Diapositiva 1 - CRA Centro Riproduzione Assistita
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Il ruolo del Biologo nei programmi di Fecondazione Assistita Dott.ssa Giovanna Tomasi Biologa CRA – Centro Riproduzione Assistita - Catania www.cragroup.it Seminario Facoltà Scienze Biologiche 8 e 10 maggio 2012 “Il ricordo è un modo d’incontrarsi”, Kahlil Gibran Loredana Papale “This is why we are here”, Lynette Scott Introduzione PMA l'insieme delle metodiche (mediche e di laboratorio) volte a superare l'impossibilità o la difficoltà a concepire spontaneamente INFERTILITA’ incapacità a concepire dopo 12/24 mesi di rapporti mirati non protetti. FECONDAZIONE ASSISTITA mimare “in vitro” ciò che avviene naturalmente “in vivo” Organizzazione Mondiale della Sanità Dott.ssa G. Tomasi Il laboratorio di Fecondazione Assistita Il cuore di un programma di fecondazione assistita è il laboratorio dove culmina il lavoro di un’equipe specializzata formata da medici ginecologi e biologi. Il biologo che si occupa di fecondazione assistita viene definito “embriologo” e il suo compito è quello di occuparsi dei gameti al di fuori del corpo umano per poter mimare in vitro quello che generalmente avviene in vivo. Dott.ssa G. Tomasi Il laboratorio di Fecondazione Assistita Stimulation PATIENT Oocyte quality N° of Incubator Oil overlay CULTURE SYSTEM Gas phase Gardner and Lane, 2007 LABORATORY Embryo transfer and luteal support N° of Embriologist and training level Air quality N° of embryos/drop Tissue culture- ware / contact supplies Culture media OUTCOME QC & QA Oocyte/Embryo handling outside the incubator Dott.ssa G. Tomasi Organizzazione del Laboratorio di Fecondazione Assistita GOOD LABORATORY PRACTICE QUALITY Invisible when “good”, impossible to ignore when “bad” “People forget how fast you did a job but they remember how well you did it” Howard W. Newton “Quality is never an accident, it is always the result of intelligent efforts” John Ruskin “Quality is never an accident; it is always the result of high intention, sincere effort, intelligent direction and skilfull execution; it represents the wise choice of many alternatives” William A. Foster Dott.ssa G. Tomasi Qualità nel laboratorio IVF Alti livelli di “patients care” Alti tassi di successo Quality Control (QC): L’insieme delle azioni ed iniziative che consentono di definire e tenere sotto controllo gli standard qualitativi richiesti. Quality Assurance (QA): L’insieme di tutte le attività pianificate e sistematiche richieste, in grado di garantire il soddisfacimento degli obiettivi della qualità Dott.ssa G. Tomasi Qualità nel laboratorio IVF Quality Improvement: Gestione del rischio Valutazione della qualità Risoluzione dei problemi PDCA CYCLE Say what you do… …do what you say… and Show that you do as you say Dott.ssa G. Tomasi Colture embrionali I principi base: Favorire la fertilizzazione e lo sviluppo embrionale in vitro “Normale” fertilizzazione “Normale” sviluppo embrionale Selezionare gli embrioni per il replacement in utero Elevato birth rate e bassa percentuale di gravidanze multiple Ottenere embrioni disponibili per la crioconservazione (???) Evitare i fattori che possono influenzare lo sviluppo embrionale dopo l’impianto (epigenetica) A. Sunde, 2010 Dott.ssa G. Tomasi Mantenere la vitalità embrionale Gli embrioni in vitro sono esposti a stress significativamente più alti che non in vivo La vitalità embrionale in vitro dipende da: Composizione dei terreni di coltura Qualità dei terreni di coltura Caratteristiche fisico-chimiche dei terreni di coltura pH osmolarità Temperatura ambiente gassoso: O2 & CO2 Condizione di coltura E. Van den Abbeel, 2010 Dott.ssa G. Tomasi Gli incubatori per la Fecondazione in Vitro La concentrazione di CO2 dipende dal terreno di coltura utilizzato e deve essere