AB WARFARIN TYPE:
Sviluppo di un test farmacogenetico per
®
il dosaggio individuale del Warfarin (Coumadin )
Elisabetta Bugin1,2, Katia Bortolozzo1, Dino Paladin1, Michela Pelloso3, Stefania Moz3,
4
3
3
Dania Bozzato , Paola Fogar , Daniela Basso , Carlo-Federico Zambon
3,4
, Mario Plebani
3,4
.
1
AB ANALITICA s.r.l, Padova, Italia
2
Dipartimento di Scienze Farmacologiche, Università degli Studi di Padova, Italia
3
Dipartimento Medicina di Laboratorio, Azienda Ospedaliera Università degli Studi di Padova, Italia
4
Dipartimento di Medicina-DIMED, Università degli Studi di Padova, Italia.
INTRODUZIONE
Il Warfarin (Coumadin®) è un anticoagulante largamente diffuso sia per la prevenzione che per il trattamento di eventi o disordini tromboembolici. Si
tratta di un farmaco molto efficace, caratterizzato però da un indice terapeutico molto ristretto e da un’ampia variabilità inter-individuale sia nel dosaggio che nella risposta terapeutica [1]. Questi aspetti rendono necessaria la personalizzazione della terapia, attualmente ottenuta a posteriori, con
aggiustamenti posologici in base a misurazioni seriali dell’INR. Durante queste fasi iniziali è particolarmente elevato il rischio di eventi trombotici o
emorragici dovuti rispettivamente a sotto- e sovra-dosaggio farmacologico [2]. Recentemente numerosi studi di associazione Genome Wide hanno messo
in luce il ruolo chiave di alcuni polimorfismi nei geni CYP2C9, CYP4F2 e VKORC1 nell’influenzare la dose di farmaco efficace nella popolazione caucasica
[3]. Nel 2011 l’FDA (Food and Drug Administration) ha revisionato il foglietto illustrativo del Coumadin® promuovendo l’identificazione delle varianti
alleliche dei geni VKORC1 e CYP2C9 attraverso i test genetici, al fine di poter personalizzare a priori il dosaggio farmacologico giornaliero [4]. L’obiettivo di questo studio è stato lo sviluppo di un test per l’identificazione dei più significativi polimorfismi associati alla risposta clinica al Warfarin.
MATERIALI E METODI
Tab.1: range di dosaggio
giornaliero raccomandato
(mg/die) per raggiungere
un INR terapeutico, se noto il dato genetico. Fonte:
updated warfarin product
label FDA-approved.
Sono stati oggetto di questo studio i polimorfismi rs9923231 nel
gene VKORC1, rs1799853 e rs1057910 nel gene CYP2C9 e rs2108622
nel gene CYP4F2, per i quali è stata validata una Multiplex PCR
combinata ad un saggio di Reverse Line Blot (mPCR/RLB). L’utilizzo di un approccio PCR-SSP (Sequence Specific Primer PCR) ha permesso l’amplificazione specifica delle sequenze target in ciascun
gene; l’efficienza e la specificità della reazione di PCR sono state
valutate mediante sequenziamento diretto. Sonde ASO (AlleleSpecific Oligonucleotide) specifiche sono state disegnate per la
detection di ciascuna variante allelica. Per facilitare la fase interpretativa è stato inoltre sviluppato un software in grado di associare al pattern di bande presente sulla strip la configurazione allelica del paziente. Al fine di valutare le performance del test sviluppato, sono stati selezionati 150 pazienti in corso di terapia con
Warfarin (target INR=2,5, dose settimanale media 31,25 mg). Tutti
i campioni, precedentemente genotipizzati con test in Real-Time
PCR, sono stati analizzati con il dispositivo AB WARFARIN TYPE.
Minore
dosaggio
Situazioni di eterozigosi
per i geni VKORC1,
CYP2C9 e CYP4F2
Maggiore
dosaggio
Fig.1: rappresentazione del
rischio di eventi avversi
(trombosi, emorragie) sulla
base della configurazione
genetica a livello dei geni
VKORC1, CYP2C9 e CYP4F2.
VKORC1 c. -1639 A/A,
CYP2C9*2*2,
CYP2C9*3*3,
CYP4F2 c.1297 C/C
VKORC1 c.-1639 G/G
CYP2C9*1*1
CYP4F2 c. 1297 T/T
Aumento del rischio emorragico
RISULTATI E CONCLUSIONI
Tutti i campioni in esame sono stati correttamente genotipizzati, dimostrando l’affidabilità del
test AB WARFARIN TYPE e la sua riproducibilità. L’utilizzo di un saggio mPCR/RLB per l’identificazione dei polimorfismi nei geni CYP2C9, CYP4F2 e VKORC1 risulta essere un metodo rapido e
conveniente per la genotipizzazione dei pazienti in corso di terapia con anticoagulanti cumarinici. In Fig.2 è mostrato un esempio del risultato ottenuto con il saggio RLB. La presenza di
una banda indica l’accensione della corrispettiva sonda specifica. Allo scopo di facilitare l'interpretazione del risultato e definire lo stato di omozigosi, eterozigosi o composto genetico del
paziente è stato creato il software interpretativo Warfarin Strip Reader.
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Valutazione configurazione allelica:
CY2C9 *1*2
CYP4F2 *1*1
VKORC1 *1*1
V
V
Dettagli valutazione:
CY2C9 c. 430 C, CY2C9 c. 430 T,
CY2C9 c. 1075 A
CYP4F2 c. 1297 C
VKORC1 c. 1639 G
12
12
Fig.3: schermata esemplificativa del software interpretativo.
BIBLIOGRAFIA
[1] Ferder NS, Eby CS, Deych E, Harris JK, Ridker PM, Milligan PE, Goldhaber SZ, King CR, Giri T, McLeod HL, Glynn RJ, Gage BF. Ability of VKORC1 and CYP2C9 to predict therapeutic warfarin dose during the initial weeks of therapy. J Thromb Haemost. 2010 Jan;8
(1):95-100. doi: 10.1111/j.1538-7836.2009.03677.x. Epub 2009 Oct 30.
[2] Sconce EA, Khan TI, Wynne HA, Avery P, Monkhouse L, King BP, Wood P, Kesteven P, Daly
AK, Kamali F. The impact of CYP2C9 and VKORC1 genetic polymorphism and patient
characteristics upon warfarin dose requirements: proposal for a new dosing regimen.
Blood. 2005 Oct 1;106(7):2329-33.
[3] Gage BF, Eby C, Johnson JA, Deych E, Rieder MJ, Ridker PM, Milligan PE, Grice G, Lenzini
P, Rettie AE, Aquilante CL, Grosso L, Marsh S, Langaee T, Farnett LE, Voora D, Veenstra
DL, Glynn RJ, Barrett A, McLeod HL. Use of pharmacogenetic and clinical factors to predict the therapeutic dose of warfarin. Clin Pharmacol Ther. 2008 Sep;84(3):326-31.
Fig.2: strip pattern ottenuto in 12 pazienti, in corso di terapia con warfarina.
[4] Takeuchi F, McGinnis R, Bourgeois S, Barnes C, Eriksson N, Soranzo N, Whittaker P, Ranganath V, Kumanduri V, McLaren W, Holm L, Lindh J, Rane A, Wadelius M, Deloukas P. A genome-wide association study confirms VKORC1, CYP2C9, and CYP4F2 as principal genetic determinants of warfarin dose. PLoS Genet. 2009 Mar;5(3):e1000433. doi: 10.1371/
