per cattura o sandwich ELISA SANDWICH PER LA RICERCA DI TOSSINE 1.estrazione con tampone/solvente rispettando la diluizione consigliata (in questo caso per Cry 1:11 w/v, per OTA 3:10), per 30’ a temperatura ambiente 2.chiarificazione dell’estratto per centrifugazione (5000 rpm per 5’) o filtrazione da 0.45 µm, non serve per liquidi già limpidi 3.100 µl di estratto, dei controlli e degli standard immessi nei pozzetti (anticorpo specifico adeso), rotazione della piastra, incubazione 20’ a t.a. (n.b.: registrare i pozzetti riempiti con attenzione!) 4.eliminazione del liquido dai pozzetti, lavaggio con soluzione fornita per 3 volte e asciugatura 5.100 µl anticorpo coniugato all’enzima aggiunti nei pozzetti, rotazione della piastra e incubazione per 20’ a t.a. 6.eliminazione del liquido dai pozzetti, lavaggio con soluzione fornita per 3 volte e asciugatura 7.100 µl di substrato immessi in ogni pozzetto, rotazione della piastra, incubazione 15’ a t.a. 8.100 µl di sol. arresto della reazione aggiunti ai pozzetti prima della lettura, da effettuarsi entro 30’ 9.lettura assorbanza alla λ consigliata (nel caso 450 nm) per quantificazione o lettura visiva dello sviluppo di colore o meno Salmonella test kit Con arricchimento: Arricchimento a 35 °C per 18h 1ml in 100ml mezzo Rappaport-vassiladis e incubazione a 35 °C per 18h Omogeneizzare brodo di arricchimento, prelevare 1 goccia di coltura e trasferirla sulla card, omogeneizzare il reagente, aggiungere 1 goccia ad ogni campione da saggiare e mescolare bene con ansa, agitare 2-3 volte la card e osservare per la presenza di agglutinazione entro 2 minuti Con colonie sospette: Porre 1 goccia di soluzione salina sulla card per ogni campione da saggiare, emulsionare una colonia nella soluzione ed escludere autoagglutinazione, omogeneizzare il reagente, aggiungere 1 goccia ad ogni campione da saggiare e mescolare bene con ansa, agitare 2-3 volte la card e osservare per la presenza di agglutinazione entro 2 minuti per competizione Anticorpi e antigeni coniugati ad un enzima mixati con il campione nel pozzetto antigeni del campione occupano siti degli anticorpi. Se non sono presenti si legano gli antigeni coniugati L’aggiunta del substrato dell’enzima sviluppa un prodotto di reazione colorato in quantità tanto maggiore quanti più antigeni coniugati liberi ci sono Test ELISA competitivo Individuazione di tossine Estrazione con tampone/solvente fornito rispettando la diluizione consigliata (es. per Cry 1:11 w/v, per OTA 3:10), per 30’ a temperatura ambiente e chiarificazione Porre 30 µl di anticorpo specifico in ogni pozzetto, aggiungere 100 µl di estratto e diluizioni opportune portate a 100 µl con H2O (in questo caso 100; 75+25; 50+50; 25+75), dei controlli (campione = 0 µl) e degli eventuali standard Reazione per 15 min, poi aggiunta di antigeni coniugati (50 µl) e reazione per 15 min Aggiunta del substrato per l’enzima (20 µl) e lettura della colorazione sviluppata (λ variabile secondo il substrato usato) Test di agglutinazione diretta Milk ring test SCREENING PER BRUCELLOSI. Procedura: latte crudo, conservato a 4°C per non più di 4d, non congelato, riscaldato né agitato. aggiungere 30–50 µl di antigene a 1–2 ml di latte. L’altezza della colonna di latte nel tubo deve essere almeno 30 mm, meglio 50mm. Tubi incubati a 37°C per 1h, insieme a controlli positivi e negativi. Un’incubazione di 24h a 4°C aumenta la sensibilità del test e facilita la lettura. reazione positiva: formazione di uno strato colorato sulla superficie del liquido o all’interfaccia latte-crema. reazione negativa: colorazione del latte uniforme o più intensa sotto alla superficie grassa. Test di agglutinazione diretta su vetrino Campione preparato mediante sospensione in sol. fisiologica della colonia sospetta isolata in purezza, eventualmente inattivata mediante bollitura per 10-15 min. 50µl campione 50µl antisiero specifico 50µl antigene di riferimento 50µl antisiero controllo negativo 50µl antigene di riferimento 50µl antisiero specifico Dopo ogni aggiunta di antigene la goccia viene mescolata. Il vetrino completo viene ruotato manualmente o su agitatore in modo da mixare le fasi e osservato dopo 2-4 minuti. Test di agglutinazione indiretta differentiation between Staphylococcus aureus and other Staphylococcus. Particelle coperte con fibrinogeno e immunoglobuline G (IgG). S. aureus patogeno è coagulasi positivo e ha proteina A nella parete fibrinogeno si lega alle coagulasi di parete e IgG si legano alla proteina A agglutinazione rapida Controllo contiene particelle coperte da albumina bovina Esecuzione del test Agitare il reagente test per 10 sec, preferibilmente su vortex, porre una goccia di reagente test sulla card per ogni saggio da eseguire trasferire una o più colonie nella goccia di reagente e mixare bene per 20 sec agitare la card in verticale e osservare immediatamente per agglutinazione Se agglutinazione non è chiara ripetere il test con il reagente di controllo (BSA) immunocattura