Il ruolo del Biologo nei programmi
di Fecondazione Assistita
Dott.ssa Giovanna Tomasi
Biologa
CRA – Centro Riproduzione Assistita - Catania
www.cragroup.it
Seminario Facoltà Scienze Biologiche
8 e 10 maggio 2012
“Il ricordo è un modo d’incontrarsi”, Kahlil Gibran
Loredana Papale
“This is why we are here”, Lynette Scott
Introduzione
PMA
l'insieme delle metodiche (mediche e di laboratorio) volte a
superare l'impossibilità o la difficoltà a concepire
spontaneamente
INFERTILITA’
incapacità a concepire dopo 12/24 mesi di rapporti mirati
non protetti.
FECONDAZIONE
ASSISTITA
mimare “in vitro” ciò che avviene naturalmente “in vivo”
Organizzazione Mondiale della Sanità
Dott.ssa G. Tomasi
Il laboratorio di Fecondazione Assistita
Il cuore di un programma di fecondazione assistita è
il laboratorio dove culmina il lavoro di un’equipe
specializzata formata da medici ginecologi e biologi.
Il biologo che si occupa di fecondazione assistita
viene definito “embriologo” e il suo compito è quello
di occuparsi dei gameti al di fuori del corpo umano
per poter mimare in vitro quello che generalmente
avviene in vivo.
Dott.ssa G. Tomasi
Il laboratorio di Fecondazione Assistita
Stimulation
PATIENT
Oocyte
quality
N° of Incubator
Oil
overlay
CULTURE SYSTEM
Gas
phase
Gardner and Lane, 2007
LABORATORY
Embryo transfer and
luteal support
N° of Embriologist
and training level
Air quality
N° of
embryos/drop
Tissue culture- ware /
contact supplies
Culture
media
OUTCOME
QC &
QA
Oocyte/Embryo handling
outside the incubator
Dott.ssa G. Tomasi
Organizzazione del Laboratorio di Fecondazione Assistita
GOOD
LABORATORY
PRACTICE
QUALITY
Invisible when “good”, impossible to ignore when “bad”
“People forget how fast you did a job but they remember how well you
did it”
Howard W. Newton
“Quality is never an accident, it is always the result of intelligent efforts”
John Ruskin
“Quality is never an accident; it is always the result of high intention,
sincere effort, intelligent direction and skilfull execution; it represents
the wise choice of many alternatives”
William A. Foster
Dott.ssa G. Tomasi
Qualità nel laboratorio IVF
Alti livelli di “patients care”
Alti tassi di successo
Quality Control (QC):
L’insieme delle azioni ed iniziative che consentono di definire e tenere sotto
controllo gli standard qualitativi richiesti.
Quality Assurance (QA):
L’insieme di tutte le attività pianificate e sistematiche richieste, in grado di
garantire il soddisfacimento degli obiettivi della qualità
Dott.ssa G. Tomasi
Qualità nel laboratorio IVF
Quality Improvement:
Gestione del rischio
Valutazione della qualità
Risoluzione dei problemi
PDCA
CYCLE
Say what you do…
…do what you say…
and
Show that you do as you say
Dott.ssa G. Tomasi
Colture embrionali
I principi base:
Favorire la fertilizzazione e lo sviluppo embrionale in vitro
“Normale” fertilizzazione
“Normale” sviluppo embrionale
Selezionare gli embrioni per il replacement in utero
Elevato birth rate e bassa percentuale di gravidanze multiple
Ottenere embrioni disponibili per la crioconservazione (???)
Evitare i fattori che possono influenzare lo sviluppo
embrionale dopo l’impianto (epigenetica)
A. Sunde, 2010
Dott.ssa G. Tomasi
Mantenere la vitalità embrionale
Gli embrioni in vitro sono esposti a stress significativamente più alti
che non in vivo
La vitalità embrionale in vitro dipende da:
Composizione dei terreni di coltura
Qualità dei terreni di coltura
Caratteristiche fisico-chimiche dei terreni di coltura
pH
osmolarità
Temperatura
ambiente gassoso: O2 & CO2
Condizione di coltura
E. Van den Abbeel, 2010
Dott.ssa G. Tomasi
Gli incubatori per la Fecondazione in Vitro
La concentrazione di CO2 dipende dal terreno di coltura utilizzato e deve essere
monitorata.
