Prof.ssa Tiziana Pepe
Ricerca di virus mediante tecniche biomolecolari:
Norovirus
Biotecnologie applicate all’ispezione
degli alimenti di origine animale
Dip. di Medicina Veterinaria e Produzioni animali
[email protected]
NOROVIRUS - caratteristiche
La famiglia dei Caliciviridae comprende 4 generi Norovirus, Sapovirus,
Lagovirus, Vesivirus.
I Norovirus sono:
•Virus a singolo filamento di RNA
•Privi di involucro esterno e di forma irregolarmente sferica
• Ad infettività variabile
(la dose infettante è generalmente di 10-100 unità virali;
sono eliminati in grande quantità con le feci (108-1010 /g feci)
Genoma dei Norovirus
•
Il genoma dei Norovirus è un filamento di RNA costituito da 3 ORF (Open
Reading Frame), ossia frammenti di RNA codificante.
•
Nell’RNA dei Norovirus si distinguono:
ORF 1 che codifica per proteine non strutturali del virus
ORF 2 che codifica per la proteina maggiore del capside
ORF 3 che codifica per una proteina strutturale
Ridisegnato da Virus sequence database
Rappresentazione schematica del genoma dei Norovirus
Epidemiologia dei Norovirus
Sono considerati una delle principali cause di gastroenteriti in Europa e nel mondo
industrializzato:
Regno Unito: il 15,7 % di tutte le infezioni legate al consumo di vegetali e frutta sono
causate dalla contaminazione da Norovirus.
Danimarca: (estate 2005) sono stati notificati più di 1100 casi gastroenterici causate dal
consumo di una fornitura di lamponi contaminati con genotipi diversi di
Norovirus.
Svezia: (2006) si sono verificati vari episodi tra i quali:
- 15 persone manifestarono sintomi di gastroenterite dopo consumo, in una festa privata, di
un dolce a base di crema e lamponi. Gli esami effettuati sui campioni di feci dei pazienti
evidenziarono la presenza di Norovirus
- 10 persone manifestarono sintomatologia riferibile a Norovirus dopo consumo di un
cheesecake con lamponi. La segnalazione tardiva della tossinfezione non consentì il prelievo
di campioni di feci, ma durante le indagini emerse che i lamponi utilizzati per il cheesecake
erano della stessa marca di quelli trovati nell’episodio precedente.
Epidemiologia dei Norovirus
Il Sistema di Allerta comunitario ha inoltre registrato nel 2006:
• in Danimarca: 2 epidemie collegate al consumo di ostriche (coinvolte
46 persone in un party). Le ostriche provenivano da UK e Francia.
• in Olanda: epidemia collegata al consumo di ostriche contaminate da
Norovirus. Le ostriche provenivano dalla Francia.
Uno studio condotto in Italia ha evidenziato la presenza di
Norovirus in campioni di mitili rilevando che l’assunzione di
molluschi crudi rappresenta, nel sud della nostra nazione, il
principale fattore di rischio.
Gastroenteriti da Norovirus durante le crociere
I Norovirus sono stati responsabili di epidemie gastroenteriche anche durante
crociere:
• Luglio- Novembre 2002:
due epidemie a bordo di navi da crociera della stessa compagnia
• Ottobre 2003
- epidemia a bordo di una nave da crociera nel Mediterraneo
• Gennaio 2005
epidemia a bordo di una nave da crociera nei Caraibi
epidemia a bordo di una nave da crociera in Florida
La causa del manifestarsi così frequente di tali patologie durante le crociere
è legata al fatto che i focolai epidemici vengono individuati e denunciati più
rapidamente rispetto a quanto avvenga sulla terraferma.
La vicinanza degli alloggi in nave potrebbe accrescere le occasioni di contatto.
Gastroenterite da Norovirus: Cenni clinici
•Periodo di incubazione : 1-3 giorni
Sintomi:
• febbre, vomito, diarrea e nausea.
Nei bambini i sintomi sono più lievi, a differenza delle altre gastroenteriti
virali.
• La malattia ha decorso acuto ed è considerata autolimitante,
infatti di solito la guarigione avviene spontaneamente entro 2-3
giorni senza bisogno di ricovero.
Modalita’ di trasmissione dell’infezione
• Le vie di diffusione dell’infezione sono varie:
- Oro-fecale
- Aerosol
• Le potenziali fonti di contaminazione da Norovirus sono:
-
Soggetti infetti portatori
Escrezioni di animali infetti, roditori, insetti
Acqua contaminata
Assunzione di molluschi e vegetali
La fonte di contaminazione principale è rappresentata sempre dagli
alimenti.
Controllo dei Norovirus
•
Le caratteristiche biologiche, fisico-chimiche ed epidemiologiche dei
Norovirus ne rendono difficile il controllo.
•
Il virus è resistente al congelamento e al calore a 60°, alle soluzioni
clorinate, al pH di 2.7, ai trattamenti con etere, etanolo o detergenti.
