2012
Terreni di coltura: è possibile
compararne oggettivamente
le performance?
Dott.ssa Giovanna Tomasi
CRA
Perché confrontare i terreni di coltura?
Confrontare i terreni
di coltura
Esigenza di
miglioramento continuo
obiettivo finale degli
operatori del settore
% GRAVIDANZA
TAKE HOME BABY RATE
Dott.ssa G. Tomasi
Come confrontare i terreni di coltura?
Valutare la reale composizione dei
terreni di coltura
(analisi qualitativa e quantitativa)
Indicatori di processo
Costi
Sono anche i parametri
da considerare per la
scelta di un terreno di
coltura
Capacità di approvvigionamento
Controlli qualità
Dott.ssa G. Tomasi
Considerazioni
Ridotte possibilità di studio degli
effetti dei terreni di coltura sugli
embrioni umani.
(problemi etici e morali)
Mancanza dettagliate informazioni
sulla composizione in termini
quantitativi dei terreni di coltura.
G. Vajta, L.Rienzi, A.Cobo, J. Yovich, 2010 – RBM OnLine
Dott.ssa G. Tomasi
Quality Control
Acqua
ph
Osmolarità
Parametri chimico-fisici
(285±2mOSM/Kg)
Sono parametri
confrontabili?
condizioni di
conservazione
costi
efficienza
approvvigionamento
in relazione alla
durata di
conservazione
Quality Control
Test
A. Sunde, 2009 – Oral Comunication
Affidabilità del fornitore
Ditta produttrice
Dott.ssa G. Tomasi
Gli indicatori di processo
fertilization rate
Sono parametri
confrontabili
cleavage rate
implantation rate
pregnancy rate
take home baby rate
Il limite di questo tipo di analisi è che
tutti questi parametri dipendono dalla
concomitanza di numerosi fattori:
Caratteristiche
fisio-patologiche
delle pazienti.
Sistema di coltura impiegato nel
laboratorio considerato in toto (tipo
di incubatori, tipo di piastre,
manualità degli operatori)
Dott.ssa G. Tomasi
Buona performance = Successo clinico
Un buon sistema di coltura dovrebbe garantire:
Alto tasso di fertilizzazione
Clivaggio corretto e buona morfologia embrionale
Un alto numero di embrioni con buona morfologia
Un alto pregnancy rate con transfer da fresco
Un basso tasso di aborti
Un alto cumulative delivery rate (fresh + frozen)
A. Sunde, 2009 – Oral Comunication
Dott.ssa G. Tomasi
Come confrontare le performance dei terreni di coltura?
Componenti dei
terreni di coltura
Confronto
qualitativo
Confronto tra
marche e non
quantità ?
Confronto
quantitativo
Conoscenze acquisite sul metabolismo
embrionale in vivo e in vitro
“Filosofia dei terreni di coltura”
Letteratura Scientifica
Organizzazione del Laboratorio
“back
to nature”
“let the embryo
choose”
Dott.ssa G. Tomasi
EmbryoViability
Qualità embrionale
Manipolazione di gameti
e embrioni
Minimizzare lo stress durante la manipolazione
in vitro di gameti ed embrioni
D.Gardner & M.Lane – Textbook of Assisted Reproductive Techniques
Dott.ssa G. Tomasi
Handling Medium e Mantenimento del pH
Scala logaritmica
pH extracellulare
equilibrio tra
concentrazione di CO2 e
concentrazione di
bicarbonato
pH intracellulare
Sistemi di trasporto nelle
membrane
co2
D.Gardner & M.Lane – Textbook of Assisted Reproductive Techniques
Dott.ssa G. Tomasi
IMPORTANZA DEL pH PER EMBRIONI E OVOCITI
La variazione del pH intracellulare può alterare la corretta
localizzazione dei mitocondri e dei microfilamanti di actina
(notevoli variazioni), può alterare la regolazione di alcuni
enzimi, tra cui la fosfofruttochinasi, un aumento anche
piccolo del pH può determinare un incremento della
glicolisi dell’embrione e una diminuzione delle reazioni di
ossidazione.
Recenti studi (Zander, 2008), condotti sui topi mostrano
che variazioni del pH extracellulare possono determinare
una riduzione del numero di cellule che compongono la
blastocisti, incrementare i livelli di apoptosi ed avere effetti
sul peso dei nati (più basso rispetto al controllo).
Un aumento del pH sull’ovocita sembra avere effetto
sull’assemblaggio/disassemblaggio dei microtubuli.
J. Swain, 2010 - RBM OnLine
Dott.ssa G. Tomasi
Condizioni ottimali e Handling Medium
pH extracellulare
pH ottimale per le
colture embrionali è 7.2
pH intracellulare
acidi monocarbossilici
nel terreno (lattato e
piruvato) e dalla
presenza di amminoacidi
Gli stadi di sviluppo embrionale più avanzati (morula e blasto)
regolano il pHi più rigorosamente degli embrioni in cleavage stage.
Handling Medium
I cosiddetti handling medium sono quei terreni di coltura formulati
per resistere ai cambiamenti nella concentrazione di CO2, cioè quei
terreni grazie ai quali è possibile manipolare gameti ed embrioni al di
fuori dell’incubatore.