Il pH dei terreni di coltura dovrebbe essere controllato.
Le fluttuazioni di temperatura dovrebbero essere evitate.
L’aria dovrebbe essere filtrata e purificata.
Dott.ssa G. Tomasi
Good Laboratory Practice
Temperatura: 37°C ± 0.1
Umidità > 90%
Daily record di temperatura e CO2
Controllare il pH dei terreni di coltura quando si introduce un nuovo lotto
Sostituire l’acqua una volta alla settimana (acqua ultrapura)
Pulire i ripiani una volta alla settimana
Campionamenti microbiologici ogni trimestre
Sostituire i filtri HEPA e VOC ogni anno
Cosa fare e non fare
Leggere sempre il manuale prima di utilizzare l’incubatore
“If it is not broken, do not fix it” (controlli di routine)
Non introdurre contenitori con etichette
Ricordare che l’ambiente del laboratorio può avere effetti sull’ambiente
dell’incubatore
Dott.ssa G. Tomasi
Fonti principali di stress ossidativo
Esposizione alla luce
Tracce di metalli di transizione nei terreni di coltura
Alta concentrazione di ossigeno (20%)
Antiossidanti
– Combattere le Specie Reattive dell’Ossigeno (ROS)
Possono presentarsi come normale prodotto del metabolismo cellulare.
La composizione dei terreni di coltura può influenzare il tasso di produzione
dei ROS.
La maggior parte dei terreni in commercio contiene antiossidanti.
Concentrazione di O2
– 5% vs 20% O2 ?? – dibattito in corso …
E. Van den Abbeel, 2010
Dott.ssa G. Tomasi
Conseguenze dello stress in vitro
Ritardi nello sviluppo embrionale
Arresto nello sviluppo spesso prima dell’attivazione
del genoma embrionale
Alterazione della fisiologia embrionale, in particolare
del metabolismo
Alterazione dell’espressione genica
Alterazione dell’imprinting di alcuni geni
Alterazione della vitalità
E. Van den Abbeel, 2010
Dott.ssa G. Tomasi
Terreni di coltura
Un buon sistema di coltura dovrebbe garantire:
Alto tasso di fertilizzazione
Clivaggio corretto e buona morfologia embrionale
Un alto numero di embrioni con buona morfologia
Un alto pregnancy rate con transfer da fresco
Un basso tasso di aborti
Un alto cumulative delivery rate (fresh + frozen)
Buona performance = Successo clinico
“back
to nature”
“let the embryo
choose”
A. Sunde, 2009 – Oral Comunication
Dott.ssa G. Tomasi
Embryo Viability
Qualità embrionale
Manipolazione di gameti
e embrioni
Minimizzare lo stress durante la manipolazione
in vitro di gameti ed embrioni
D.Gardner & M.Lane – Textbook of Assisted Reproductive Techniques
Dott.ssa G. Tomasi
Handling Medium e Mantenimento del pH
Scala logaritmica
pH extracellulare
equilibrio tra
concentrazione di CO2 e
concentrazione di
bicarbonato
pH intracellulare
Sistemi di trasporto nelle
membrane
co2
D.Gardner & M.Lane – Textbook of Assisted Reproductive Techniques
Dott.ssa G. Tomasi
Condizioni ottimali e Handling Medium
pH extracellulare
pH ottimale per le
colture embrionali è 7.2
pH intracellulare
acidi monocarbossilici
nel terreno (lattato e
piruvato) e dalla
presenza di amminoacidi
Gli stadi di sviluppo embrionale più avanzati (morula e blasto)
regolano il pHi più rigorosamente degli embrioni in cleavage stage.
Handling Medium
I cosiddetti handling medium sono quei terreni di coltura formulati
per resistere ai cambiamenti nella concentrazione di CO2, cioè quei
terreni grazie ai quali è possibile manipolare gameti ed embrioni al di
fuori dell’incubatore.
