Terreni di Coltura : è possibile compararne le performance?
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2012 Terreni di coltura: è possibile compararne oggettivamente le performance? Dott.ssa Giovanna Tomasi CRA Perché confrontare i terreni di coltura? Confrontare i terreni di coltura Esigenza di miglioramento continuo obiettivo finale degli operatori del settore % GRAVIDANZA TAKE HOME BABY RATE Dott.ssa G. Tomasi Come confrontare i terreni di coltura? Valutare la reale composizione dei terreni di coltura (analisi qualitativa e quantitativa) Indicatori di processo Costi Sono anche i parametri da considerare per la scelta di un terreno di coltura Capacità di approvvigionamento Controlli qualità Dott.ssa G. Tomasi Considerazioni Ridotte possibilità di studio degli effetti dei terreni di coltura sugli embrioni umani. (problemi etici e morali) Mancanza dettagliate informazioni sulla composizione in termini quantitativi dei terreni di coltura. G. Vajta, L.Rienzi, A.Cobo, J. Yovich, 2010 – RBM OnLine Dott.ssa G. Tomasi Quality Control Acqua ph Osmolarità Parametri chimico-fisici (285±2mOSM/Kg) Sono parametri confrontabili? condizioni di conservazione costi efficienza approvvigionamento in relazione alla durata di conservazione Quality Control Test A. Sunde, 2009 – Oral Comunication Affidabilità del fornitore Ditta produttrice Dott.ssa G. Tomasi Gli indicatori di processo fertilization rate Sono parametri confrontabili cleavage rate implantation rate pregnancy rate take home baby rate Il limite di questo tipo di analisi è che tutti questi parametri dipendono dalla concomitanza di numerosi fattori: Caratteristiche fisio-patologiche delle pazienti. Sistema di coltura impiegato nel laboratorio considerato in toto (tipo di incubatori, tipo di piastre, manualità degli operatori) Dott.ssa G. Tomasi Buona performance = Successo clinico Un buon sistema di coltura dovrebbe garantire: Alto tasso di fertilizzazione Clivaggio corretto e buona morfologia embrionale Un alto numero di embrioni con buona morfologia Un alto pregnancy rate con transfer da fresco Un basso tasso di aborti Un alto cumulative delivery rate (fresh + frozen) A. Sunde, 2009 – Oral Comunication Dott.ssa G. Tomasi Come confrontare le performance dei terreni di coltura? Componenti dei terreni di coltura Confronto qualitativo Confronto tra marche e non quantità ? Confronto quantitativo Conoscenze acquisite sul metabolismo embrionale in vivo e in vitro “Filosofia dei terreni di coltura” Letteratura Scientifica Organizzazione del Laboratorio “back to nature” “let the embryo choose” Dott.ssa G. Tomasi EmbryoViability Qualità embrionale Manipolazione di gameti e embrioni Minimizzare lo stress durante la manipolazione in vitro di gameti ed embrioni D.Gardner & M.Lane – Textbook of Assisted Reproductive Techniques Dott.ssa G. Tomasi Handling Medium e Mantenimento del pH Scala logaritmica pH extracellulare equilibrio tra concentrazione di CO2 e concentrazione di bicarbonato pH intracellulare Sistemi di trasporto nelle membrane co2 D.Gardner & M.Lane – Textbook of Assisted Reproductive Techniques Dott.ssa G. Tomasi IMPORTANZA DEL pH PER EMBRIONI E OVOCITI La variazione del pH intracellulare può alterare la corretta localizzazione dei mitocondri e dei microfilamanti di actina (notevoli variazioni), può alterare la regolazione di alcuni enzimi, tra cui la fosfofruttochinasi, un aumento anche piccolo del pH può determinare un incremento della glicolisi dell’embrione e una diminuzione delle reazioni di ossidazione. Recenti studi (Zander, 2008), condotti sui topi mostrano che variazioni del pH extracellulare possono determinare una riduzione del numero di cellule che compongono la blastocisti, incrementare i livelli di apoptosi ed avere effetti sul peso dei nati (più basso rispetto al controllo). Un aumento del pH sull’ovocita sembra avere effetto sull’assemblaggio/disassemblaggio dei microtubuli. J. Swain, 2010 - RBM OnLine Dott.ssa G. Tomasi Condizioni ottimali e Handling Medium pH extracellulare pH ottimale per le colture embrionali è 7.2 pH intracellulare acidi monocarbossilici nel terreno (lattato e piruvato) e dalla presenza di amminoacidi Gli stadi di sviluppo embrionale più avanzati (morula e blasto) regolano il pHi più rigorosamente degli embrioni in cleavage stage. Handling Medium I cosiddetti handling medium sono quei terreni di coltura formulati per resistere ai cambiamenti nella concentrazione di CO2, cioè quei terreni grazie ai quali è possibile manipolare gameti ed embrioni al di fuori dell’incubatore. D.Gardner & M.Lane – Textbook of Assisted Reproductive Techniques Dott.ssa G. Tomasi Good’s Buffers pKa compreso tra pH 6.0 e 8.0 Atossicità effetti limitati sulle reazioni biochimiche bassa assorbanza stabilità idrolitica e enzimatica elevata stabilità ai cambiamenti di temperatura e concentrazione di ioni e sali nella soluzione ridotta capacita di interazione con i cationi minerali limitata permeabilità alle membrane biologiche (di Norman Good e colleghi, 1996) Dott.ssa G. Tomasi Buffer HEPES Supporta con successo lo sviluppo embrionale in presenza di bicarbonato nel medesimo terreno di coltura (in assenza tassi di fertilizzazione più bassi). Iwasaki ha osservato un aumento della frammentazione (studi condotti sui maiali) se la concentrazione supera i 35mmol/l. Tendenza ad alterare canali ionici delle membrane e fototossicità, produce perossido di idrogeno se esposto alla luce ambientale (LepeZuniga et al.). J. Swain, 2010 - RBM OnLine MOPS Più “embryo-friendly” all’hepes. rispetto Effetti ben documentati, sugli animali. Assenza di letteratura embrioni umani. Lavora meglio a 25°C HEPES MOPS Dott.ssa G. Tomasi su HEPES vs MOPS: dati CRA HEPES N°totale embrioni 700 NUMERO BLASTOMERI EMBRIONI % FRG DAY 3 G1 337 7,76 N° G2 113 6 11% G3 258 4 N° MEDIO 11% MEDIO 4% MOPS N°totale embrioni 2198 NUMERO BLASTOMERI EMBRIONI % FRG DAY 3 G1 1026 7,74 N° MEDIO 5% G2 355 6 9% G3 811 4,2 N° MEDIO 11% Con la cortese collaborazione della Dott.ssa A.Bruno - CRA Dott.ssa G. Tomasi Considerazioni La presenza di aa è fondamentale per il mantenimento dell’omeostasi del gamete o dell’embrione. Senza la loro presenza si andrebbe incontro alla perdita di aa endogeni e ad un notevole dispendio di energia quando quando trasferititi nel terreno per la coltura o in utero (ovociti dopo il pick-up/embrioni dopo hatching). Un buon handling medium dovrebbe contenere aa non essenziali e come fonte di glutammina l’alanil-glutammina per ridurre l’accumulo di ammonio dannoso per lo sviluppo embrionale. J. Swain, 2010 - RBM OnLine Dott.ssa G. Tomasi Culture Medium Embryo Viability Acido Ialuronico Glicosamminoglicano i cui livelli aumentano in utero durante l’impianto embrionale in vivo. Sulla superficie embrionale è presente un recettore specifico. È un ottimo promotore della vitalità embrionale:ha attività antimmunogenica, aumenta l’angiogenesi, facilità la diffusione del terreno di coltura utilizzato durante il transfer nel viscoso ambiente uterino. D. Gardner – Manuale Vitrolife G5 Series Dott.ssa G. Tomasi Effetti dell’Acido Ialuronico ET-medium con HA ET-medium con HA Clinical Implantation Pregnancy Rate Rate 38.8% 22.3% ET-medium senza HA Clinical Implantation Pregnancy Rate Rate 36.1% 19.2% Annual Meeting, 2011 Clinical Pregnancy Rate Implantation Rate 54,6% 32% ET-medium senza HA Clinical Implantation Pregnancy Rate Rate 48.5% 24.7% Dott.ssa G. Tomasi Terreni con Acido Ialuronico vs Terreni senza Acido Ialuronico – DATI CRA Colture medium senza HA Colture medium con HA N° cicli 123 N° cicli 102 Età media 34,9 Età media 36.7 % Fert. 70 % % Fert. Embr. Ott. (G1+G2) 45 % Embr. Ott. (G1+G2) 67 % Embr. Tr. (G1+G2) 63,4% Embr. Tr. (G1+G2) 82,8% Clinical Implantation Pregnancy Rate Rate 31,8% 19,8% 71.5% Clinical Pregnancy Rate Implantation Rate 39% 22.3% Con la cortese collaborazione della Dott.ssa A.Bruno - CRA Dott.ssa G. Tomasi Un buon terreno di coltura…per avere buone performance? Dott.ssa G. Tomasi Scelta del terreno di coltura PERFORMANCE OUTCOMES COSTI/BENEFICI TAKE HOME BABY Sierr UPDATE, 2011 - M.L.Papale Dott.ssa G. Tomasi “Il ricordo è un modo d’incontrarsi”, Kahlil Gibran Loredana Papale “This is why we are here”, Lynette Scott