monitorata. Il pH dei terreni di coltura dovrebbe essere controllato. Le fluttuazioni di temperatura dovrebbero essere evitate. L’aria dovrebbe essere filtrata e purificata. Dott.ssa G. Tomasi Good Laboratory Practice Temperatura: 37°C ± 0.1 Umidità > 90% Daily record di temperatura e CO2 Controllare il pH dei terreni di coltura quando si introduce un nuovo lotto Sostituire l’acqua una volta alla settimana (acqua ultrapura) Pulire i ripiani una volta alla settimana Campionamenti microbiologici ogni trimestre Sostituire i filtri HEPA e VOC ogni anno Cosa fare e non fare Leggere sempre il manuale prima di utilizzare l’incubatore “If it is not broken, do not fix it” (controlli di routine) Non introdurre contenitori con etichette Ricordare che l’ambiente del laboratorio può avere effetti sull’ambiente dell’incubatore Dott.ssa G. Tomasi Fonti principali di stress ossidativo Esposizione alla luce Tracce di metalli di transizione nei terreni di coltura Alta concentrazione di ossigeno (20%) Antiossidanti – Combattere le Specie Reattive dell’Ossigeno (ROS) Possono presentarsi come normale prodotto del metabolismo cellulare. La composizione dei terreni di coltura può influenzare il tasso di produzione dei ROS. La maggior parte dei terreni in commercio contiene antiossidanti. Concentrazione di O2 – 5% vs 20% O2 ?? – dibattito in corso … E. Van den Abbeel, 2010 Dott.ssa G. Tomasi Conseguenze dello stress in vitro Ritardi nello sviluppo embrionale Arresto nello sviluppo spesso prima dell’attivazione del genoma embrionale Alterazione della fisiologia embrionale, in particolare del metabolismo Alterazione dell’espressione genica Alterazione dell’imprinting di alcuni geni Alterazione della vitalità E. Van den Abbeel, 2010 Dott.ssa G. Tomasi Terreni di coltura Un buon sistema di coltura dovrebbe garantire: Alto tasso di fertilizzazione Clivaggio corretto e buona morfologia embrionale Un alto numero di embrioni con buona morfologia Un alto pregnancy rate con transfer da fresco Un basso tasso di aborti Un alto cumulative delivery rate (fresh + frozen) Buona performance = Successo clinico “back to nature” “let the embryo choose” A. Sunde, 2009 – Oral Comunication Dott.ssa G. Tomasi Embryo Viability Qualità embrionale Manipolazione di gameti e embrioni Minimizzare lo stress durante la manipolazione in vitro di gameti ed embrioni D.Gardner & M.Lane – Textbook of Assisted Reproductive Techniques Dott.ssa G. Tomasi Handling Medium e Mantenimento del pH Scala logaritmica pH extracellulare equilibrio tra concentrazione di CO2 e concentrazione di bicarbonato pH intracellulare Sistemi di trasporto nelle membrane co2 D.Gardner & M.Lane – Textbook of Assisted Reproductive Techniques Dott.ssa G. Tomasi Condizioni ottimali e Handling Medium pH extracellulare pH ottimale per le colture embrionali è 7.2 pH intracellulare acidi monocarbossilici nel terreno (lattato e piruvato) e dalla presenza di amminoacidi Gli stadi di sviluppo embrionale più avanzati (morula e blasto) regolano il pHi più rigorosamente degli embrioni in cleavage stage. Handling Medium I cosiddetti handling medium sono quei terreni di coltura formulati per resistere ai cambiamenti nella concentrazione di CO2, cioè quei terreni grazie ai quali è possibile manipolare gameti ed embrioni al di fuori dell’incubatore. D.Gardner & M.Lane – Textbook of Assisted Reproductive Techniques Dott.ssa G. Tomasi Un buon terreno di coltura…per avere buone performance? Dott.ssa G. Tomasi Le cause dell’infertilità Dott.ssa Giovanna Tomasi Biologa CRA – Centro Riproduzione Assistita - Catania www.cragroup.it Seminario Facoltà Scienze Biologiche 8 e 10 maggio 2012 Introduzione ANAMNESI età fattori tossici ambientali abuso di alcol e fumo assunzione di farmaci interventi menarca irregolarità del ciclo ESAME OBIETTIVO esame ginecologico (malformazioni, infiammazioni) assetto endocrino dosaggi ormonali ANAMNESI età puberale malattie veneree patologie (parotite, brucellosi, fibrosi cistica) fattori tossici ambientali abuso di alcol e fumo assunzione di farmaci traumi ESAME CLINICO anomalie a carico del pene e testicoli esame del liquido seminale Dott.ssa G. Tomasi Introduzione: Cause di infertilità Fattore Tubarico Le tube di Falloppio sono bloccate o danneggiate. I danni alle tube sono spesso frutto di infezioni sessuali trascurate (Chlamydia). Disturbi del ciclo ovulatorio Alterazioni ormonali del ciclo ovulatorio Endometriosi Crescita anomala di tessuto simile a quello che riveste normalmente l'interno dell'utero (endometrio), in altre sedi. Fattore uterino Alterazioni dell’utero come unica causa di infertilità sono relativamente rare e per lo più sono correlate ad un aumentato rischio di aborto. Poliabortività Quando si susseguono due o più aborti spontanei. Diverse le cause: malconformazione dell'utero, alterazioni dello sviluppo, presenza di fibromi o di infezioni dell'endometrio, problemi genetici. Dott.ssa G. Tomasi Introduzione: Cause di infertilità Fattori genetici e congeniti Fattori immunitari La presenza di alterazioni numeriche o strutturali del cariotipo possono rispettivamente provocare una menopausa precoce ed un elevato rischio di aborti ripetuti. In alcuni casi le alterazioni cromosomiche sono causa di infertilità. Infertilità può essere un sintomo frequente di una malattia autoimmune sistemica. Terapie anti-tumorali Fattori nutrizionali, abitudini di vita, malattie sistemiche, stress cicli di chemio e/o radioterapia possono distruggere la funzionalità del tessuto ovarico producendo una menopausa precoce. Fattore età La vita riproduttiva della donna è limitata nel tempo. Dott.ssa G. Tomasi Introduzione: Cause di infertilità VARICOCELE Dilatazione varicosa delle vene dello scroto (il sacco cutaneo che contiene i testicoli) che provoca l'aumento della temperatura del testicolo. L'aumento delle temperatura interferisce con la produzione di spermatozoi. CRIPTORCHIDISMO È la mancata o incompleta discesa dei testicoli nello scroto. E' un difetto congenito che può compromettere la produzione di spermatozoi. INFEZIONI Se cronicizzate possono causare il restringimento parziale o totale dei dotti deferenti. Se ostruiti impediscono il passaggio degli spermatozoi al pene per l'emissione all'esterno. INSUFFICIENZA ORMONALE Se la quantità di ormoni prodotti non è sufficiente a stimolare i testicoli per la produzione di spermatozoi. ANOMALIE GENETICHE Alcune causano una scarsa o nulla produzione di spermatozoi (per esempio nella microdelezione del cromosoma Y). FATTORI IMMUNOLOGICI L'organismo maschile può produrre anticorpi anti-spermatozoo. Anche l'organismo femminile può produrre anticorpi antispermatozoo (quando a contatto con il muco cervicale). Dott.ssa G. Tomasi Tecniche di micromanipolazione Dott.ssa Giovanna Tomasi Biologa CRA – Centro Riproduzione Assistita - Catania www.cragroup.it Seminario Facoltà Scienze Biologiche 8 e 10 maggio 2012 LE TECNICHE DI FECONDAZIONE ASSISTITA Tecniche che prevedono un qualunque grado di manipolazione dei gameti al fine di risolvere una condizione di sterilità. INSEMINAZIONE INTRAUTERINA SELEZIONE DELLE COPPIE INDUZIONE DELLA CFM FIVET ICSI /MESA-TESA la PMA in Laboratorio Dott.ssa G. Tomasi L’induzione della crescita follicolare multipla In natura il ciclo ovulatorio fisiologico implica l’ovulazione di un solo ovocita che se fertilizzato continua i suoi processi di divisione cellulare all’interno della tuba per poi giungere in utero (5°-6° giorno dalla fertilizzazione) allo stadio di blastocisti per poi impiantarsi. Le tecniche di fecondazione in vitro prevedono, invece, la crescita di più follicoli in seguito ad induzione follicolare