PATHOLOGICA 2004;96:465-469
ARTICOLO
ORIGINALE
Bcl-2 nel carcinoma ovarico: studio clinicopatologico,
immunoistochimico e molecolare
Bcl-2 in ovarian carcinoma: a clinicopathologic, immunohistochemical
and molecular study
M.R. RASPOLLINI, F. CASTIGLIONE, D. ROSSI DEGL’INNOCENTI, G. BARONI, G. AMUNNI *,
A. VILLANUCCI*, G.L. TADDEI
Dipartimento di Patologia Umana ed Oncologia; * Dipartimento di Ginecologia, Perinatologia e Medicina Riproduttiva,
Università di Firenze
Parole chiave
Bcl-2 • Carcinoma ovarico • Prognosi • Chemioterapia
Riassunto
Key words
Bcl-2 • Ovarian carcinoma • Prognosis • Chemotherapy
Summary
Abbiamo studiato l’espressione immunoistochimica di bcl-2 e
l’eventuale presenza della traslocazione t(14;18)(q32;q21) nel
gene bcl-2 in relazione alla risposta alla chemioterapia di prima
linea ed all’evoluzione clinica di pazienti con carcinoma ovarico
in stadio avanzato. Abbiamo confrontato 17 pazienti con carcinoma ovarico di tipo sieroso, G3, stadio FIGO III C, vive senza
malattia dopo cinque anni con 19 pazienti, omogenee per G, stadio e trattamento terapeutico, morte per malattia entro due anni
dall’intervento chirurgico e chemioterapico.
Abbiamo osservato l’espressione di bcl-2 nel 25% dei casi. Analisi diretta del gene bcl-2 è stata eseguita in tutti i carcinomi ovarici bcl-2 positivi. In tutti i casi l’estrazione del DNA e la successiva reazione PCR sono riusciti. Nessuno dei campioni analizzati presentava una traslocazione t(14;18)(q32;q21) nel gene
bcl-2.
Nella regressione logistica l’intensa espressione di bcl-2 è correlata con la progressione di malattia durante la chemioterapia (p
= 0.04), mentre la positività di bcl-2 non è correlata con la sopravvivenza delle pazienti.
La conoscenza di elementi biologici predittivi di mancata risposta alla chemioterapia di prima linea, potrebbe consentire all’oncologo di ipotizzare, direttamente in prima linea, trattamenti farmacologici più aggressivi. Inoltre, la conoscenza del meccanismo molecolare alla base della over-espressione di bcl-2 potrebbe consentire di comprendere meglio il complesso fenomeno
della chemioresistenza. Ulteriori studi in questa area potranno
aiutare a chiarire le possibilità terapeutiche.
We investigated the immunohistochemical espression of bcl-2
and the genetic assessment of the bcl-2 gene in relation to
responsiveness to first line chemotherapy and to the clinical outcome in advanced ovarian carcinoma patients.
We have compared 17 patients, with FIGO stage III C, ovarian
serous carcinomas, G3, living with no evident disease five years
after primary surgical treatment; to 19 patients who had died
of progression of disease no later than two years after primary
surgical treatment.
The correlation of bcl-2 expression with the survival and the
clinical responsiveness to chemotherapy, were analysed with the
logistic regression.
We observed a bcl-2 expression in tumor cells in 25% of the
cases. Molecular genetic analysis of the bcl-2 gene was performed for all the bcl-2 immunohistochimical positive cases. No
traslocation t(14;18)(q32;q21) of the gene bcl-2 were found.
The bcl-2 over-expression was found to be a significant independent predictor of responsiveness to chemotherapy (p = 0.04),
but it was not correlated with the overall survival of the ovarian cancer patients.
The prognostic value of bcl-2 espression may help in the management of ovarian cancer patients permitting the selection of
more aggressive first line chemotherapy. In addition, the knowledge of the molecular mechanism, which is responsible of the
over-expression of bcl-2, may help in the understanding of
mechanisms responsible for chemoresistance. Further studies
in this area will help clarify this therapeutic possibility.