•
La cottura a vapore o la pulizia dei crostacei non è quindi sufficiente ad
eliminare il rischio di infezione virale.
•
La decontaminazione delle superfici può essere ottenuta con soluzioni
contenenti ipoclorito concentrato 5000ppm.
•
Le misure preventive principali sono la decontaminazione ambientale e la
prevenzione della contaminazione di acqua e cibo e, se possibile,
isolamento di tutti i soggetti infetti.
Alimenti veicolo di Norovirus
Gli alimenti maggiormente coinvolti nelle infezioni virali sono
•Vegetali
• Molluschi bivalvi
in entrambi i casi il veicolo dell’infezione da Norovirus è
rappresentato dall’acqua contaminata.
Contaminazione primaria
I virus possono venire a contatto con gli alimenti nelle prime fasi di produzione
tramite:
•Contaminazione di molluschi bivalvi durante l’accrescimento se allevati in acque
non idonee (Reg.CE 854/2004)
• Impiego di acque reflue o inquinate per l’allevamento di molluschi bivalvi
(Reg.CE 854/2004)
• Contaminazione di vegetali durante l’irrigazione o la fertilizzazione
• Contaminazione di vegetali attraverso le radici
Contaminazione secondaria
La contaminazione virale può verificarsi anche nelle fasi successive di produzione,
ossia durante la lavorazione e la distribuzione dell’alimento:
• Operatori che non rispettano le norme igieniche
• Superfici di lavoro e lavelli contaminati
• Utensili e attrezzature contaminati (taglieri, strofinacci, spugne abrasive, tovaglie)
•Acqua contaminata utilizzata per la preparazione o il lavaggio degli utensili
• Contatto con altri alimenti già contaminati
Molluschi bivalvi come veicolo di malattia
• I molluschi bivalvi sono scavatori sessili o sedimentari, che si nutrono
di piccole particelle alimentari presenti nelle acque o nei sedimenti,
mediante un meccanismo di filtrazione.
• Attraverso l’attivo meccanismo di filtrazione accumulano
particelle batteriche e virali eventualmente presenti nelle acque.
anche
• Rappresentano un veicolo di malattia per l’uomo in quanto sono
alimenti consumati di frequente per i loro importanti apporti nutrizionali.
Ricerca di virus da matrici alimentari
La ricerca di virus può essere effettuata tramite:
• Microscopia elettronica
• Saggi immunoenzimatici (ELISA)
• Colture cellulari (i virus risultano spesso difficili da coltivare)
La tecnica biomolecolare è quella di elezione poiché ha una maggiore
sensibilità, specificità, rapidità di esecuzione e può essere
applicata anche su matrici alimentari complesse.
In particolare si utilizza
la Real Time PCR per la determinazione di Norovirus
Ricerca di Norovirus da matrice alimentare
Si distinguono quattro fasi:
1. Estrazione e concentrazione del virus dalla matrice
alimentare
2. Estrazione e purificazione dell’RNA per rimuovere gli inibenti
3. Retrotrascrizione a cDNA tramite l’enzima trascrittasi inversa
4. Amplificazione con RT-PCR
Norovirus : PCR real-time
La PCR real-time permette di quantificare i prodotti di
amplificazione grazie ad un sistema basato sulla rilevazione
della fluorescenza.
Per la ricerca di Norovirus in molluschi bivalvi si utilizza la
chimica TaqMan.
Amplificazione dei Norovirus
In PCR Real Time si amplifica un frammento di genoma
compreso tra ORF 1 e ORF 2 in quanto presenta minori
mutazioni intraspecie
Ridisegnato da Virus sequence database
Regolamento (CE) 2073/2005
Criteri microbiologici applicabili ai prodotti alimentari
• I criteri microbiologici devono specificare il numero delle unità
campionarie da prelevare, il metodo analitico e il numero delle unità
campionarie che dovrebbero essere conformi al limite
• I criteri microbiologici indicano come orientarsi per l’accettabilità di
un prodotto e dei relativi processi di lavorazione, manipolazione e
distribuzione, in base all’assenza, alla presenza o al numero di
microrganismi
e/o
in
base
alla
quantità
delle
relative
tossine/metaboliti
• Revisione dei criteri microbiologici in base all’evoluzione e ai
progressi scientifici, tecnologici e metodologici nel settore.
Regolamento (CE) 2073/2005
Nei consideranda iniziali si legge che
•…gli indicatori fecali non sono affidabili per dimostrare la presenza o assenza di
NLV.
Punto 12
•….non è una pratica sicura basarsi sulla rimozione degli indicatori batterici per
determinare i tempi di depurazione dei frutti di mare.
Punto 12
• In particolare, è opportuno che i criteri per i virus patogeni nei molluschi bivalvi
vivi siano fissati quando i metodi d’analisi sono stati sufficientemente messi a punto
Punto 23
•Si ribadisce la necessità dello sviluppo di metodi di analisi per virus
enterici e per altri rischi microbiologici
Punto 27
