Tecnica della reazione a catena della DNA polimerasi o PCR

Tecnica della reazione a catena della DNA polimerasi o PCR
(Polymerase Chain Reaction)
Una tecnica introdotta da Kary Mullis alla metà degli anni ’80 che ha
rivoluzionato le tecniche dell’ingegneria genetica offrendo uno
strumento straordinariamente potente nell’ amplificare in vitro e in
poco tempo definite sequenze di DNA.
Questa tecnica consente di ottenere centinaia di migliaia di copie del
DNA d’interesse per successive analisi (determinazione della
lunghezza, della mappa di restrizione, della sequenza nucleotidica)
senza dover ricorrere ai comuni metodi di clonaggio né all’uso di
vettori di clonaggio o della loro propagazione all’interno di cellule.
I concetti che ne sono alla base di questa metodica oggi vengono
considerati ovvi e tutte le informazioni scientifiche necessarie per
arrivare a questa scoperta erano note da almeno venti anni.
La PCR fa in una provetta ciò che qualunque batterio fa in un brodo
di coltura e che ogni cellula del nostro corpo fa ogni giorno
Noi tutti produciamo miliardi di copie esatte del nostro DNA
AMPLIFICANDOLO milioni di volte
I COMPONENTI
DNA Polimerasi
L'enzima basilare della
replicazione che
catalizza il legame di
deossiribonucleotidi
trifosfato (dNTP)
Le DNA polimerasi catalizzano la reazione di addizione di
un nucleotide ad una sequenza primer e necessita di uno
stampo.
VIDEO
Il materiale di partenza per la PCR è il DNA che contiene la sequenza che deve
essere amplificata; non è necessario isolare questa sequenza dal momento che
essa viene individuata dai primers.
La quantità di DNA necessaria per la PCR è veramente piccola (meno di 1 µg di
DNA genomico totale, ma a volte basta una singola molecola di DNA).
Composizione tipica di una reazione di PCR:
• DNA contenente la sequenza da amplificare
• Due primers
• DNA polimerasi
• Miscela dei quattro nucleotidi precursori (dNTPs: 2’ desossinucleosidi 5’
trifosfato)
Il volume totale della reazione è generalmente di circa 50-100µl
Ad ogni ciclo il numero dei frammenti desiderati (quelli cioè posti tra i due
primers) si raddoppia (crescita esponenziale), mentre di nuovi frammenti estesi
all’estremo 3’ad ogni ciclo se ne formano sempre e solo due.
Dopo 32 cicli si sono perciò formati 1 073 741 824 (!!!) frammenti di DNA a
doppia elica corrispondenti al tratto compreso tra i due primers (e solo 64
filamenti estesi all’estremo 3’).
Dopo l’ultimo ciclo si lascia il campione per 10 min. a 72°C. In questa maniera
l’enzima ha il tempo di riempire ogni lacuna che dovesse essere eventualmente
presente all’estremo 3’ di qualche filamento.
PRECURSORI (DNTP)
Devono essere bilanciati, perché se ce n'è uno in concentrazione limitante
l'enzima o incorpora qualcos'altro o si ferma.
Ovviamente contano anche la lunghezza: 500 bp necessitano di una
concentrazione di dNTP minore di una sequenza di 5000 bp, così come di n°
di cicli di reazione. Ricordiamo che negli ultimi cicli la quantità di templato
polimerizzata è molto elevata.
Si suggerisce una concentrazione di 200uM di ogni desossinucleotide. Le
concentrazioni dei 4 desossinucleotidi devono essere uguali per prevenire
errori di incorporazione .
Il loro grande eccesso rispetto al DNA templato permette di mantenere il loro
rapporto essenzialmente costante anche negli ultimi cicli
OLIGO (Primer)
- Prodotti in vitro per sintesi chimica, non sono ammesse preparazioni
non pure per quanto riguarda la composizione in basi, o l'amplificazione
non sarà specifica.
- Questo significa anche limitarsi ad un range di dimensioni da 18 a 30 nt,
dopodiché il rischio di non precisione e il costo dell'oligo li rende non
adatti per la PCR.
-Non devono essere limitanti ma non devono essere nemmeno in eccesso
(aumenta il rischio di dimerizzazione). Devono avere la stessa
concentrazione e la concentrazione finale dovrebbe essere 0.1 uM.
Concentrazioni superiori a 0.5 possono portare alla formazione di primerdimer
- La coppia di oligo deve avere temperature di denaturazione simili
(Tm1~Tm2).
SCELTA DELLA TM
Più la Tm (temperatura di fusione, quella per la denaturazione del DNA) è alta
e più aumenta la probabilità che gli oligo si appaiano specificatamente,
quindi quelli completamente omologhi al templato.