multipla attraverso somministrazione di opportuna terapia sottoforma di gonadotropine che inducono la crescita follicolare allo scopo di poter reclutare un maggior numero di ovociti al fine di aumentare le chance di successo. Dott.ssa G. Tomasi Le Tecniche di PMA: Primo Livello Inseminazione intrauterina con seme omologo (cioè seme del partner) AIH È una tecnica indicata nei casi di: infertilità inspiegata presenza di almeno una tuba pervia anovularietà endometriosi minima o moderata (stadio 1 e 2) fattore maschile di medio grado difficoltà nel rapporto sessuale (vaginismo). Quando i follicoli raggiungono le dimensioni di circa 18 mm, l’ovulazione viene indotta con l’iniezione della gonadotropina corionica umana (hCG). Il giorno dell'inseminazione, il liquido seminale del partner viene raccolto e trattato in laboratorio in modo da selezionare e concentrare gli spermatozoi mobili in un piccolo volume. Dott.ssa G. Tomasi Le Tecniche di PMA: Primo Livello Trattamento in laboratorio di campioni normozoospermici di liquido seminale Stratificare e incubare Due lavaggi Incubazione almeno 1h e 30 minuti sp sp Dott.ssa G. Tomasi Le Tecniche di PMA: Primo Livello Inseminazione intrauterina con seme omologo (cioè seme del partner) - AIH Il seme così preparato verrà deposto dal ginecologo nell'utero utilizzando un catetere molto sottile e morbido. Questa procedura è eseguita in ambulatorio e non è invasiva. Dott.ssa G. Tomasi TECNICHE DI FECONDAZIONE ASSISTITA Prelievo ovocitario Le tecniche di secondo livello sono quelle nelle quali la fecondazione tra gamete maschile e femminile avviene in sede extra corporea cioè in vitro. Inseminazione in vitro Coltura embrionale Embryo Transfer Dott.ssa G. Tomasi Le Tecniche di PMA: Secondo Livello Prelievo ovocitario o Pick-up Screening del fluido follicolare per la ricerca dell’ovocita… …visione allo stereomicroscopio di ovociti recuperati dal fluido follicolare Dott.ssa G. Tomasi Valutazione della maturità ovocitaria Gli ovociti prelevati sono circondati dalle cellule del cumulo ooforo che insieme alle cellule della corona radiata (le cellule più interne), formano il complesso cumulo corona – CCO. Sathananthan et al 1993 Dott.ssa G. Tomasi FIVET o ICSI? FIVET Età della donna < 35 Motilità veloce e rettilinea > 80% Morfologia FN > 4% (Kruger s.c.) ICSI Età della donna > 35 Motilità veloce e rettilinea 0-50% Morfologia FN < 4% (Kruger s.c.) Dott.ssa G. Tomasi FIVET: In Vitro Fertilization and Embryo Transfer Nella tecnica FIVET l’incontro tra lo spermatozoo e l’ovocita avviene in una goccia di terreno di coltura deposta sotto olio di paraffina. Il meccanismo di legame e di entrata dello spermatozoo è naturale e fisiologico. Sono ricreate in laboratorio le condizioni presenti nelle vie genitali femminili per consentire l’incontro tra i gameti e la successiva fertilizzazione. Dott.ssa G. Tomasi Le Tecniche di PMA: FIVET Il giorno del pick-up, il partner maschile produce un campione di liquido seminale che viene trattato in laboratorio con le stesse modalità dell’inseminazione semplice. Una certa quota di spermatozoi mobili ottenuti vengono incubati in una piastra di coltura insieme agli ovociti prelevati. Dopo 16-18 ore di incubazione si verifica l’avvenuta fertilizzazione, cioè la formazione dello zigote dove si possono osservare i due pronuclei (quello maschile e femminile). Per poter osservare l’avvenuta formazione degli zigoti, è necessario allontanare meccanicamente le cellule del cumulo ooforo dalla cellula uovo. Gli ovociti correttamente fecondati vengono mantenuti in coltura per altre 48 – 72 ore (al Giorno 2 o Giorno 3) dall’inseminazione, quindi gli embrioni vengono trasferiti in utero attraverso un catetere. Gli embrioni trasferiti al terzo giorno dovrebbero essere formati dalle 6 alle 8 cellule. Dott.ssa