D.Gardner & M.Lane – Textbook of Assisted Reproductive Techniques
Dott.ssa G. Tomasi
Un buon terreno di coltura…per avere buone performance?
Dott.ssa G. Tomasi
Le cause dell’infertilità
Dott.ssa Giovanna Tomasi
Biologa
CRA – Centro Riproduzione Assistita - Catania
www.cragroup.it
Seminario Facoltà Scienze Biologiche
8 e 10 maggio 2012
Introduzione
ANAMNESI
età
fattori tossici ambientali
abuso di alcol e fumo
assunzione di farmaci
interventi
menarca
irregolarità del ciclo
ESAME OBIETTIVO
esame ginecologico
(malformazioni, infiammazioni)
assetto endocrino
dosaggi ormonali
ANAMNESI
età puberale
malattie veneree
patologie (parotite, brucellosi,
fibrosi cistica)
fattori tossici ambientali
abuso di alcol e fumo
assunzione di farmaci
traumi
ESAME CLINICO
anomalie a carico del pene e
testicoli
esame del liquido seminale
Dott.ssa G. Tomasi
Introduzione: Cause di infertilità
Fattore Tubarico
Le tube di Falloppio sono bloccate o
danneggiate. I danni alle tube sono
spesso frutto di infezioni sessuali
trascurate (Chlamydia).
Disturbi del ciclo ovulatorio
Alterazioni ormonali del ciclo ovulatorio
Endometriosi
Crescita anomala di tessuto simile a
quello che riveste normalmente l'interno
dell'utero (endometrio), in altre sedi.
Fattore uterino
Alterazioni dell’utero come unica
causa di infertilità sono relativamente
rare e per lo più sono correlate ad un
aumentato rischio di aborto.
Poliabortività
Quando si susseguono due o più
aborti spontanei. Diverse le cause:
malconformazione
dell'utero,
alterazioni dello sviluppo, presenza di
fibromi o di infezioni dell'endometrio,
problemi genetici.
Dott.ssa G. Tomasi
Introduzione: Cause di infertilità
Fattori genetici e congeniti
Fattori immunitari
La presenza di alterazioni numeriche o
strutturali
del
cariotipo
possono
rispettivamente
provocare
una
menopausa precoce ed un elevato
rischio di aborti ripetuti. In alcuni casi
le alterazioni cromosomiche sono
causa di infertilità.
Infertilità può essere un sintomo
frequente di una malattia autoimmune
sistemica.
Terapie anti-tumorali
Fattori nutrizionali, abitudini
di vita, malattie sistemiche,
stress
cicli di chemio e/o radioterapia possono
distruggere la funzionalità del tessuto
ovarico producendo una menopausa
precoce.
Fattore età
La vita riproduttiva della donna è
limitata nel tempo.
Dott.ssa G. Tomasi
Introduzione: Cause di infertilità
VARICOCELE
Dilatazione varicosa delle vene dello
scroto (il sacco cutaneo che contiene i
testicoli) che provoca l'aumento della
temperatura del testicolo. L'aumento
delle temperatura interferisce con la
produzione di spermatozoi.
CRIPTORCHIDISMO
È la mancata o incompleta discesa dei
testicoli nello scroto. E' un difetto
congenito che può compromettere la
produzione di spermatozoi.
INFEZIONI
Se cronicizzate possono causare il
restringimento parziale o totale dei dotti
deferenti. Se ostruiti impediscono il
passaggio degli spermatozoi al pene per
l'emissione all'esterno.
INSUFFICIENZA ORMONALE
Se la quantità di ormoni prodotti non è
sufficiente a stimolare i testicoli per la
produzione di spermatozoi.
ANOMALIE GENETICHE
Alcune causano una scarsa o nulla
produzione
di
spermatozoi
(per
esempio nella microdelezione del
cromosoma Y).
FATTORI IMMUNOLOGICI
L'organismo maschile può produrre
anticorpi
anti-spermatozoo.