Introduzione
completamente la malattia microscopica residua che,
nella maggioranza delle pazienti, è presente come malattia metastatica peritoneale.
Il carcinoma ovarico è una neoplasia chemiosensibile e
diversi farmaci possono indurre una remissione di malattia. Negli ultimi 25 anni, diverse combinazioni di
Circa il 90% di tutte le pazienti con carcinoma ovarico
in stadio avanzato sono trattate con chirurgia e successivo trattamento adiuvante. La chemioterapia è essenziale dal momento che la chirurgia non può eradicare
Corrispondenza
Dott.ssa Maria Rosaria Raspollini, Dipartimento di Patologia
Umana ed Oncologia, Università di Firenze, viale G.B. Morgagni
85, 50134 Firenze, Italia - Tel. +39 055 4478138 - Fax +39 055
4379868 - E-mail: [email protected]
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chemiofarmaci sono stati testati ed impiegati nei pazienti con carcinoma ovarico 1 2. Al momento attuale il
trattamento adiuvante consiste in una combinazione di
un derivato del platino con paclitaxolo 3; ma di recente
sono stati ipotizzati schemi terapeutici più aggressivi
con l’introduzione nella chemioterapia di prima linea
di un terzo farmaco, in aggiunta alla combinazione di
platino e taxolo, o con una terapia di consolidamento
usando un singolo farmaco dopo i sei cicli di chemioterapia con platino e taxolo 4 5. Tuttavia nonostante gli
sforzi terapeutici, una significativa frazione di pazienti
con carcinoma ovarico in stadio avanzato, nonostante
una risposta completa alla chemioterapia di prima linea, presenterà una recidiva a distanza di tempo variabile; circa il 30% delle pazienti trattate, invece, presenta una progressione di malattia in corso di terapia primaria.
È stato osservato che l’apoptosi è un meccanismo perso dalla cellula tumorale durante la chemioterapia, e
ciò potrebbe essere una importante causa di chemioresistenza 6. La famiglia bcl-2 è costituita da proteine che
sono regolatori dell’apoptosi. Alterazioni nel controllo
di questo processo possono portare ad una riduzione
nella morte cellulare, contribuendo così alla crescita
neoplastica. In particolare, bcl-2 è una oncoproteina di
membrana associata ai mitocondri, al reticolo endoplasmatico e alla membrana perinucleare che inibisce l’apoptosi 7 8. Bcl-2 è stata descritta per la prima volta come il risultato di una traslocazione cromosomica
t(14;18) del gene bcl-2 osservata in un grande numero
di linfomi follicolari 9. La risultante over-espressione di
bcl-2 conferisce ai linfociti, che presentano tale traslocazione, una resistenza all’apoptosi 10. L’espressione di
bcl-2 è stata trovata in cellule linfoidi normali, in disordini linfoproliferativi senza t(14;18) traslocazione
del gene bcl-2 11, ma anche in altre neoplasie non linfomatose compreso il carcinoma ovarico 12-16.
Scopo del lavoro è stato quello di studiare la overespressione della bcl-2 e l’eventuale presenza della traslocazione cromosomica t(14;18) del gene bcl-2 nel
carcinoma ovarico in stadio avanzato sottoposto a trattamento chirurgico e chemioterapico per analizzarne le
correlazioni con la risposta alla chemioterapia di prima
linea e con l’evoluzione clinica delle pazienti.
Pazienti e metodi
SELEZIONE DEI CASI
A seguito di una ricerca condotta nell’archivio del Dipartimento di Patologia Umana ed Oncologia dell’Università di Firenze, sono stati identificati dal 1985 al
1999, 494 casi di carcinoma ovarico. Da questi casi,
abbiamo selezionato il materiale relativo all’exeresi
chirurgica di pazienti con carcinoma ovarico, con follow-up noto, sottoposte a trattamento chirurgico e chemioterapico presso il Dipartimento di Ginecologia, Perinatologia e Medicina della Riproduzione dell’Univer-
M.R. RASPOLLINI, ET AL.
sità di Firenze. Abbiamo studiato una serie omogenea
di casi formata da 36 casi di carcinoma ovarico, stadio
FIGO IIIC, di tipo sieroso, a basso grado di differenziazione (G3). Di questi casi, abbiamo confrontato 17
pazienti vive senza malattia dopo cinque anni con 19
pazienti morte per malattia entro due anni dall’intervento chirurgico e chemioterapico.
