“MICROBIOLOGIA GENERALE”

“M IC R O B IO L O G IA G E N E R A L E ”
Prof. C. Mazzoni
Corso
di
Laurea
Triennale
Biotecnologie Agro- Industriali
Università di Roma “La Sapienza”
in
Appunti della lezione 15
Capitolo 12
1
Genetica del
lievito S.
cerevisiae
Paragrafo 12.6
Il lievito è un organismo eucariotico
unicellulare che appartiene al Regno
dei Funghi, divisione degli Ascomiceti.
Può riprodursi per via asessuale,
tramite gemmazione, sia per via
sessuale. La riproduzione sessuale
avviene tramite fusione di due cellule
aploidi di sesso opposto, denominate
"a" ed "α", il cui riconoscimento è
mediato da fattori proteici (feromoni)
denominati “mating factors”. Le
cellule di lievito presentano sulla loro
superficie recettori per il mating factor
di tipo opposto. Il legame del feromone
a questi recettori provoca il blocco del
ciclo cellulare e l’instaurarsi di una
forma di differenziamento che produce
cellule a forma di pera denominate
shmoos. La parte apicale dello shmoo è
il punto in cui si fonderanno le due
cellule di sesso opposto. Dopo la
plasmogamia avviene la cariogamia e
la formazione di uno zigote che dà
origine a cellule diploidi, le quali
possono, a loro volta, riprodursi per
gemmazione o, in condizioni di
carenza nutritiva, andare incontro a
sporulazione. La cellula diploide che
effettua la sporulazione va incontro a
meiosi e origina un asco che contiene
quattro spore aploidi. Quando l’asco è
maturo la sua parete lisa e vengono
rilasciate le quattro spore aploidi, due
di tipo α e due di tipo a.
La maggior parte dei lieviti presenti in
natura sono OMOTALLICI. In questi
ceppi il sesso non è stabile, ma passano
rapidamente dal sesso α al sesso a e
viceversa.
Questa interconversione avviene circa
una divisione cellulare sì e una no e
quindi molto più rapidamente di
quanto ci si potrebbe aspettare da un
meccanismo che coinvolga mutazioni
spontanee convenzionali.
L’omotallia fornisce un vantaggio
evolutivo in quanto promuove una
diploidizzazione
precoce
dei
discendenti, quindi una eventuale
mutazione
si
esprimerebbe
in
condizioni di diploidia; inoltre, i
cambiamenti di sesso che portano alla
diploidizzazione hanno il vantaggio di
condurre
ad
una
più
rapida
sporulazione in risposta a circostanza
ambientali sfavorevoli.
I ceppi utilizzati in laboratorio sono
invece ETEROTALLICI. In questi
ceppi il sesso è stabile (non si osserva
un cambiamento (switching) del
mating type nelle colture), e
consentono di seguire con facilità i
marcatori genetici. Questi ceppi sono
mutati nel gene HO, che codifica per
un’endonucleasi.
Determinazione e switch del mating
type
Le cellule α e le cellule a esprimono
rispettivamente i caratteri α e a che
sono presenti nei rispettivi loci MAT.
Nel cromosoma sono presenti due due
serbatoi, uno per i geni α (HML) e
l’altro per i geni a (HMR). HML e
HMR si trovano rispettivamente a
sinistra e a destra del locus MAT.
Nella diap. 8 è rappresentato il
modello della cassetta per i
cambiamenti di tipo coniugativo. Un
lievito che presenti nel locus MAT i
geni caratteristici del tipo α viene
indicato come MATα. Nel momento in
cui si ha la sostituzione della cassetta
(locus) α con la cassetta a, nel locus
MAT saranno presenti i geni
caratteristici del tipo a e la cellula avrà
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cambiato tipo coniugativo da MATα a
MATa.
Se analizziamo più in dettaglio i loci
MAT, HML e HMR si possono
osservare ai lati delle sequenze
codificanti, delle regioni di omologia
denominate W, X, Y e Z (diap. 9). Le
regioni X e Z sono comuni a tutti i
loci, mentre le regioni Y sono tipiche
per ogni tipo coniugativo. I geni
presenti nei loci HML e HMR sono
silenziati delle proteine SIR che,
tramite modificazioni degli istoni,
determinano una struttura della
cromatina inaccessibile ai fattori di
trascrizione e fanno in modo che
soltanto i geni del locus MAT siano
espressi (diap. 10).
