Evolutionary and metabolie engineering of - ETH E

DISS. ETH NO. 15296
Evolutionary and metabolie engineering of xylose
metabolism in Saccharomyces cerevisiae
A dissertation submitted to the
SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY ZURlCH
For the degree of
Doctor ofNatural Science
Presented by
Marco Sonderegger
Dipl. Natw. ETH Zürich
born February
n", 1976
citizen ofRehetobel (AR), Switzerland
Accepted on the recommendation of
PD Dr. Uwe Sauer, examiner
Prof. Matthias Peter, co-examiner
2003
SUMMARY
The success of c1assical metabolie engineering strategies to improve cell factories for
biotechnological purposes is strongly dependent on the availability of precise information
about the system-wide interactions that determine the phenotype. Despite the massive data
sets generated by genome-wide analytical techniques, system-wide understanding is often not
achieved, at least not to an extent that phenotypes can be improved directly. This thesis
attempts to improve primarily one such phenotype: xylose metabolism in Saccharomyces
cerevisiae, which is important to establish an effieient fermentation process producing bioethanol frorn hemicellulose rich and eheap lignocellulosic material.
Despite intense research over the last decade, metabolie engineering strategies aehieved
only partial success in establishing xylose metabolism in S. cerevisiae and failed completely
to enable anaerobie growth on this substrate. In this thesis, I present evolutionary engineering
of the first yeast that is capable of strict anaerobie growth on sole xylose (Chapter 2). This
unique S. cerevisiae mutant was then analyzed by genome-wide transcript level and metabolie
flux analysis to reveal the mechanisms that hamper anaerobie growth on xylose of rationally
engineered strains (Chapter 3). In particular, I provide evidence that the ultimate problem
resides in the insuffieient rate of glyeolytic ATP formation, whieh in turn is reduced when
NADH re-oxidation is problematic and leads to the accumulation of the reduced intermediate
xylitol. The results indicate that further bottlenecks that may become relevant as soon as
sufficient NADH re-oxidation is provided, might reside in xylose transport, the xylose
catabolic pathway itself, and the pentose phosphate pathway (Chapter 3 and 4).
To provide a new possibility for NADH re-oxidation, I expressed a functional soluble
transhydrogenase (Chapter 4) in xylose fermenting yeast. This enzyme, however, operated
toward NADPH instead of the desired NADH re-oxidation, increasing even more NADH
production. In a second attempt, I was able to attain NADH re-oxidation with the
establishment of a functional phosphoketolase pathway (Chapter 5). With this strategy, I
signifieantly increased the ethanol yield at the expenses of xylitol formation, and eould
increase simultaneously the xylose fermentation rate by additionally deleting the constitutive
cytosolic aldehyde dehydrogenase gene ALD6, which is principally responsible for acetate
accumulation.
Chapter 6 then affords a quantitative comparison of eight recently engineered or evolved
yeast strains with respect to their xylose fermentation performance and robustness. Generally,
industrial strains fermented xylose faster and were more tolerant to lignoeellulose
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hydrolysates, but aecumulated more xylitol than laboratory strains. The best xylose
fennenting strains were those obtained by evolutionary engineering.
Finally, I addressed a general proeess problem that is also relevant for ethanol production:
high metabolie activity in the absence of growth (Chapter 7). In partieular, I deseribe a new
enriehment proeedure toward this phenotype in an extremely slow-growing chemostat eulture.
I isolated thereby an Escherichia coli mutant with doubled catabolie rate that was maintained
for at least 40 h in nitrogen starvation induced stationary phase.
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SOMMARIO
La disponibilitä di informazioni dettagliate, riguardanti il funzionamento dei meeehanismi
moleeolari ehe deteminano il fenotipo di un organismo,
e essenziale
per il sueeesso di
strategie classiehe d' ingegneria del metabolismo miranti al miglioramento delle eratteristiehe
eellulari per seopi bioteenologiei. Nonostante l'enorme quantita di dati generata trarnite
l'impiego di teeniehe d'analisi a livello genomico, una eomprensione sistemiea eompleta in
grado di permettere direttamente il migliorarnento di vari fenotipi, non
e stata
aneora
raggiunta. In questa tesi eereo di migliorare prineipalmente uno di questi fenotipi: Il
metabolismo dello xilosio nel
lievito Saccharomyces
cerevisiae. Quest'ultimo
e
partieolarrnente importante per 10 sviluppo di proeessi di fermentazione atti alla produzione di
bioetanolo da searti di natura lignoeellulosiea.