Anche
l'organismo femminile può produrre
anticorpi antispermatozoo (quando a
contatto con il muco cervicale).
Dott.ssa G. Tomasi
Tecniche di micromanipolazione
Dott.ssa Giovanna Tomasi
Biologa
CRA – Centro Riproduzione Assistita - Catania
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Seminario Facoltà Scienze Biologiche
8 e 10 maggio 2012
LE TECNICHE DI FECONDAZIONE ASSISTITA
Tecniche che prevedono un qualunque grado di manipolazione
dei gameti al fine di risolvere una condizione di sterilità.
INSEMINAZIONE INTRAUTERINA
SELEZIONE
DELLE COPPIE
INDUZIONE
DELLA CFM
FIVET
ICSI /MESA-TESA
la PMA in Laboratorio
Dott.ssa G. Tomasi
L’induzione della crescita follicolare multipla
In natura il ciclo ovulatorio fisiologico implica l’ovulazione di un solo ovocita che se
fertilizzato continua i suoi processi di divisione cellulare all’interno della tuba per poi
giungere in utero (5°-6° giorno dalla fertilizzazione) allo stadio di blastocisti per poi
impiantarsi.
Le tecniche di fecondazione in vitro prevedono, invece, la crescita di più follicoli in seguito
ad induzione follicolare multipla attraverso somministrazione di opportuna terapia
sottoforma di gonadotropine che inducono la crescita follicolare allo scopo di poter
reclutare un maggior numero di ovociti al fine di aumentare le chance di successo.
Dott.ssa G. Tomasi
Le Tecniche di PMA: Primo Livello
Inseminazione intrauterina
con seme omologo
(cioè seme del partner)
AIH
È una tecnica indicata nei casi di:
infertilità inspiegata
presenza di almeno una tuba pervia
anovularietà
endometriosi minima o moderata (stadio 1 e 2)
fattore maschile di medio grado
difficoltà nel rapporto sessuale (vaginismo).
Quando i follicoli raggiungono le dimensioni di circa 18 mm, l’ovulazione viene
indotta con l’iniezione della gonadotropina corionica umana (hCG).
Il giorno dell'inseminazione, il liquido seminale del partner viene raccolto e trattato
in laboratorio in modo da selezionare e concentrare gli spermatozoi mobili in un
piccolo volume.
Dott.ssa G. Tomasi
Le Tecniche di PMA: Primo Livello
Trattamento in laboratorio di campioni normozoospermici di liquido seminale
Stratificare e incubare
Due lavaggi
Incubazione
almeno 1h e
30 minuti
sp
sp
Dott.ssa G. Tomasi
Le Tecniche di PMA: Primo Livello
Inseminazione intrauterina con seme omologo
(cioè seme del partner) - AIH
Il seme così preparato verrà deposto dal ginecologo nell'utero utilizzando un catetere molto
sottile e morbido. Questa procedura è eseguita in ambulatorio e non è invasiva.
Dott.ssa G. Tomasi
TECNICHE DI FECONDAZIONE ASSISTITA
Prelievo
ovocitario
Le tecniche di secondo livello sono
quelle nelle quali la fecondazione tra
gamete maschile e femminile
avviene in sede extra corporea cioè
in vitro.
Inseminazione
in vitro
Coltura
embrionale
Embryo
Transfer
Dott.ssa G. Tomasi
Le Tecniche di PMA: Secondo Livello
Prelievo ovocitario o Pick-up
Screening del fluido
follicolare per la ricerca
dell’ovocita…
…visione allo
stereomicroscopio di
ovociti recuperati dal
fluido follicolare
Dott.ssa G. Tomasi
Valutazione della maturità ovocitaria
Gli ovociti prelevati sono circondati dalle cellule del cumulo ooforo
che insieme alle cellule della corona radiata (le cellule più interne),
formano il complesso cumulo corona – CCO.
Sathananthan et al 1993
Dott.ssa G. Tomasi
FIVET o ICSI?
FIVET
Età della donna < 35
Motilità veloce e rettilinea > 80%
Morfologia FN > 4% (Kruger s.c.)