G. Tomasi Le Tecniche di PMA: FIVET Dott.ssa G. Tomasi 2010 Nobel a Robert Edwards “padre” della Fecondazione In Vitro Louise Joy Brown (Oldham, 25 luglio 1978) è stata la prima persona al mondo concepita "in provetta" attraverso il metodo dellaf ertilizzazione in vitro. I suoi genitori, Lesley e John Brown, decisero di ricorrere alla fecondazione assistita (metodica sviluppata da Robert Geoffrey Edwards e Patrick Steptoe), dopo aver provato inutilmente a concepire per nove anni, a causa di un problema alle tube di Falloppio di Lesley. Sebbene i Brown sapessero che la procedura era sperimentale, i medici non dissero loro che fino al quel momento non era ancora nato nessun bambino attraverso quel metodo. Louise nacque alle 23:47 al Oldham General Hospital, attraverso un parto cesareo programmato. Alla nascita pesava 2,608 kg. La sua nascita fu ripresa su nastro. L’assegnazione del premio Nobel 2010 per la Medicina, al biologo Robert Edwards, costituisce non solo un riconoscimento del prestigio di tutti i professionisti impegnati nelle attività collegate alla riproduzione assistita , ma soprattutto dimostra come oggi non sia più possibile ignorare gli straordinari progressi della scienza medica in questo campo. Dott.ssa G. Tomasi Le Tecniche di PMA: ICSI INTRACYTOPLASMIC SPERM INJECTION L’inseminazione nella tecnica ICSI, a differenza della tecnica FIVET, prevede che l’entrata dello spermatozoo all’interno del citoplasma ovocitario avvenga con l’aiuto di una micropipetta quindi “meccanico”. La tecnica prevede l’uso di un micromanipolatore montato su un invertoscopio. Dott.ssa G. Tomasi Le Tecniche di PMA: ICSI Nel 1992 Giampiero Palermo riportava su Lancet la prima gravidanza al mondo dopo microiniezione di uno spermatozoo direttamente all’interno di un ovocita umano. INTRACYTOPLASMIC SPERM INJECTION • Gravi dispermie • Presenza di anticorpi antispermatozoi (> 50%) • Assenza di fertilizzazione dopo FIVET senza apparente motivo seminale • Utilizzo di spermatozoi epididimali e/o testicolari (MESA/TESE) • Uomini con disfunzioni eiaculatorie (paraplegici, eiaculazione retrograda) • Pazienti che hanno subito chemio/radioterapia ed hanno la necessità di congelare il seme (allo scongelamento spesso i parametri seminali decadono) • Globozoospermia, astenospermia grave • Basso numero di ovociti da inseminare (?) Dott.ssa G. Tomasi Le Tecniche di PMA: ICSI Ovociti in Metafase II Ialuronidasi Ovocita MII GOCCE DI MEDIUM RICOPERTE DA OLIO DI PARAFFINA Dott.ssa G. Tomasi L’ovocita Dott.ssa G. Tomasi Maturazione ovocitaria Dott.ssa G. Tomasi Maturazione ovocitaria FSH-independent FSH-dependent LH primary antral secondary small-middle antral < 2mm Prophase I (GV) meiotically incompetent oocytes preovulatory > 20mm MIIcompetent GVBD-competent oocytes early embryonic development full embryonic development cytoplasmic matured Upon LH n 2C n 2C Metaphase II n 2C Telophase I 2n4C Metaphase I 2n4C Meiosis resumption GVBD Dott.ssa G. Tomasi Valutazione della maturità ovocitaria CCO compatto Profase I CCO atresico? post maturo? !?! C.O. espanso Corona radiata Metafase II Metafase I Dott.ssa G. Tomasi Valutazione della maturità ovocitaria: lo stadio di Metafase II Per definizione un ovocita di ottima qualità in grado di “produrre” un embrione a massima potenzialità di impianto ha le seguenti caratteristiche: Citoplasma incolore e uniforme nell’aspetto Granulosità assente o moderata, comunque uniforme Nessuna inclusione Dott.ssa G. Tomasi Le Tecniche di PMA: ICSI La tecnica prevede l’uso di un micromanipolatore ad iniezione/aspirazione idraulica montato su un invertoscopio con contrasto di Hoffman e con diversi obiettivi. Il micromanipolatore comprende due zone, speculari l’una rispetto l’altra, dove sono montati: i joy-stick per i movimenti secondo gli assi x,y,z delle