e valori di PSA compresi tra 4 e
10 ng/mL, mentre ciò non si verificava nel gruppo degli
iperplastici, dove solo il 12% pazienti con BPH e valori di PSA
compresi tra 4 e 10 ng/mL è risultato positivo anche al test del
PSA-IgM.
Biomarcatore
Sens
Spec
PPV
NPV
PSA-IgM 145,1 [AU/mL]
40%
88%
77%
60%
PSA 4 [ng/mL]
84%
4%
46%
20%
PSA 10 [ng/mL]
22%
71%
42%
48%
PSA 10 [ng/mL] or
PSA-IgM 145,1 [AU/mL]
60%
63%
61%
62%
4 ng/mL < PSA
PSA < 10 ng/mL e PSA-IgM
43%
88%
76%
55%
Tabella 1: Confronto degli indici di Sensibilità (Sens), Specificità (Spec),
PPV (valore predittivo positivo) e NPV (valore predittivo negativo) di
PSA-IgM nei pazienti con carcinoma prostatico (n=50) e pazienti con
iperplasia benigna (n=51).
6
Figura 1: Box-plot dei livelli sierici di PSA e PSA–IgM nei pazienti con
carcinoma prostatico (PCa) e iperplasia prostatica benigna (BPH). Il box
rappresenta il primo ed il terzo quartile e la linea di mezzo è la
mediana
La combinazione dei risultati dei due biomarcatori PSA-IgM e
PSA migliora significativamente la sensibilità diagnostica, la
quale è passata dal 22% del test del PSA con cut off di 10
ng/mL (PSA 10) al 60% ottenuto con la combinazione dei test
(PSA-IgM e PSA 10). I due test hanno, quindi, dimostrato un
buon grado di complementarietà nel loro valore diagnostico,
motivo per cui la combinazione di entrambi si è rivelata il
migliore approccio possibile (19). In tabella 1 sono riportati gli
indici diagnostici ottenuti con il test del PSA, con il test del PSAIgM e con la combinazione PSA-IgM - PSA 10. In tabella 1 sono
anche, riportati i valori forniti dall’approccio combinato del test
del PSA con valori compresi nell’intervallo tra 4 e 10 ng/mL e
di PSA-IgM.
La combinazione dei livelli sierici di PSA totale e PSA-IgM è
stata studiata più approfonditamente in studi di validazione
condotti in diversi centri Italiani. Il dosaggio del PSA IgM si è
dimostrato più accurato per l’identificazione del carcinoma
prostatico nella malattia organo confinata rispetto all’analisi
dei livelli circolanti di PSA totale, in particolare in questi studi
sono stati confermati i valori di sensibilità e specificità misurati
per il PSA-IgM per la discriminazione dei pazienti con tumore
organo confinato dai pazienti con iperplasia prostatica benigna.
L’associazione dei due test è risultata sempre il miglior
approccio
diagnostico
rispetto
ai
test
considerati
singolarmente, permettendo di ottenere la migliore distinzione
dei pazienti con tumore da quelli con IPB, aumentando fino ad
un 90% la specificità diagnostica e consentendo quindi la
riduzione del numero di biopsie prostatiche negative (20-23).
18.
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7
Prostate-IC - Product Data Sheet
USO
Prostate-IC è un test immunoenzimatico del tipo ELISA (Enzyme
Linked Immunosorbent Assay) per il dosaggio degli
immunocomplessi dell’antigene prostatico specifico (PSA-IgM)
nel Carcinoma Prostatico.
SPIEGAZIONE DEL TEST
Prostate-IC appartiene a una nuova generazione di dispositivi
diagnostici in vitro basato sulla rilevazione di PSA sottoforma di
immunocomplesso circolante (PSA-IgM). Prostate-IC è un
dosaggio ELISA specifico e sensibile per la diagnosi del
carcinoma prostatico, realizzato per misurare PSA-IgM nel siero
dei pazienti. La concentrazione di PSA-IgM è espressa in Unità
Arbitrarie (AU)/mL usando un calibratore specifico come
riferimento. Studi scientifici hanno dimostrato che la
determinazione dei livelli di PSA-IgM nel siero dei pazienti con
carcinoma prostatico permette di rilevare il tumore con una
maggiore sensibilità rispetto al test del PSA, test sierico di
riferimento del tumore alla prostata, senza pregiudicare la
specificità (1-3). Inoltre, è stato dimostrato che i livelli di PSA e
PSA-IgM circolanti non si sovrappongono indicando che PSAIgM è un marcatore complementare del carcinoma prostatico e
che l’analisi di entrambi i biomarcatori può migliorare
l’accuratezza diagnostica del tumore prostatico (1-5).
