per
cattura o
sandwich
ELISA SANDWICH PER LA RICERCA DI TOSSINE
1.estrazione con tampone/solvente rispettando la diluizione consigliata (in questo
caso per Cry 1:11 w/v, per OTA 3:10), per 30’ a temperatura ambiente
2.chiarificazione dell’estratto per centrifugazione (5000 rpm per 5’) o filtrazione da
0.45 µm, non serve per liquidi già limpidi
3.100 µl di estratto, dei controlli e degli standard immessi nei pozzetti (anticorpo
specifico adeso), rotazione della piastra, incubazione 20’ a t.a. (n.b.: registrare i
pozzetti riempiti con attenzione!)
4.eliminazione del liquido dai pozzetti, lavaggio con soluzione fornita per 3 volte e
asciugatura
5.100 µl anticorpo coniugato all’enzima aggiunti nei pozzetti, rotazione della piastra
e incubazione per 20’ a t.a.
6.eliminazione del liquido dai pozzetti, lavaggio con soluzione fornita per 3 volte e
asciugatura
7.100 µl di substrato immessi in ogni pozzetto, rotazione della piastra, incubazione
15’ a t.a.
8.100 µl di sol. arresto della reazione aggiunti ai pozzetti prima della lettura, da
effettuarsi entro 30’
9.lettura assorbanza alla λ consigliata (nel caso 450 nm) per quantificazione o lettura
visiva dello sviluppo di colore o meno
Salmonella test kit
Con arricchimento: Arricchimento a 35 °C per 18h
1ml in 100ml mezzo Rappaport-vassiladis e incubazione a 35 °C per 18h
Omogeneizzare brodo di arricchimento, prelevare 1 goccia di coltura e trasferirla
sulla card, omogeneizzare il reagente, aggiungere 1 goccia ad ogni campione da
saggiare e mescolare bene con ansa, agitare 2-3 volte la card e osservare per la
presenza di agglutinazione entro 2 minuti
Con colonie sospette: Porre 1 goccia di soluzione salina sulla card per ogni campione
da saggiare, emulsionare una colonia nella soluzione ed escludere
autoagglutinazione, omogeneizzare il reagente, aggiungere 1 goccia ad ogni
campione da saggiare e mescolare bene con ansa, agitare 2-3 volte la card e
osservare per la presenza di agglutinazione entro 2 minuti
per competizione
Anticorpi e antigeni
coniugati ad un enzima
mixati con il campione nel
pozzetto
antigeni del campione
occupano siti degli
anticorpi. Se non sono
presenti si legano gli
antigeni coniugati
L’aggiunta del substrato
dell’enzima sviluppa un prodotto
di reazione colorato in quantità
tanto maggiore quanti più
antigeni coniugati liberi ci sono
Test ELISA competitivo
Individuazione di tossine
Estrazione con tampone/solvente fornito rispettando la diluizione consigliata (es. per Cry
1:11 w/v, per OTA 3:10), per 30’ a temperatura ambiente e chiarificazione
Porre 30 µl di anticorpo specifico in ogni pozzetto, aggiungere 100 µl di estratto e diluizioni
opportune portate a 100 µl con H2O (in questo caso 100; 75+25; 50+50; 25+75), dei controlli
(campione = 0 µl) e degli eventuali standard
Reazione per 15 min, poi aggiunta di antigeni coniugati (50 µl) e reazione per 15 min
Aggiunta del substrato per l’enzima (20 µl) e lettura della colorazione sviluppata (λ variabile
secondo il substrato usato)
Test di agglutinazione diretta
Milk ring test
SCREENING PER BRUCELLOSI.
Procedura: latte crudo, conservato a 4°C per non più
di 4d, non congelato, riscaldato né agitato.
aggiungere 30–50 µl di antigene a 1–2 ml di latte.
L’altezza della colonna di latte nel tubo deve essere
almeno 30 mm, meglio 50mm.
Tubi incubati a 37°C per 1h, insieme a controlli
positivi e negativi. Un’incubazione di 24h a 4°C
aumenta la sensibilità del test e facilita la
lettura.
reazione positiva: formazione di uno strato
colorato sulla superficie del liquido o all’interfaccia
latte-crema.
reazione negativa: colorazione del latte uniforme o
più intensa sotto alla superficie grassa.
Test di agglutinazione diretta su vetrino
Campione preparato mediante sospensione in sol. fisiologica della
colonia sospetta isolata in purezza, eventualmente inattivata
mediante bollitura per 10-15 min.
50µl campione
50µl antisiero
specifico
50µl antigene di riferimento
50µl antisiero controllo
negativo
50µl antigene di riferimento
50µl antisiero specifico
Dopo ogni aggiunta di antigene la goccia viene mescolata. Il vetrino
completo viene ruotato manualmente o su agitatore in modo da
mixare le fasi e osservato dopo 2-4 minuti.
Test di agglutinazione indiretta
differentiation between Staphylococcus aureus and other Staphylococcus.
Particelle coperte con fibrinogeno e immunoglobuline G (IgG).
S. aureus patogeno è coagulasi positivo e ha proteina A nella parete
fibrinogeno si lega alle coagulasi di parete e IgG si legano alla proteina A
agglutinazione rapida
Controllo contiene particelle coperte da albumina bovina
Esecuzione del test
Agitare il reagente test per 10 sec, preferibilmente su vortex,
porre una goccia di reagente test sulla card per ogni saggio da eseguire
trasferire una o più colonie nella goccia di reagente e mixare bene per 20 sec
agitare la card in verticale e osservare immediatamente per agglutinazione
Se agglutinazione non è chiara ripetere il test con il reagente di controllo (BSA)
immunocattura