Tutte le pazienti sono state sottoposte a laparotomia per
rimozione delle masse neoplastiche con istero-annessiectomia bilaterale, appendicectomia, omentectomia e
biopsie multiple delle sierose. Un trattamento adiuvante con sei cicli di chemioterapia a base di cisplatino, è
stato effettuato in tutte le pazienti indipendentemente
dalla presenza o meno di malattia residua dopo il trattamento chirurgico.
Abbiamo valutato la risposta clinica alla chemioterapia
di prima linea secondo i criteri del WHO 17: risposta
completa (CR), risposta partiale (PR), malattia stabile
(SD) e progressione di malattia (PD).
Tutte le pazienti sono state stadiate retrospettivamente
secondo il sistema di stadiazione del “International Federation of Gynecology and Obstetrics” (FIGO) 18.
Il follow-up delle pazienti consisteva in: esame della
pelvi, monitoraggio dei markers tumorali (CA-125,
CEA, CA-19.9), ecografia pelvica ed addominale (ogni
3 mesi per 2 anni ed in seguito ogni 6 mesi), TC della
pelvi e dell’addome (1 volta l’anno).
ISTOPATOLOGIA ED IMMUNOISTOCHIMICA
Il materiale di exeresi chirurgica è stato fissato in formalina ed incluso in paraffina. In ciascun caso sono stati rivalutati i preparati istologici colorati con ematossilina ed eosina allo scopo di caratterizzare e confermare
il profilo istomorfologico della neoplasia. Si è potuto
scegliere l’inclusione più rappresentativa tra quelle disponibili, per eseguire indagini immunoistochimiche e
molecolari. Le indagini immunoistochimiche sono state condotte tramite una metodica standard streptavidina-biotina-perossidasi (UltraVision kit, LAB VISION;
Fremont, CA) con diaminobenzidine (DAB) come cromogeno ed ematossilina di Mayer’s come colorazione
nucleare. L’espressione di bcl-2 stata valutata con anticorpo monoclonale anti-bcl-2 (clone 124, Dako, Carpinteria, CA diluizione 1:50). Il controllo negativo è
stato eseguito sostituendo l’anticorpo primario con un
anticorpo non immune di mouse ad una equivalente
concentrazione proteica. Come controllo positivo abbiamo utilizzato una sezione di linfoma follicolare con
elevata espressione di bcl-2.
VALUTAZIONE DELL’ESPRESSIONE DI BCL-2
La reazione immunoistochimica positiva appariva come una colorazione marrone citoplasmatica e/o di
membrana.
In base al numero di cellule positive, la colorazione è
stata valutata come segue: 0% (0), < 10% (1), 10-50%
(2), 51-80% (3), and > 80% (4). L’intensità della colorazione è stata valutata in: debole (1+), moderata (2+), ed
intensa (3+). Per ogni caso, i valori dei due parametri
BCL-2 NEL CARCINOMA OVARICO
(percentuale delle cellule positive ed intensità della colorazione) sono stati moltiplicati, così da ottenere un
possibile valore da 1 a 12. i casi sono stati quindi classificati in 3 differenti gruppi: casi negativi (< 10% di cellule positive oppure score 0-1), casi con espressione moderata (10-50% di cellule positive oppure score 2-6), a
casi con elevata espressione (> 50% di cellule positive
oppure score 8-12), come precedentemente descritto 19.
Le sezioni con colorazioni immunoistochimiche sono
state valutate senza conoscere l’evoluzione clinica della singola paziente.