PRINCIPIO DEL TEST
Prostate-IC è un kit per il dosaggio di PSA-IgM nel siero dei
pazienti con carcinoma prostatico attraverso una metodica
ELISA altamente specifica e sensibile. Tutte le incubazioni sono
condotte in una scatola chiusa contenente carta umida sul
fondo in modo da prevenire l’evaporazione. I calibratori ed i
campioni sono incubati simultaneamente. L’immunocomplesso
viene determinato mediante aggiunta di un anticorpo
secondario coniugato con perossidasi e aggiunta del substrato
e del cromogeno appropriati. Il colore che si sviluppa è
proporzionale alla quantità di analita presente nel campione.
REAGENTI E MATERIALI FORNITI
XG007-PL: una piastra multistrip da 96 pozzetti, sensibilizzata
con anticorpo di coniglio anti-PSA.
XG007-Calibratore: due vial di calibratore liofilizzato (contiene
proteine di origine umana).
XG-EA: soluzione dell’anticorpo secondario coniugato con
l’enzima. Tappo verde.
XG-CH3: soluzione cromogena pronta all’uso, contiene TMB
(3,3’,5,5’-Tetrametilbenzidina) 10 mL.
XG-ST3: soluzione di arresto pronta all’uso, contiene HCl 1N,
10 mL.
XG-DB5: tampone di diluizione concentrato 5X, 10 mL,
contiene Proclin come conservante. Dopo diluizione la
soluzione di lavoro contiene 1% BSA e 0.05% Tween 20.
XG-WB2: tampone di lavaggio da ricostituire in acqua di grado
reagente. Dopo ricostituzione il tampone contiene lo 0.05% di
Tween 20 in PBS.
STRUMENTAZIONE RICHIESTA MA NON FORNITA
Pipette di precisione con puntali monouso
Washer per micropiastre
Lettore per micropiastre con filtri a 450 o 650 ± 20 nm
Acqua di grado reagente
CONSERVAZIONE E STABILITÀ
La piastra XG007-PL con l’anticorpo specifico pre-adsorbito, il
cromogeno XG-CH7, il substrato enzimatico XG-ST3, il tampone
di diluizione XG-DB5 e il tampone di lavaggio XG-WB2 sono
8
stabili per 12 mesi a 4°C. Le soluzioni XG-CH3, XG-DB5 e XGWB2 devono essere usate entro un mese e conservate a 4°C.
Conservare il cromogeno XG-CH3 al buio.
La soluzione standard XG007-IC e l’anticorpo secondario
coniugato XG-EA sono stabili per 12 mesi a -20°C.
Evitare cicli di congelamento e scongelamento ripetuti.
MATERIALE POTENZIALMENTE PERICOLOSO
La soluzione dello standard XG007-Calibratore contiene
proteine di origine umana. Tale materiale è stato, tuttavia,
testato mediante metodi approvati per la presenza di anticorpi
diretti verso il virus dell’HIV, verso il virus dell’HCV e per la
presenza dell’antigene di superficie del virus dell’epatite B
(HBsAg), ed è risultato negativo. Dal momento che nessun test
può offrire la completa sicurezza che i virus HIV, HBV, HCV, ed
altri agenti infettivi siano assenti, tutti i reagenti di origine
umana devono essere considerati potenzialmente infettivi. Di
conseguenza si raccomanda fortemente di maneggiare questi
reagenti ed i campioni di origine umana in accordo con le
Procedure Standard OSHA per i Patogeni presenti nel sangue
(24). La buona pratica di laboratorio e livelli di sicurezza 2
devono essere usati per materiali che contengono o per i quali
si sospetti contenere agenti infettivi (7-9).
PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
Il siero rappresenta la tipologia di campione consigliata per
l’esecuzione del test Prostate-IC.
I campioni di siero dovrebbero essere prelevati in condizioni
asettiche ed in modo tale da evitare fenomeni di emolisi.