La Tm si calcola con formule empiriche.
Tm= 4(G+C)+2(A+T)°C
· Ad una costante fissa viene aggiungo un contributo positivo che deriva
dalla ricchezza in GC dell'oligo (maggior contributo alla stabilità) e aggiungo
un contributo negativo: oligo molto corti hanno in proporzione meno
interazioni fra le basi e quindi tenderanno a staccarsi dal templato a
temperature più basse. Questo è l'algoritmo correntemente utilizzato.
· C'è poi il caso particolare nel calcolo della Tm per gli oligo che non sono
completamente omologhi soprattutto nelle regioni centrali: un non omologo
all'estremità può essere, per assunto, solo l'appaiato. Ma se la zona non
omologa si trova al centro l'assunzione non si può fare: per trovare la Tm
esiste una formula (che ha una diversa costante fissa) che tiene conto del
contributo negativo della parte non appaiata (% di mismatch).
• Non deve verificarsi self annealing: i due oligo non devono appaiarsi fra loro,
altrimenti la concentrazione di oligo effettiva nella miscela di reazione si
abbassa notevolmente.
Non solo, se l'appaiamento è solo fra le code queste si distendono ed avremo
eterodimeri di oligo, la polimerasi polimerizzerà un oligo, ed ai cicli successivi
si appaieranno altri oligo e, alla fine, troveremo piccole molecole (100 bp circa)
che sono state ottenute da una sequenza in tandem di oligo. Questa miscela
sottrae attività enzimatica, sottrae oligo, nucleotidi e quindi riduce
notevolmente l'efficienza d'amplificazione. In particolare non si devono anilare
in corrispondenza del 3', è ovvio, perché è qui che comincia la
polimerizzazione e, se si annilano qui, l'allungamento è compromesso.
•La sequenza non deve permettere formazioni di stem loop.
•L'appaiamento col templato deve essere stabile, quindi valuto
1. Il grado di purezza delle preparazioni (i detergenti destabilizzano l'anniling)
2. La temperatura di annealing
Se nella sequenza dell'oligo c'è un sito dei restrizione, non è detto che debba
appaiarsi (oligo con le ali) ho la comodità che, una volta fatta l'amplificazione,
posso tagliare a quel livello e introdurre direttamente nel plasmide.
Esistono software per la scelta dei primer
MG++
Non deve essere limitante: tutto ciò che metabolizza polimeri di
nucleotidi necessita di Mg++.
Se è largamente eccedente determina inaccuratezza, aumentando la
frequenza degli appaiamenti degli oligo con sequenza non omologhe:
le 2 cariche positive possono interagire con i fosfati e dare stabilità
all'appaiamento.
Stabilizzando gli omologhi, stabilizzano anche i non omologhi, e questo
va evitato.
La [Mg++] ottimale si determina tenendo conto che può essere legato
sui fosfati di DNA ds, Oligo e dNTP; sommando queste concentrazioni
(conto stechiometrico/spannometrico) più la [compatibile] con l'attività
enzimatica. Si va a spanne: si guarda l'ordine di grandezza molare.
(concentrazioni inferiori a 0.5uM impediscono la reazione di
estensione)
La concentrazione ottimale viene determinata sperimentalmente ogni
volta che si mette a punto una nuova reazione
SE ABBIAMO ALLESTITO UNA PCR IN CONDIZIONI NON
OTTIMALI.
•Quello che succede è che uno degli oligo si appaia in una zona non
desiderata.
L'appaiamento scorretto porta ad un abbondante presenza di un
amplificato di dimensioni scorrette. (Non è che gli appaiamenti
scorretti siano rilevabili solo dopo tanti cicli di reazione: se si
verificano si verificano dall'inizio, quindi non è vero che facendo 40
cicli piuttosto che 20 si aumenta la probabilità di osservare fenomeno.
È chiaro che, per una questa di frequenza sarebbe vero, ma la
proporzione è così bassa che il caso sporadico è poco rappresentato).
Il principale problema della tecnica di PCR è la contaminazione da
prodotti di amplificazioni precedenti che può causare amplificazione di
DNA parassita (falsi positivi)
COME SOPPRIMERE LE CONTAMINAZIONI
1. PRECAUZIONI.
PCR in stanze separate dalle altre operazioni, vetreria dedicata solo a PCR,
massima sterilità.
2. HOT STAR PCR
Ovvero PCR con partenza a caldo, si tratta di aggiungere la Taq velocemente
subito dopo il primo lungo step di denaturazione. Lo stratagemma ha lo
scopo di aumentare la specificità dell'annealing elongato.
3. NESTED PCR
Si tratta di realizzare due PCR successive utilizzando coppie di primers
differenti, con la seconda che inquadra una sequenza inclusa in quella
amplificata dalla prima coppia.