L’endonucleasi codificata dal gene HO
genera un taglio del doppio filamento
di
DNA
nel
locus
MAT
immediatamente a monte della regione
di omologia Z, dando inizio al
processo di switch del mating type
(diap. 12). In seguito a questo taglio,
la regione del locus MAT (Y) viene
degradata; Per sostituire il segmento
mancante (Y), le due estremità di DNA
libere, poste all’estremità Z del taglio
effettuato da HO, invadono la regione
di omologia del gene HM appropriato
insieme alle estremità libere (X)
generate dalla degradazione del
segmento Y (diap. 13). La replicazione
del DNA alle estremità delle doppie
eliche che risultano dall’invasione,
copia il frammenti Y del locus HM; in
questo modo, il locus MAT acquisisce
la specificità genetica del locus HM
invaso. A questo stadio, i due loci
interconnessi sono uniti da due regioni
di scambio di filamenti che devono
essere risolte con successivi tagli a
singolo filamento (diap. 14). Le
modalità con cui i filamenti vengono
tagliati sono simili a quelle della
ricombinazione generale. I tagli
devono essere eseguiti in modo da non
avere uno scambio di marcatori
fiancheggianti, che porterebbero ad un
cromosoma difettivo. I siti riconosciuti
da HO sono presenti anche su HML e
HMR (diap. 15). Le proteine dei geni
SIR, oltre ad impedire la trascrizione di
tali loci, impediscono che il taglio
avvenga in questi siti. Vista
l’importanza della proteina codificata
dal gene HO per iniziare lo switch del
mating type, appare chiaro il motivo
per cui i ceppi mutanti di questo gene
sono eterotallici (non cambiano mai
sesso).
Lo switch è regolato in modo tale che
solo la cellula madre può fare lo switch
e non la cellula figlia. Infatti, solo
cellule che sono già andate incontro ad
una divisione cellulare esprimono il
gene HO. Inoltre, Il fatto che entrambe
le cellule figlie cambiano sesso
insieme indica che la traslocazione
della cassetta avviene PRIMA della
sintesi del DNA (diap. 17).
I due loci silenti HM competono l’uno
con
l’altro
come
donatori
dell’informazione genetica che entrerà
nel locus MAT contenente la rottura.
Il locus MATα si associerà
preferenzialmente con il locus HMR
(a) mentre il locus MATa si associerà
preferenzialmente con il locus HML
(α)
Prodotti genici dei loci MAT
Quando nel locus MAT è presente Yα
vengono sintetizzate le proteine α1 e
α2. La proteina α1 determina
l’induzione dei geni α-specifici,
mentre la proteina α2 reprime la
trascrizione dei geni a-specifici.
Il locus MATa codifica per la proteina
a1. In queste cellule i geni α-specifici
non sono espressi in quanto manca
l’induttore α1, mentre i geni a-specifici
sono espressi in virtù dell’assenza del
repressore α2 (diap. 20).
Nelle cellule aploidi di entrambe i tipi
coniugativi, i geni tipici del diploide
(geni α/a) sono repressi dalla proteina
RME1.
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Nelle cellule diploidi, vengono espressi
solo i geni α/a. Infatti, la proteina α2
reprime la trascrizione dei geni aspecifici e, associata con a1, reprime il
gene α1 in modo che non vengano
espressi i geni α-specifici. Inoltre, il
dimero α2/a1 reprime anche la
trascrizione dei geni HO e RME1,
consentendo così l’espressione dei geni
α/a specifici (diap. 20). Si può notare
come il prodotto del gene a1 sia
importante soprattutto nel diploide,
mentre non ha alcuna funzione
nell’aploide.