Nonostante l'intenso sforzo di rieerea nell'ultimo decennio, strategie tradizionali di
ingegneria de1 metabolismo sono riuseite a raggiungere un sueeesso solo parziale nell'
instaurare una via eataboliea dello xilosio in S. cerevisiae. Inoltre, hanno eompletalmente
fallito nel generare eeppi eapaei di ereseere su xilosio in eondizioni strettamente anaerobiehe.
In questa tesi, presento la generazione tramite ingegneria evolutiva de1 primo eeppo di lievito
eapaee di ereseere in queste eondizioni (Capitolo 2). Per rive1are i fattori ehe impediseono tale
fenotipo in eeppi modifieati eon strategie tradizionali, ho quantifieato l'espressione di geni a
livello genomieo e i flussi metabolici intraeellulari de1 earbonio in questa mutante uniea in
natura (Capitolo 3). In partieolare, presento osservazioni indieanti ehe il problema
fondamentale
Quest'ultima
e costituito dall' insufficiente velocitä di produzione glicolitica di ATP.
e a sua volta ridotta quando, in condizioni anaerobiche, la riossidazione de1
NADH diventa problematiea e causa quindi l'accumulazione de1 prodotto interrnedio xilitolo.
I miei risultati indieano ehe altri fattori potrebbero diventare limitanti allorquando un
sufficiente grado di riossidazione de1 NADH potesse essere garantito. Tra questi figurano il
trasporto dello xilosio, la stessa via eatabolica dello xilosio e la via del pentosio fospfato
(Capitoli 3 e 4).
Per fornire una nuova possibilita di riossidazione de1 NADH, ho espresso una
transidrogenasi solubile in un ceppo di lievito modificato, eapace di metabolizzare 10 xilosio
(Capitolo 4). Invece di riossidare I' NADH produeendo NADPH, pero, quest'enzima ha
eatalizzato la reazione inversa, aumentando ulteriormente la produzione di NADH. In un
secondo tentativo, sono riuscito a raggiungere un significante grado di riossidazione del
NADH implementando Ia via della fosfochetolasi nel lievito (Capitolo 5). Con questa
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strategia, sono riuscito ad aumentare la resa dell'etanolo a scapito della produzione di xilitolo.
Inoltre, sono riuscito ad incrementare simmultaneamente la velocita di ferrnentazione dello
xilosio introducendo una delezione deI gene delI' aldeide deidrogenasi ALD6.
Il Capitolo 6 offre un' analisi comparativa delle caratteristiche di ferrnentazione dello
xilosio edella resistenza di otto ceppi modificati
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evoluti recentemente. In generale, i ceppi
industriali ferrnentano 10 xilosio piu rapidamente e sono piu resistenti all,effetto inibitorio
della materia lignocellulosica idrolizzata, ma accumulano una maggiore quantitä di xilitolo
rispetto ai ceppi di laboratorio. I ceppi con le caratteristiche di fermentazione migliori sono
quelli ottenuti tramite ingegneria evolutiva.
Infine, ho affrontato una questione di carattere piu generale, rilevante anche per la
produzione di etanolo: Il mantenimento di un' attivitä metabolica elevata
crescita (Capitolo 7). In particolare, descrivo
UD
in assenza di
nuovo metodo di selezione di tale fenotipo in
una coltura continua con una velocitä di crescita estremamente bassa. Tramite queste metodo
sono riuscito ad isolare una mutante di Escherichia coli con una velocitä catabolica
raddoppiata per almeno 40 ore nella fase stazionaria indotta dall'assenza di azoto.
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