micropipette; gli iniettori, vere e proprie siringhe di precisione di cui: una serve al posizionamento dell’ovocita tramite suzione, l’altra all’iniezione vera e propria dello spermatozoo all’interno dell’ovocita. Dott.ssa G. Tomasi Le Tecniche di PMA: ICSI La tecnica prevede l’uso di un micromanipolatore ad iniezione/aspirazione idraulica montato su un invertoscopio con contrasto di Hoffman e con diversi obiettivi. Il micromanipolatore comprende due zone, speculari l’una rispetto l’altra, dove sono montati: i joy-stick per i movimenti secondo gli assi x,y,z delle micropipette; gli iniettori, vere e proprie siringhe di precisione di cui: una serve al posizionamento dell’ovocita tramite suzione, l’altra all’iniezione vera e propria dello spermatozoo all’interno dell’ovocita. Dott.ssa G. Tomasi Le Tecniche di PMA: ICSI Holder per Micropipetta ICSI Holder per Micropipetta Holding Iniettori dx e sn Joystick x,y,z Dott.ssa G. Tomasi Le Tecniche di PMA: ICSI Holding Ø est. 110 micron Ø int . 15 micron ICSI Ø est. 7 micron Ø int. 5 micron Dott.ssa G. Tomasi Le Tecniche di PMA: ICSI ICSI TECNICA 1 2 Ovocita 8 3 7 4 6 Spermatozoi in Medium+PVP 10% 5 GOCCE DI MEDIUM RICOPERTE DA OLIO DI PARAFFINA Dott.ssa G. Tomasi Le Tecniche di PMA: ICSI Dott.ssa G. Tomasi Le Tecniche di PMA: Secondo Livello ICSI: IntraCytoplasmatic Sperm Injection Induzione e Monitoraggio della crescita follicolare multipla Prelievo ovocitario PICK-UP Fecondazione in vitro Il campione di liquido seminale può essere trattato anche con tecniche diverse dallo swim-up a seconda delle caratteristiche nemaspermiche. In questo caso, le cellule del cumulo ooforo vengono rimosse per verificare lo stadio di maturità ovocitaria per poter poi effettuare la microiniezione (degli ovociti che si trovano in metafase II). Un singolo spermatozoo è iniettato direttamente nell’ovocita mediante uno strumento chiamato micromanipolatore attraverso l’ausilio di sottili micro pipette. Gli ovociti vengono disposti in piastre di coltura e incubati per 16-18 ore, dopo le quali viene verificata l’avvenuta fecondazione. Dott.ssa G. Tomasi Le Tecniche di PMA: Secondo Livello Quando gli spermatozoi non sono presenti nell’eiaculato, non significa necessariamente che non siano prodotti affatto: a volte è possibile recuperarli dal testicolo o dall'epididimo (un dotto connesso al testicolo). In questi casi, si può ricorrere alla PESA o alla TESA e poi iniettare gli spermatozoi mediante ICSI negli ovociti. PESA (Percutaneous Epididymal Sperm Aspiration) Il prelievo viene effettuato agoaspirazione nell'epididimo. mediante TESA (Percutaneous Testicular Sperm Aspiration) Il prelievo avviene attraverso la cute del testicolo sempre mediante agoaspirazione. Dott.ssa G. Tomasi Le Tecniche di PMA: Terzo Livello Si tratta di tecniche microchirurgiche che necessitano di anestesia generale con intubazione. MESA (MicrosurgicalEpididimalSpermAspiration) Viene effettuata una piccola incisione dello scroto, che consente di portare allo scoperto il testicolo. Viene quindi inserito un sottilissimo ago all'interno di uno dei tubuli epididimari, che trasportano gli spermatozoi dal testicolo alle vie seminali. Gli spermatozoi così raccolti possono essere impiegati per la procedura ICSI. TESE (TesticularSpermExtraction) È una tecnica microchirurgica che consiste nel prelievo di piccoli frammenti di tessuto testicolare (biopsia), che sono poi analizzati successivamente dal biologo. Gli spermatozoi recuperati vengono poi impiegati per effettuare l’ICSI. Dott.ssa G. Tomasi ASSISTED HATCHING È una tecnica di micromanipolazione che consiste nella parziale apertura della zona pellucida dell’embrione. Embrioni di donne tra i 34 e i 38 anni con 2 o più tentativi IVF/ICSI falliti. Embrioni con percentuale di frammentazione superiore al 20%. Embrioni di donne di età superiore a 38 anni. Embrioni con zona pellucida di spessore superiore a 17 μm Facilitare e ottimizzare l’impianto. Dott.ssa G. Tomasi ASSISTED HATCHING (Apertura della Zona Pellucida) Consiste nella creazione di una minuscola apertura della membrana esterna dell’embrione per favorirne l’uscita e quindi l’impianto in utero. Dott.ssa G. Tomasi ASSISTED HATCHING (Apertura della Zona Pellucida) AHA Ø est. 10 micron Ø int . 