Se la prima amplificazione è artefattuale, nella seconda i primers non si
appaieranno!
In questo modo aumento:
- Specificità
- Tasso di amplificazione
CLONAGGIO DEI PRODOTTI DI PCR.
Abbiam visto che è possibile inserire negli oligonucleotidi dei siti di
restrizione, che comodità:
sample 1) amplifico -> digerisco
sample 2) digerisco il plasmide
sample 3) mix sample 1) & 2) and aggiungo ligase.
Ora trasformo.
L'estremità degli amplificati è un'altra caratteristica che differenzia Taq e Pfu:
· TAQ molto spesso lascia delle basi in più sull'elica 3' come single strand.
Spesso sono delle A (o T). Sistemi in commercio sfruttano questo A per farle
legare in plasmidi in cui sono stati messe delle poli-A.
· PFU produce amplificati blunt, quindi o usiamo plasmidi blunt o usiamo la
terminal transferasi. Allestiamo una reazione in cui mettiamo soltanto delle A,
ed otteniamo un amplificato Pfu con la coda di poli-A, che a questo punto può
essere clonata in un plasmide commerciale che presenta la coda di poli-T.
CLONAGGIO DI DNA DI ORGANISMI NON COLTIVABILI.
Mettiamo di partire da DNA genomico digerito con un enzima, quindi una
soluzione estremamente eterogenea di frammenti di cui conosciamo però le
estremità (derivanti dall'enzima di restrizione usato). Essendo eterogenea
non possiamo decidere a priori quali oligo usare per amplificare tutti i
frammenti che abbiamo: perché non bastano le basi del sito di restrizione (410) per costruire l'oligo. Come si fa? Possiamo fare una ligazione a livello
delle estremità (che conosciamo) e alla ligazione attacchiamo una coda (o
linker) di cui conosciamo tutta la sequenza perché l'abbiam sintetizzato in
vitro.
È su quel linker che andremo a costruire gli oligonucleotidi complementari, e
siam pronti per fare la PCR. Arriviamo alla fine con molecole di questo tipo:
il frammento centrale a sequenza sconosciuta, più coda esterna con sito di
restrizione, che abbiamo avuto la cura di ricostruire completamente, e altre
basi. Ora ridigeriamo con l'enzima di partenza (quello con cui avevamo
tagliato il templato all'inizio) otteniamo un amplificato che è già pronto per
essere riclonato in un plasmide che porti la sequenza per l'enzima che
abbiamo usato all'inizio. Rispetto agli altri metodi, questo ha un passaggio in
più: la ligazione iniziale. Come tutte le cose, non avremo un'efficienza del
100%, ma la tecnica è usata frequentemente quando dobbiamo ottenere dei
frammenti da un templato limitante.
APPLICAZIONI CLASSICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE
Come iniziano e come terminano i messaggeri. conosciuta la sequenza di
questi due pezzetti posso fare una PCR con oligo specifici su DNA genomico,
allo scopo di conoscere tutto il gene. Oppure prima copio tutti i messaggeri
con l'RT e poi faccio una seconda PCR usando oligo quelli che stanno
all'inizio e alla fine
APPLICAZIONI IN CAMPO CLINICO
Diagnosi di traslocazioni cromosomiche associate ad insorgenza di forme
tumorali.
La PCR è comoda perché, grazie al suo alto potere amplificatorio, ci permette
di individuare il male anche nella fase precoce della neoplasia. pensiamo ad
un tumore in fase liquida (sangue).
Normalmente nel genoma abbiamo assetti cromosomici ben definiti, ma si
vede che alcune porzioni hanno alta tendenza a rompersi e a riarrangiarsi,
causando espressione non regolata di alcuni geni, da cui il tumore. Dal punto
di vista tecnico, individueremo traslazioni di un pezzo di cromosoma su un
altro e disegneremo l'oligo vicino ai punti di rottura più probabili. Il secondo
oligo su un altro cromosoma spesso soggetta alla traslocazione. Se la cellula
è sana i 2 oligo si appaiano in zone diverse, e non succede assolutamente
niente (qualche single strand con progressione lineare, che sul gel non si
vede). Se amplifica esponenzialmente, gli oligo sono vicini, e allora è presente
una traslocazione. Ovviamente sono stati sviluppati kit con oligo appropriati.
Tutti sono basati sullo screening in positivo. Attenzione ai falsi positivi!
USO DELLA PCR NELLO SCREENING DI COLONIE TRASFORMANTI.
È sempre uno screening in positivo: PCR per ogni colonia con oligo
appropriati che beccano solo la trasformazione ottimale. Ovviamente
devo numerare le colonie e le provette allo stesso modo. Con screening
molto estesi nell'ordine di centinaia di campioni, il metodo è molto
veloce: molto di più che non la singola estrazione di DNA per ogni
clone.