ICSI
Età della donna > 35
Motilità veloce e rettilinea 0-50%
Morfologia FN < 4% (Kruger s.c.)
Dott.ssa G. Tomasi
FIVET: In Vitro Fertilization and Embryo Transfer
Nella tecnica FIVET l’incontro tra lo spermatozoo e l’ovocita avviene in una goccia di
terreno di coltura deposta sotto olio di paraffina.
Il meccanismo di legame e di entrata dello spermatozoo è naturale e fisiologico.
Sono ricreate in laboratorio le condizioni presenti nelle vie genitali femminili per
consentire l’incontro tra i gameti e la successiva fertilizzazione.
Dott.ssa G. Tomasi
Le Tecniche di PMA: FIVET
Il giorno del pick-up, il partner
maschile produce un campione di
liquido seminale che viene
trattato in laboratorio con le
stesse modalità dell’inseminazione
semplice. Una certa quota di
spermatozoi
mobili
ottenuti
vengono incubati in una piastra di
coltura insieme agli ovociti
prelevati.
Dopo 16-18 ore di incubazione si verifica l’avvenuta fertilizzazione, cioè la
formazione dello zigote dove si possono osservare i due pronuclei (quello
maschile e femminile).
Per poter osservare l’avvenuta formazione degli zigoti, è necessario
allontanare meccanicamente le cellule del cumulo ooforo dalla cellula uovo.
Gli ovociti correttamente fecondati vengono mantenuti in coltura per altre 48
– 72 ore (al Giorno 2 o Giorno 3) dall’inseminazione, quindi gli embrioni
vengono trasferiti in utero attraverso un catetere. Gli embrioni trasferiti al
terzo giorno dovrebbero essere formati dalle 6 alle 8 cellule.
Dott.ssa G. Tomasi
Le Tecniche di PMA: FIVET
Dott.ssa G. Tomasi
2010 Nobel a Robert Edwards
“padre” della Fecondazione In Vitro
Louise Joy Brown (Oldham, 25 luglio 1978) è stata la
prima persona al mondo concepita "in provetta"
attraverso il metodo dellaf ertilizzazione in vitro.
I suoi genitori, Lesley e John Brown, decisero di
ricorrere alla fecondazione assistita (metodica
sviluppata da Robert Geoffrey Edwards e Patrick
Steptoe), dopo aver provato inutilmente a concepire
per nove anni, a causa di un problema alle tube di
Falloppio di Lesley. Sebbene i Brown sapessero che
la procedura era sperimentale, i medici non dissero
loro che fino al quel momento non era ancora nato
nessun bambino attraverso quel metodo.
Louise nacque alle 23:47 al Oldham General
Hospital,
attraverso
un
parto
cesareo programmato. Alla nascita pesava 2,608 kg.
La sua nascita fu ripresa su nastro.
L’assegnazione del premio Nobel 2010 per la Medicina, al biologo Robert Edwards,
costituisce non solo un riconoscimento del prestigio di tutti i professionisti impegnati
nelle attività collegate alla riproduzione assistita , ma soprattutto dimostra come oggi
non sia più possibile ignorare gli straordinari progressi della scienza medica in questo
campo.
Dott.ssa G. Tomasi
Le Tecniche di PMA: ICSI
INTRACYTOPLASMIC SPERM INJECTION
L’inseminazione nella tecnica ICSI, a differenza della tecnica FIVET, prevede che l’entrata dello
spermatozoo all’interno del citoplasma ovocitario avvenga con l’aiuto di una micropipetta quindi
“meccanico”.
La tecnica prevede l’uso di un micromanipolatore montato su un invertoscopio.
Dott.ssa G. Tomasi
Le Tecniche di PMA: ICSI
Nel 1992 Giampiero Palermo riportava su Lancet la prima gravidanza
al mondo dopo microiniezione di uno spermatozoo direttamente
all’interno di un ovocita umano.