I campioni possono essere conservati a 2-8°C se il saggio è
effettuato nelle 24 ore che seguono il prelievo dei campioni, in
caso contrario i campioni devono essere congelati. Allo
scongelamento, il campione deve essere delicatamente agitato
per assicurare consistenza e omogeneità nei risultati. Evitare
rigorosamente cicli ripetuti di congelamento e scongelamento. I
campioni che mostrano sedimento, eritrociti o torbidità devono
essere centrifugati e chiarificati prima di eseguire il test.
INSTRUZIONI PER L’USO
NOTE TECNICHE
• Permettere ai campioni ed ai reagenti di raggiungere la
temperatura ambiente prima di eseguire il test. Non
scongelare i campioni o i reagenti a bagnomaria.
• Agitare delicatamente i campioni ed i reagenti prima
dell’uso.
• Evitare che si formi schiuma all’interno dei contenitori che
alloggiano i reagenti. Evitare l’esposizione dei reagenti a
fonti di calore eccessivo o di luce durante la conservazione e
le incubazioni.
• Evitare di toccare i pozzetti della piastra prima e dopo aver
aggiunto campioni e/o reagenti.
• Campioni e standard dovrebbero essere analizzati in
duplicato.
• Eseguire un curva standard per ciascun test.
• Usare solo strip pre-adsorbite e provenienti dallo stesso
batch per ciascun test. Non mescolare reagenti provenienti
da kit appartenenti a lotti diversi.
• Eseguire le incubazioni in una scatola chiusa e contenente
carta umida, allo scopo di prevenire l’eccessiva
evaporazione.
PREPARAZIONE DEI REAGENTI
• Ricostituire il calibratore XG007-Calibratore liofilizzato con
440 μL di acqua di grado reagente.
ESECUZIONE DEL TEST
1. Preparare i reagenti come descritto sopra.
2. Allestire la piastra con un numero sufficiente di pozzetti
che comprendano gli standard ed i campioni.
3. Rimuovere le strip in eccesso e conservarle nell’apposita
busta di conservazione.
4. Dispensare 100 µL/well dei calibratori standard (in
duplicato) partendo dalla soluzione ricostituita ed
eseguendo direttamente nella piastra le diluizioni seriali di
un fattore 2, ottenendo una curva di calibrazione a sette
punti. Usare il tampone di diluizione XG-DB5 come
diluente. Dispensare, in duplicato, 100 µL/well del
tampone di diluizione XG-DB5 nei pozzetti relativi al
controllo negativo (Bianco).
5. Dispensare 100 µL/well della diluizione 1:50 relativa ai
campioni (in duplicato). Usare il tampone di diluizione
XG-DB5 come diluente.
6. Incubare 1h a temperatura ambiente.
7. Lavare 6 volte con il tampone di lavaggio XG-WB2 (300
µL/well).
8. Aggiungere 100 µL/well della soluzione diluita di anticorpo
secondario XG-EA.
9. Incubare 1h a temperatura ambiente.
10. Lavare 6 volte con il tampone di lavaggio XG-WB2 (300
µL/well).
11. Aggiungere 100 μL/well di soluzione cromogena XG-CH3.
Lasciar incubare al buio e leggere i valori di densità ottica
(OD) di ciascun pozzetto usando un lettore per
micropiastre equipaggiato con un filtro a 650 nm.
12. Alternativamente aggiungere 100 μL/well di soluzione di
arresto XG-ST3 e misurare i valori di OD di ciascun
pozzetto utilizzando il lettore di micropiastre equipaggiato
con un filtro a 450 nm. Leggere la colorazione della
reazione bloccata entro 1 ora.
13. Costruire la curva standard dai valori di ΔOD come
descritto nella sezione seguente: Interpretazione dei
risultati.
ELABORAZIONE DEI RISULTATI
È necessario eseguire una media delle densità ottiche ottenute
in duplicato per ciascuno dei punti dello standard e dei
campioni, e sottrarre la media delle densità ottiche relative allo
zero standard, quindi si può costruire una curva standard con i
valori ottenuti e riportati in AU/mL (vedi Fig 1). Tale
elaborazione può essere effettuata attraverso software oppure
può essere ottenuta manualmente ponendo i valori delle
assorbanze relative ai punti dello standard sull’asse delle y in
funzione delle concentrazioni, in scala logaritmica, sull’asse
delle x, e disegnando così la curva standard.