ESTRAZIONE ED ANALISI DEL DNA
Il DNA è stato isolato da sezioni di tessuto fissato in
formalina e incluso in paraffina. Dopo la sparaffinatura
e la digestione con proteinasi K, il DNA è stato fatto
bollire a 96 °C per 10 minuti per inattivare l’enzima.
La reazione di PCR è stata eseguita usando dei primer
per MBR (5’–TTA GAG AGT TGC TTT ACG TG–3’)
e per la regione consenso JH (5’–ACC TGA GGA GAC
GGT GAC CAG GGT–3’), in 50 µl di volume finale.
La reazione è stata effettuata con 50 pmol di primer, 1
mM MgCl2, 0,6 mM dNTPs e 1 U di Taq polimerasi
(Applied Biosystems, USA), usando 500 ng di DNA.
L’amplificazione è stata eseguita in 39 cicli con un
thermal cycler (GeneAmp PCR Systems 2400, PerkinElmer, USA). Ciascun ciclo si componeva di: 45 secondi di denaturazione a 95 °C, 1 minuto di annealing
a 62 °C e 1 minuto di estensione a 72 °C. L’ultima
estensione è stata fatta in 10 minuti.
I prodotti della PCR (10 µl) sono stati analizzati in elettroforesi con un gel di agarosio al 2% e visualizzati con
un transilluminatore UV.
ANALISI STATISTICA
Abbiamo analizzato l’espressione di bcl-2 in relazione
alla chemioterapia di prima linea ed alla sopravvivenza
delle pazienti secondo la regressione logistica 20. L’analisi dei dati è stata eseguita usando il sistema statistico di analisi SPSS Versione 11.0 (Chicago, IL). Il valore di p ≤ 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
Risultati
L’età media delle pazienti morte per progressione di
malattia entro due anni dall’intervento primario era
60,3, la mediana era 64 anni (range, 38-77 anni); l’età
media delle pazienti che erano vive senza malattia dopo 5 anni dall’intervento primario era 55.6, la mediana
era 54 anni (range, 40-68 anni).
22 donne (61,1%) presentavano una malattia residua
assente o minima (< 2 cm) dopo il trattamento chirurgico prima del trattamento chemioterapico, mentre 14
pazienti (38,8%) avevano una malattia residua > 2 cm.
18 pazienti (50%) hanno risposto in modo completo alla chemioterapia dopo la chirurgia; 6 pazienti (16,6%)
hanno risposto in modo parziale, e in 12 pazienti
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Fig. 1. Elevata espressione di bcl-2 nel carcinoma sieroso ovarico.
(33,3%) la malattia era in progressione dopo il trattamento chirurgico ed adiuvante. Nessuna delle pazienti
era con malattia stabile.
IMMUNOISTOCHIMICA
Abbiamo osservato l’espressione di bcl-2 in 9 casi
(25%), in particolare l’espressione di bcl-2 risultava
elevata in 5 casi (13,8%) (Fig. 1) e moderata in 4 casi
(11,1%).
CORRELAZIONE DELL’ESPRESSIONE DI BCL-2
CON I PARAMETRI CLINICO-PATOLOGICI
Nella regressione logistica l’intensa espressione di bcl2 è correlata con la progressione di malattia durante la
chemioterapia (p = 0,04) (Tab. I), mentre la positività
di bcl-2 non è correlata con la sopravvivenza delle pazienti.
Nelle pazienti con lunga sopravvivenza, abbiamo osservato una intensa espressione di bcl-2 in un solo caso
(5,8%), ed una moderata espressione in 4 casi (23,5%),
mentre nelle pazienti decedute entro due anni abbiamo
osservato una intensa espressione di bcl-2 in 4 casi
(21%). Nei casi con over-espressione di bcl-2 si ha una
progressione di malattia durante chemioterapia in 4 casi (80%), e si ha una risposta clinica completa al trattamento adiuvante di prima linea in un solo caso (20%).
Tab. I. Over-espressione di bcl-2 in relazione alla risposta clinica
alla chemioterapia di prima linea nelle pazienti con carcinoma
ovarico in stadio avanzato secondo la regressione logistica.