INTRACYTOPLASMIC SPERM INJECTION
• Gravi dispermie
• Presenza di anticorpi antispermatozoi (> 50%)
• Assenza di fertilizzazione dopo FIVET senza apparente motivo
seminale
• Utilizzo di spermatozoi epididimali e/o testicolari (MESA/TESE)
• Uomini con disfunzioni eiaculatorie (paraplegici, eiaculazione
retrograda)
• Pazienti che hanno subito chemio/radioterapia ed hanno la
necessità di congelare il seme (allo scongelamento spesso i
parametri seminali decadono)
• Globozoospermia, astenospermia grave
• Basso numero di ovociti da inseminare (?)
Dott.ssa G. Tomasi
Le Tecniche di PMA: ICSI
Ovociti in
Metafase II
Ialuronidasi
Ovocita MII
GOCCE DI MEDIUM RICOPERTE DA OLIO DI PARAFFINA
Dott.ssa G. Tomasi
L’ovocita
Dott.ssa G. Tomasi
Maturazione ovocitaria
Dott.ssa G. Tomasi
Maturazione ovocitaria
FSH-independent
FSH-dependent
LH
primary
antral
secondary
small-middle antral
< 2mm
Prophase I (GV)
meiotically
incompetent
oocytes
preovulatory
> 20mm
MIIcompetent
GVBD-competent oocytes
early embryonic development
full embryonic development
cytoplasmic
matured
Upon LH
n 2C
n 2C
Metaphase II
n 2C
Telophase I
2n4C
Metaphase I
2n4C
Meiosis
resumption
GVBD
Dott.ssa G. Tomasi
Valutazione della maturità ovocitaria
CCO compatto
Profase I
CCO atresico? post
maturo?
!?!
C.O. espanso
Corona radiata
Metafase II
Metafase I
Dott.ssa G. Tomasi
Valutazione della maturità ovocitaria:
lo stadio di Metafase II
Per definizione un ovocita di ottima qualità in
grado di “produrre” un embrione a massima
potenzialità di impianto ha le seguenti
caratteristiche:
Citoplasma incolore e uniforme nell’aspetto
Granulosità assente o moderata, comunque
uniforme
Nessuna inclusione
Dott.ssa G. Tomasi
Le Tecniche di PMA: ICSI
La tecnica prevede l’uso di un micromanipolatore ad iniezione/aspirazione idraulica montato su
un invertoscopio con contrasto di Hoffman e con diversi obiettivi.
Il micromanipolatore comprende due zone, speculari l’una rispetto l’altra, dove sono montati: i
joy-stick per i movimenti secondo gli assi x,y,z delle micropipette; gli iniettori, vere e proprie
siringhe di precisione di cui: una serve al posizionamento dell’ovocita tramite suzione, l’altra
all’iniezione vera e propria dello spermatozoo all’interno dell’ovocita.
Dott.ssa G. Tomasi
Le Tecniche di PMA: ICSI
La tecnica prevede l’uso di un micromanipolatore ad iniezione/aspirazione idraulica montato su
un invertoscopio con contrasto di Hoffman e con diversi obiettivi.
Il micromanipolatore comprende due zone, speculari l’una rispetto l’altra, dove sono montati: i
joy-stick per i movimenti secondo gli assi x,y,z delle micropipette; gli iniettori, vere e proprie
siringhe di precisione di cui: una serve al posizionamento dell’ovocita tramite suzione, l’altra
all’iniezione vera e propria dello spermatozoo all’interno dell’ovocita.
Dott.ssa G. Tomasi
Le Tecniche di PMA: ICSI
Holder per
Micropipetta
ICSI
Holder per
Micropipetta
Holding
Iniettori dx e sn
Joystick x,y,z
Dott.ssa G. Tomasi
Le Tecniche di PMA: ICSI
Holding Ø est. 110 micron
Ø int . 15 micron
ICSI Ø est. 7 micron
Ø int. 5 micron
Dott.ssa G. Tomasi
Le Tecniche di PMA: ICSI
ICSI
TECNICA
1
2
Ovocita
8
3
7
4
6
Spermatozoi in
Medium+PVP 10%
5
GOCCE DI MEDIUM RICOPERTE DA OLIO DI PARAFFINA
Dott.ssa G. Tomasi
Le Tecniche di PMA: ICSI
Dott.ssa G. Tomasi
Le Tecniche di PMA: Secondo Livello
ICSI: IntraCytoplasmatic Sperm Injection
Induzione e
Monitoraggio della
crescita follicolare
multipla
Prelievo ovocitario
PICK-UP
Fecondazione
in vitro
Il campione di liquido seminale può essere trattato anche con tecniche diverse dallo
swim-up a seconda delle caratteristiche nemaspermiche.