TIPI DI PCR
PCR ASIMMETRICA.
Possiamo fare una PCR in cui alla fine abbiamo un prodotto ss (single strand).
È un amplificazione parziale, e quindi non è più esponenziale. Ad un certo
tempo la sintesi di uno dei due filamenti diventa limitante: A continua ad
aumentare, B fa fatica (quasi costante).
Il vantaggio di questa tecnica:
1. nella preparazione di sonde (identificazione dei messaggeri);
2. sequenziamento.
Non è corretto parlare di amplificato, perché nei primi cicli non tutti i prodotti
diventano templato per i successivi: dopo un certo numero di cicli non c'è più
la doppia elica, quindi abbiamo un amplificazione lineare. I rapporti inizio:fine
di amplificato non sarà 1:106 ma 1:105 al massimo. E' molto frequente che o
facciamo molte reazioni uguali o le facciamo più lunghe, questo per avere la
stessa quantità di DNA finale. Per discriminare la sintesi di un solo filamento
quello che si fa è aggiungere oligonucleotidi in maniera differenziale: almeno
50 volte di più quello che ci interessa, dell'altro solo un po' per fare fare i primi
(10) cicli, e avere un minimo di double-strand (1000 copie). E' una PCR ottenuta
attraverso un rapporto di oligo 50:1 o molto di più.
RT-PCR (REVERSE TRANSLATION PCR & MUTAGENESI.
Non è detto che ci serva sempre una PCR fedele che riproduca i templati alla
lettera, è possibile utilizzare la PCR nella mutagenesi in vitro.
Introducendo così degli errori, che mi portino ad avere delle mutazioni.
PCR)
La trascrittasi inversa è molto utile ai fini della PCR, perché ci permette di
partire da una miscela di messaggeri. Quando vogliamo fare lo studio di tutti
i geni espressi in una cellula, possiamo estrarre tutti i messaggeri, a quel
punto abbiamo l'RNA che si degrada troppo facilmente. Il sequenziamento su
RNA è fallimentare, quindi la cosa più semplice dal punto di vista tecnico è
quello di fare una copia su DNA che conserveremo in plasmidi
Come adattiamo la PCR per ottenere la retrotrascrizione da
messaggero a DNA?
Facciamo dei primi cicli in cui abbiamo i ss RNA, la trascrittasi inversa
e i nucleotidi. L'enzima non è termostabile come la Taq o la Pfu, quindi
non possiamo fare avvenire la reazione a così alta temperatura. Un
altro limite dell'enzima è la sua incapacità di proof-reading, quindi può
introdurre errori con una certa frequenza. Facciamo avvenire la
reazione a 37-42 gradi, e otterremo ibridi RNA-DNA. Rimuovo l'rna con
la RNAasiH, specifica per l'idrolisi di RNAds o di ibridi (a diff della
RNAasiA che elimina solo il contaminante) torneremo a un ss di DNA,
aggiungo una copia di oligo, quello che si appaia al 3' del 1° filamento,
avremo quindi un'oligo 5'-->3' che viene allungato e che copia il
risultato della prima reazione (ss --> ds). Ora aggiungo anche il
secondo oligo, e avremo una normalissima amplificazione. (attenzione
all'omologia egli oligo)
Insieme ai dNtP introduciamo la TAQ, così facciamo cicli da 92°,
annealing a 60, allungamento a 70 come una normale PCR.
Come scegliere gli oligo?
Se conosciamo la sequenza del messaggero siamo a posto, scegliamo
una zona con una Tmelting che ci va bene, scegliamo dove piazzarlo (lì
vicini alle estremità, così anche se perdiamo 20 bp non importa: i
trascritti non iniziano con l'AUG, ma vengono maturati nella cellula).
Il grosso problema è quando non conosciamo la sequenza del
messaggero. e quindi non conosco i geni (organismo sconosciuto).
Possibilità tecniche: se il 3' è poliadenilato (eucarioti superiori), faccio
una coda di poliT e riesco a copiare un'estremità (RACE). Ma l'altra?
devo attaccargli delle code (terminal transferasi), ma la coda si attacca al
DNA, non all'RNA. L'espediente tecnico è quello di copiare in modo più o
meno esteso le estremità. Possiamo con sequenza molto piccole
dividere in 2 il gene, copiare prima dal 5' verso il centro, poi dal 3' verso
il centro, cerchiamo di ottenere 2 copie che si sovrappongono in mezzo,
cloniamo tutti e due, taglia e cuci e mettiamo insieme i due pezzi. Le
tecniche oggi sono ottimizzate e danno buone rese.