Analisi
dei
prodotti
della
ricombinazione meiotica: analisi
delle tetradi
Quando le cellule diploidi di lievito
vanno incontro a sporulazione, le 4
spore si trovano tutte contenute in un
asco. Gli aschi possono essere isolati e
le quattro spore studiate. L’analisi dei
prodotti della ricombinazione meiotica
consente di stabilire l’associazione tra
due marcatori e la loro distanza.
Se
due
marcatori
assortiscono
indipendentemente ci si aspetta di
trovare un rapporto di 1:1 tra tetradi P
(parentali) e NPD (Ditipo non
parentale).
Se i due marcatori sono associati, si
dovrà analizzare il numero delle tetradi
parentali, non parentali e tetratipo.
Si può così stabilire la loro distanza
sul cromosoma.
Le tetradi di tipo parentale (PD) si
formano quando i cromatidi parentali
vengono trasmessi integri ai prodotti
della meiosi (diap. 23). Le tetradi
tetratipo (T) si formeranno ogni volta
che si verifica un singolo scambio tra i
loci dei geni in esame in due dei
quattro cromatidi di un bivalente (diap.
24). Le tetradi di tipo non parentale
(NPD) contengono quattro prodotti
ricombinanti e risultano dal verificarsi
simultaneo
di
due
scambi
nell’intervallo dei geni in esame che
coinvolgano tutti equattro i cromatidi
(doppio scambio a quattro filamenti,
diap. 25). Se due geni sono vicini sul
cromosoma, si presuppone che tali
scambi doppi avvengano meno
frequentemente degli scambi singoli.
Sulla base del numero di tetradi P, T e
NPD si può calcolare la percentuale di
ricombinazione con la seguente
formula
% ricombinazione
P+T+NPD
=
T+6NPD/
La percentuale di ricombinazione
fornisce la distanza in unità di mappa.
Per S. cerevisiae, 1 unità di mappa
corrisponde a circa 3/5 kb.
Genetica mitocondriale
Il lievito S. cerevisiae è l’organismo
ideale per studiare difetti della
funzione mitocondriale che sono alla
base di molte malattie genetiche. Il
vantaggio del lievito risiede nel fatto
che esso è un anaerobio facoltativo. In
questo microrganismo pertanto, le
mutazioni che determinano una
deficienza nelle funzioni respiratorie
sono evidentemente delle mutazioni
condizionali: non impediscono la
crescita quando viene usata una fonte
di carbonio fermentabile (es.:glucosio),
ma limitano la crescita se il substrato è
solo respirabile (es.: etanolo o
glicerolo).
Alla fine degli anni 40’, Ephrussi ed i
suoi collaboratori osservarono che
quando le cellule di lievito venivano
piastrate in condizioni in presenza di
glucosio, tra le normali colonie,
definite grande, potevano comparire
colonie più piccole, definite petite. Le
cellule delle colonie petite non erano
capaci di utilizzare substrati respirabili
e quindi la funzione mitocondriale era
danneggiata. La frequenza con la quale
insorgono le petite è molto alta (circa
10-3) e può essere ulteriormente indotta
da mutageni quali il bromuro d’etidio.
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Alcune petite (pet) sono portatrici di
mutazioni a carico di geni nucleari
coinvolti con la funzione mitocondriale
e mostrano un’eredità mendeliana
classica 2:2 (diap. 28).
Altre petite (rho-) recano mutazioni a
carico del DNA mitocondriale e
mostrano una segregazione 4:0 tipica
dell’eredità citoplasmatica (diap 29).
Infatti, quando i mutanti rho- vengono
incrociati con i ceppi selvatici, questi
donano mitocondri “sani” che si
fondono con quelli mutati. Seguono
eventi di fissione e fusione dei
mitocondri che durante la divisione
cellulare si distribuiscono casualmente
e possono supplire ai difetti del
mutante. In questo caso la progenie
sarà tutta selvatica e la petite viene
definita neutrale. Un esempio di petite
neutrale sono le rho°, che mancano
completamente di DNA mitocondriale.
Nelle petite soppressive invece, il
diploide derivato da un incrocio con
una cellula selvatica esprime la
mutazione e tutte le spore derivanti da
tale diploide saranno petite. Molto
spesso le mutazioni petite soppressive
presentano delle delezioni nel DNA
mitocondriale.
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