In questo caso, le cellule del cumulo ooforo vengono rimosse per verificare lo stadio di
maturità ovocitaria per poter poi effettuare la microiniezione (degli ovociti che si trovano
in metafase II).
Un singolo spermatozoo è iniettato direttamente nell’ovocita mediante uno strumento
chiamato micromanipolatore attraverso l’ausilio di sottili micro pipette. Gli ovociti
vengono disposti in piastre di coltura e incubati per 16-18 ore, dopo le quali viene
verificata l’avvenuta fecondazione.
Dott.ssa G. Tomasi
Le Tecniche di PMA: Secondo Livello
Quando gli spermatozoi non sono presenti nell’eiaculato, non significa necessariamente
che non siano prodotti affatto: a volte è possibile recuperarli dal testicolo o dall'epididimo
(un dotto connesso al testicolo). In questi casi, si può ricorrere alla PESA o alla TESA e poi
iniettare gli spermatozoi mediante ICSI negli ovociti.
PESA
(Percutaneous Epididymal Sperm
Aspiration)
Il
prelievo
viene
effettuato
agoaspirazione nell'epididimo.
mediante
TESA
(Percutaneous Testicular Sperm Aspiration)
Il prelievo avviene attraverso la cute del testicolo
sempre mediante agoaspirazione.
Dott.ssa G. Tomasi
Le Tecniche di PMA: Terzo Livello
Si tratta di tecniche microchirurgiche che necessitano di anestesia generale con
intubazione.
MESA
(MicrosurgicalEpididimalSpermAspiration)
Viene effettuata una piccola incisione dello scroto,
che consente di portare allo scoperto il testicolo.
Viene quindi inserito un sottilissimo ago all'interno
di uno dei tubuli epididimari, che trasportano gli
spermatozoi dal testicolo alle vie seminali. Gli
spermatozoi così raccolti possono essere impiegati
per la procedura ICSI.
TESE
(TesticularSpermExtraction)
È una tecnica microchirurgica che consiste
nel prelievo di piccoli frammenti di tessuto
testicolare (biopsia), che sono poi
analizzati successivamente dal biologo. Gli
spermatozoi recuperati vengono poi
impiegati per effettuare l’ICSI.
Dott.ssa G. Tomasi
ASSISTED HATCHING
È una tecnica di micromanipolazione che consiste nella
parziale apertura della zona pellucida dell’embrione.
Embrioni di donne tra i
34 e i 38 anni con 2 o più
tentativi IVF/ICSI falliti.
Embrioni con percentuale
di
frammentazione
superiore al 20%.
Embrioni di donne di età
superiore a 38 anni.
Embrioni
con
zona
pellucida di spessore
superiore a 17 μm
Facilitare e ottimizzare l’impianto.
Dott.ssa G. Tomasi
ASSISTED HATCHING (Apertura della Zona Pellucida)
Consiste nella creazione di una minuscola apertura della membrana esterna dell’embrione per
favorirne l’uscita e quindi l’impianto in utero.