D.Gardner & M.Lane – Textbook of Assisted Reproductive Techniques
Dott.ssa G. Tomasi
Good’s Buffers
pKa compreso tra pH 6.0 e 8.0
Atossicità
effetti limitati sulle reazioni biochimiche
bassa assorbanza
stabilità idrolitica e enzimatica
elevata stabilità ai cambiamenti di temperatura e
concentrazione di ioni e sali nella soluzione
ridotta capacita di interazione con i cationi minerali
limitata permeabilità alle membrane biologiche
(di Norman Good e colleghi, 1996)
Dott.ssa G. Tomasi
Buffer
HEPES
Supporta con successo lo sviluppo
embrionale
in
presenza
di
bicarbonato nel medesimo terreno
di coltura (in assenza tassi di
fertilizzazione più bassi).
Iwasaki ha osservato un aumento
della
frammentazione
(studi
condotti
sui
maiali)
se
la
concentrazione supera i 35mmol/l.
Tendenza ad alterare canali ionici
delle membrane e fototossicità,
produce perossido di idrogeno se
esposto alla luce ambientale (LepeZuniga et al.).
J. Swain, 2010 - RBM OnLine
MOPS
Più “embryo-friendly”
all’hepes.
rispetto
Effetti ben documentati, sugli
animali.
Assenza
di
letteratura
embrioni umani.
Lavora meglio a 25°C
HEPES
MOPS
Dott.ssa G. Tomasi
su
HEPES vs MOPS: dati CRA
HEPES N°totale embrioni 700
NUMERO
BLASTOMERI
EMBRIONI
% FRG DAY 3
G1
337
7,76 N°
G2
113
6
11%
G3
258
4 N° MEDIO
11%
MEDIO
4%
MOPS
N°totale embrioni 2198
NUMERO
BLASTOMERI
EMBRIONI
% FRG DAY 3
G1
1026
7,74 N° MEDIO 5%
G2
355
6
9%
G3
811
4,2 N° MEDIO
11%
Con la cortese collaborazione della Dott.ssa A.Bruno - CRA
Dott.ssa G. Tomasi
Considerazioni
La presenza di aa è fondamentale per il mantenimento dell’omeostasi
del gamete o dell’embrione. Senza la loro presenza si andrebbe
incontro alla perdita di aa endogeni e ad un notevole dispendio di
energia quando quando trasferititi nel terreno per la coltura o in utero
(ovociti dopo il pick-up/embrioni dopo hatching).
Un buon handling medium dovrebbe contenere aa non essenziali e
come fonte di glutammina l’alanil-glutammina per ridurre l’accumulo
di ammonio dannoso per lo sviluppo embrionale.
J. Swain, 2010 - RBM OnLine
Dott.ssa G. Tomasi
Culture Medium
Embryo Viability
Acido Ialuronico
Glicosamminoglicano
i
cui
livelli
aumentano in utero durante l’impianto
embrionale in vivo.
Sulla superficie embrionale è presente
un recettore specifico.
È un ottimo promotore della vitalità
embrionale:ha attività antimmunogenica,
aumenta
l’angiogenesi,
facilità
la
diffusione del terreno di coltura utilizzato
durante il transfer nel viscoso ambiente
uterino.
D. Gardner – Manuale Vitrolife G5 Series
Dott.ssa G. Tomasi
Effetti dell’Acido Ialuronico
ET-medium con HA
ET-medium con HA
Clinical
Implantation
Pregnancy
Rate
Rate
38.8%
22.3%
ET-medium senza HA
Clinical
Implantation
Pregnancy
Rate
Rate
36.1%
19.2%
Annual Meeting, 2011
Clinical
Pregnancy
Rate
Implantation
Rate
54,6%
32%
ET-medium senza HA
Clinical
Implantation
Pregnancy
Rate
Rate
48.5%
24.7%
Dott.ssa G. Tomasi
Terreni con Acido Ialuronico
vs Terreni senza Acido Ialuronico – DATI CRA
Colture medium senza HA
Colture medium con HA
N° cicli
123
N° cicli
102
Età media
34,9
Età media
36.7
% Fert.
70 %
% Fert.
Embr. Ott. (G1+G2)
45 %
Embr. Ott. (G1+G2)
67 %
Embr. Tr. (G1+G2)
63,4%
Embr. Tr. (G1+G2)
82,8%
Clinical
Implantation
Pregnancy
Rate
Rate
31,8%
19,8%
71.5%
Clinical
Pregnancy
Rate
Implantation
Rate
39%
22.3%
Con la cortese collaborazione della Dott.ssa A.Bruno - CRA
Dott.ssa G. Tomasi
Un buon terreno di coltura…per avere buone performance?
Dott.ssa G. Tomasi
Scelta del terreno di coltura
PERFORMANCE
OUTCOMES
COSTI/BENEFICI
TAKE HOME BABY
Sierr UPDATE, 2011 - M.L.Papale
Dott.ssa G. Tomasi
“Il ricordo è un modo d’incontrarsi”, Kahlil Gibran
Loredana Papale
“This is why we are here”, Lynette Scott