Variabile progressione di
chemioterapia di prima linea.
malattia
Odds Ratio
95% CI
11,5
1,1-118,7
Bcl-2 over-espressa
CI: intervallo di confidenza
durante
p
0,04
la
M.R. RASPOLLINI, ET AL.
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ANALISI DEL GENE BCL-2
Analisi diretta del gene bcl-2 è stata eseguita sia nei 4
carcinomi ovarici con intensa positività per bcl-2, che
nei 5 casi moderatamente positivi. In tutti i casi l’estrazione del DNA e la successiva reazione PCR sono riusciti. Nessuno dei campioni analizzati presentava una
traslocazione t(14;18)(q32;q21) nel gene bcl-2.
Discussione
La prognosi delle pazienti con carcinoma ovarico che
non rispondono al trattamento chemioterapico di prima
linea è pessima. In queste donne si avrà una progressione di malattia rapida, con esito infausto. L’enucleazione di tali pazienti, che non risentono del trattamento
chemioterapico, potrebbe consentire all’oncologo di
ipotizzare direttamente in prima linea di trattamenti
farmacologici più aggressivi.
Nel presente studio, abbiamo osservato che una espressione intensa di bcl-2, nel carcinoma sieroso in stadio
avanzato, si correla con una mancata risposta delle pazienti alla chemioterapia di prima linea. È stato dimostrato che bcl-2 favorisce la sopravvivenza delle cellule, grazie alla inibizione dell’apoptosi o morte cellulare programmata 21 22. Diversi tipi di neoplasie, incluso il
carcinoma ovarico 23, che sono resistenti ai chemio-farmaci, esprimono bcl-2 24. L’espressione di bcl-2 da parte della neoplasia, potrebbe conferire resistenza alla
chemioterapia consentendo alle cellule tumorali di evitare la morte cellulare programmata.
I dati riportati in Letteratura riguardo al significato prognostico di bcl-2 non sono univoci, se da un lato, l’over-espressione di bcl-2 è stata correlata con lunghe so-
pravvivenze in molti, ma non in tutti gli studi sul carcinoma ovarico 16 25; dall’altro lato, in studi più recenti,
l’espressione di bcl-2 non viene associata con l’evoluzione clinica delle pazienti 26 27. Nel nostro studio, l’espressione di bcl-2 non è correlata con la sopravvivenza delle pazienti, ma si correla nella regressione logistica con la progressione di malattia durante il trattamento chemioterapico, a base di platino, di prima linea
(p = 0,04). Inoltre, la bcl-2, studiata su culture cellulari di carcinoma ovarico, è stata correlata con la risposta
alla chemioterapia a base di cis-platino 28 29. Questa associazione, studiata nelle culture cellulari, ha trovato
conferma, prima della nostra analisi, anche in due recenti studi clinici 23 27.
Nei nostri campioni, l’over-espressione della bcl-2, dimostrata con l’immunoistochimica, non è indotta dalla
traslocazione t(14;18)(q32;q21) che invece rappresenta
la lesione genetica principale in altri tipi di patologie
oncologiche. Del resto, molte mutazioni possono influenzare il segnale a cascata che promuove o reprime
l’espressione di bcl-2 e di altre proteine della stessa famiglia. Ad esempio, una alterata attività degli NFkB,
importanti fattori di trascrizione, potrebbe avere un
ruolo significativo nel pathway di espressione di bcl-2.
Infatti, mutazioni che accrescono l’attività degli NFkB,
come Ras, possono incrementare l’espressione della famiglia di proteine che inibiscono l’apoptosi 30 31. La conoscenza del meccanismo molecolare alla base della
over-espressione di bcl-2 potrebbe consentire di comprendere meglio il complesso fenomeno della chemioresistenza, e potrebbe permettere di selezionare le candidate per terapie aggiuntive. Ulteriori studi in questa
area potranno aiutare a chiarire le possibilità terapeutiche.
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