Dott.ssa G. Tomasi
ASSISTED HATCHING (Apertura della Zona Pellucida)
AHA Ø est. 10 micron
Ø int . 5 micron
TECNICA
Holding Ø est. 110 micron
Ø int . 15 micron
1
2
3
4
Ac. di Tyrode
Embrione
GOCCE DI MEDIUM SOTTO OLIO
Dott.ssa G. Tomasi
Le prime tappe dello sviluppo
dell’embrione umano in vitro
Dott.ssa Giovanna Tomasi
Biologa
CRA – Centro Riproduzione Assistita - Catania
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Seminario Facoltà Scienze Biologiche
8 e 10 maggio 2012
Il timing del Laboratorio di Fecondazione Assistita
Valutazione Morfologica
Embrionale “in vitro”
Pick up
Stadio ovocitario
Stadio di prima
divisione cellulare
Stadio di seconda
divisione cellulare
Stadio cellulare
pre-transfer
Stadio
pronucleare
0
Transfer
+1
+2
Blastocisti
+3
+5
Dott.ssa G. Tomasi
Valutazione della fertilizzazione
Check della Fertilizzazione
16-18 ore dopo l’inseminazione
3 PN o +PN
Fertilizzazione
anormale
2PN
Fertilizzazione
Normale
0 PN
Fertilizzazione
non avvenuta
Dott.ssa G. Tomasi
Stadio pronucleare
Si basa sulla combinazione di diverse caratteristiche:
grandezza dei pronuclei, numero e distribuzione dei
nucleoli e morfologia citoplasmatica.
L. Scott et al. Hum. Rep. 1998, 2000
Dott.ssa G. Tomasi
Morfologia pronucleare
1) Ripresa della sintesi di
rRNA materno
2) Nuova formazione di
rRNA
3) Utilizzo all’attivazione
del genoma proprio
embrionale
Nucleolo: sito genico attivo dove viene
sintetizzato pre-rRNA
Dott.ssa G. Tomasi
Dallo zigote alla blastocisti
18 ore post-inseminazione - zigote
2 cellule
3 cellule
4 cellule
5 cellule
Divisione cellulare
24-48 ore ( 2° giorno )
Dott.ssa G. Tomasi
Dallo zigote alla blastocisti
Divisione cellulare
48-72 ore (3° giorno)
6 cellule
9 cellule
7 cellule
10 cellule
8 cellule
12 cellule
Dott.ssa G. Tomasi
Dallo zigote alla blastocisti
Divisione cellulare
72-120 ore (3°- 5°giorno)
inizio compattazione
contrazione ed erniazione
morula
blastocisti iniziale
fuoriuscita della blastocisti
Dott.ssa G. Tomasi
Dallo zigote alla blastocisti
Divisione cellulare
120-144 ore ( 5°- 6° giorno)
erniazione ad 8
Blastocisti e zona pellucida
Blastocisti pronta all’impianto
Dott.ssa G. Tomasi
Le Tecniche di PMA
Induzione e
Monitoraggio della
crescita follicolare
multipla
Prelievo ovocitario
PICK-UP
Fecondazione in
vitro
Transfer
Gli ovociti correttamente fecondati, provenienti da FIVET o ICSI, vengono mantenuti in
coltura per circa 72 ore dopo l’inseminazione.
Il transfer può essere eseguito in terza giornata (6-8 cellule), oppure in quinta giornata
(stadio di blastocisti)
8 cellule
blastocisti
Gli
embrioni
ottenuti
vengono
trasferiti
in
utero
attraverso
un
catetere.
Dott.ssa G. Tomasi
A colloquio con l’embrione
La crescita “in vitro” di embrioni umani vitali è l’obiettivo di un
laboratorio di fecondazione assistita ma il vero successo è il riuscire ad
individuare quale, tra tutti, sarà quello che riuscirà ad impiantarsi e
quindi a dar luogo ad una gravidanza.
A tutt’oggi non si riesce ancora ad avere uno o più parametri esatti ed
atti a determinare questa scelta in laboratorio, ma sicuramente molti,
rispetto ad ieri, sono i mezzi a nostra disposizione per restringere il
campo di selezione.
L’embrione è il prodotto di due cellule, i gameti maschile e femminile, il
suo processo di fertilizzazione, di crescita e sviluppo “in vitro” avviene il
laboratorio fino al momento del transfer intra-uterino dove esso
continuerà ad evolversi fino ad impiantarsi ed instaurare una gravidanza.
Dialogo tra l’utero e l’embrione!!!
Dott.ssa G. Tomasi