1
y = 0.0775x + 0.0285
ΔOD @450 nm
0.8
2
R = 0.9912
0.6
0.4
0.2
0
0
2
4
6
8
PSA-IgM [Au/mL]
10
12
ΔOD @450 nm
• Risospendere il tampone di diluizione XG-DB5 in 50 mL di
acqua distillata.
• Risospendere il buffer di lavaggio XG-WB2 in 500 mL di
acqua distillata.
• Preparare la quantità richiesta dell’anticorpo secondario
coniugato XG-EA diluendolo 100 volte nel tampone di
diluizione XG-DB5.
1.8
1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
y = 0.5295Ln(x) - 0.4015
2
R = 0.9987
10
100
PSA-IgM [Au/mL]
Figura 1: Intervallo di linearità di una tipica curva standard del kit Prostate-IC
dopo 15 minuti di incubazione con il substrato.
Le concentrazioni di immunocomplesso dei campioni sono lette
direttamente sull’asse delle x mediante interpolazione delle
assorbanze sulla curva standard. La concentrazione ottenuta è
moltiplicata per il fattore di diluizione del campione.
CONTROLLO DI QUALITÀ
Il coefficiente di variazione inter- ed intra-saggio è stato
determinato su 4 curve standard ed è risultato essere inferiore
al 10%.
Per una performance ottimale, l’assorbanza relativa allo zero
standard dovrebbe essere < 0.2 OD450.
Si raccomanda che ciascun laboratorio esegua il test ponendo
un proprio campione che funzioni come controllo di qualità
interno in modo da assicurare la correttezza della procedura e
dei reagenti.
INTERPRETAZIONE
Un valore di cut off di PSA-IgM di 145 AU/mL consente di
differenziare la forma maligna dalle forme non maligne (1823).
INTERVALLO DI LINEARITÀ
L’intervallo di calibrazione è compreso tra 0.7 e 45 AU/mL.
REFERENZE
1. Beneduce L, Prayer-Galetti T, Marcello Grimani Giustinian A,
Gallotta A, Betto G, Pagano F, Fassina G. Detection of
prostate-specific antigen coupled to immunoglobulin M in
prostate cancer patients. Cancer Detection and Prevention
31: 402-407, 2007.
2. Zani D, Pezzoni G, Pettenò A, Simeone C, Beneduce L,
Gallotta A, Fassina G, Cosciani Cunico S. Validazione
dell’uso di PSA e immuno-complessi
PSA-IgM nella
diagnostica della malattia prostatica organo confinata.
Congresso Nazionale (SIU), Roma, 22-28 September 2008.
3. Prayer-Galetti T, Beneduce L, Dal Moro F, Betto G, Fassina
G, Pagano F. Influenza dell’età dei pazienti, dei valori di PSA
sierico e del grado di differenziazione tumorale sui livelli
circolanti degli immuno-complessi IgM. 80° Congresso
Nazionale (SIU), Bari, September 27- October 1 2007.
4. Prayer-Galetti T, Beneduce L, Dal Moro F, Betto G, Fassina
G, Pagano F. PSA-IgM complessato (IC) un nuovo
biomarcatore per il carcinoma della prostata. 79°
Congresso Nazionale (SIU), Bologna, Italy, June 17-21
2006.
5. Beneduce L, Prayer-Galetti T, Marcello Griman Giustinian A,
Gallotta A, Fracalanza S, Betto G, Artibani W, Pagano F,
Fassina G. The occurrence of Prostate Specific Antigen-IgM
immune complexes (IC) as novel serum biomarker for
prostate cancer. 21st Annual Congress of European
Association of Urology, Paris, 05-08 April 2006. European
Urology Supplements 5 (2): 163, 2006.
6. US Department of Labor, Occupational Safety and Health
Administration, 29 CFR Part 1910.1030, Occupational
Exposure to Bloodborne Pathogens Final Rule. Federal
Register; 56 (235):64175-82, 1991.
9
7. US Department of Health and Human Services. Biosafety in
Microbiological and Biomedical Laboratories. HHS
Publication No. (CDC) 93-8395. Washington, DC: US
Government Printing Office, May 1993.
8. World Health Organization Laboratory Biosafety Manual.
Geneva: World Health Organization, 1993.
10
9. National Committee for Clinical Laboratory Standards.
Protection of Laboratory Workers from Infectious Diseases
Transmitted by Blood, Body Fluids and Tissue: Tentative
Guideline. NCCLS Document M29-T2 Villanova: NCCLS: 143, 1991.
11
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