5 micron TECNICA Holding Ø est. 110 micron Ø int . 15 micron 1 2 3 4 Ac. di Tyrode Embrione GOCCE DI MEDIUM SOTTO OLIO Dott.ssa G. Tomasi Le prime tappe dello sviluppo dell’embrione umano in vitro Dott.ssa Giovanna Tomasi Biologa CRA – Centro Riproduzione Assistita - Catania www.cragroup.it Seminario Facoltà Scienze Biologiche 8 e 10 maggio 2012 Il timing del Laboratorio di Fecondazione Assistita Valutazione Morfologica Embrionale “in vitro” Pick up Stadio ovocitario Stadio di prima divisione cellulare Stadio di seconda divisione cellulare Stadio cellulare pre-transfer Stadio pronucleare 0 Transfer +1 +2 Blastocisti +3 +5 Dott.ssa G. Tomasi Valutazione della fertilizzazione Check della Fertilizzazione 16-18 ore dopo l’inseminazione 3 PN o +PN Fertilizzazione anormale 2PN Fertilizzazione Normale 0 PN Fertilizzazione non avvenuta Dott.ssa G. Tomasi Stadio pronucleare Si basa sulla combinazione di diverse caratteristiche: grandezza dei pronuclei, numero e distribuzione dei nucleoli e morfologia citoplasmatica. L. Scott et al. Hum. Rep. 1998, 2000 Dott.ssa G. Tomasi Morfologia pronucleare 1) Ripresa della sintesi di rRNA materno 2) Nuova formazione di rRNA 3) Utilizzo all’attivazione del genoma proprio embrionale Nucleolo: sito genico attivo dove viene sintetizzato pre-rRNA Dott.ssa G. Tomasi Dallo zigote alla blastocisti 18 ore post-inseminazione - zigote 2 cellule 3 cellule 4 cellule 5 cellule Divisione cellulare 24-48 ore ( 2° giorno ) Dott.ssa G. Tomasi Dallo zigote alla blastocisti Divisione cellulare 48-72 ore (3° giorno) 6 cellule 9 cellule 7 cellule 10 cellule 8 cellule 12 cellule Dott.ssa G. Tomasi Dallo zigote alla blastocisti Divisione cellulare 72-120 ore (3°- 5°giorno) inizio compattazione contrazione ed erniazione morula blastocisti iniziale fuoriuscita della blastocisti Dott.ssa G. Tomasi Dallo zigote alla blastocisti Divisione cellulare 120-144 ore ( 5°- 6° giorno) erniazione ad 8 Blastocisti e zona pellucida Blastocisti pronta all’impianto Dott.ssa G. Tomasi Le Tecniche di PMA Induzione e Monitoraggio della crescita follicolare multipla Prelievo ovocitario PICK-UP Fecondazione in vitro Transfer Gli ovociti correttamente fecondati, provenienti da FIVET o ICSI, vengono mantenuti in coltura per circa 72 ore dopo l’inseminazione. Il transfer può essere eseguito in terza giornata (6-8 cellule), oppure in quinta giornata (stadio di blastocisti) 8 cellule blastocisti Gli embrioni ottenuti vengono trasferiti in utero attraverso un catetere. Dott.ssa G. Tomasi A colloquio con l’embrione La crescita “in vitro” di embrioni umani vitali è l’obiettivo di un laboratorio di fecondazione assistita ma il vero successo è il riuscire ad individuare quale, tra tutti, sarà quello che riuscirà ad impiantarsi e quindi a dar luogo ad una gravidanza. A tutt’oggi non si riesce ancora ad avere uno o più parametri esatti ed atti a determinare questa scelta in laboratorio, ma sicuramente molti, rispetto ad ieri, sono i mezzi a nostra disposizione per restringere il campo di selezione. L’embrione è il prodotto di due cellule, i gameti maschile e femminile, il suo processo di fertilizzazione, di crescita e sviluppo “in vitro” avviene il laboratorio fino al momento del transfer intra-uterino dove esso continuerà ad evolversi fino ad impiantarsi ed instaurare una gravidanza. Dialogo tra l’utero e l’embrione!!! Dott.ssa G. Tomasi
