Spettroscopia di Fluorescenza

Spettroscopia di Fluorescenza
Introduzione (1)
La spettroscopia di fluorescenza studia la r.e.m. che viene emessa in maniera
spontanea da un sistema materiale, a seguito di assorbimento di una r.e.m.
intensa, che genera un popolazione non nulla nello stato eccitato.
Tipicamente l’emissione spontanea fornisce un contributo importante al
processo di rilassamento della popolazione di stato eccitato solo per transizioni
molecolari di tipo elettronico, per le quali l’energia di transizione è grande
rispetto all’energia termica contenuta nella sistema a temperatura ambiente
(kBT).
La fluorescenza è caratterizzata dal fatto di essere un emissione di tipo
incoerente e può essere misurata sia in funzione della frequenza che del tempo.
Recentemente questa tecnica viene ampiamente utilizzata in microscopia ottica,
sia in campo bio-medico che in campo analitico
1
Introduzione (2)
Nel descrivere il processo di fluorescenza, spesso la si definisce una
spettroscopia di tipo lineare, dal momento che presenta una dipendenza lineare
dall’intensità della r.e.m. utilizzata per generarala.
Questa approssimazione è vera solo quando la r.e.m. che si utilizza per eccitare
il campione è debole, e quindi si forma una popolazione nello stato elettronico
eccitato che è piccola rispetto alla popolazione di stato fondamentale.
La spettroscopia di fluorescenza può essere anche descritta come un processo
non lineare al terzo ordine dello sviluppo perturbativo.
In questo caso il sistema interagisce con la r.e.m. eccitatrice caratterizzata da
una frequenza ωL e genera nel sistema la creazione di un fotone ωS, già
presente nel sistema come fluttuazione di vuoto.
Per poter descrivere il sistema in maniera corretta non si può più adottare
l’approssimazione semiclassica, ma si deve trattare il campo in maniera
quantistica.
2
1
Introduzione (3)
Nell’approccio non-lineare, il segnale di fluorescenza è originato dalla
combinazione:
(1)
ωS = ω L − ωL + ωS
Descrivendo il sistema materiale con un sistema modello a tre livelli, il segnale
di scattering nasce dalle seguenti interazioni:
− ω L ωL ωS ωS
ωL − ω L ωS ωS
− ω L ωS ωL ωS
Raman
fluorescenza
E da altri tre diagrammi che sono i complessi coniugati di questi.
(2)
I FLU ∝ Im ∑ χ i( 3) (−ω S , ω S ,−ω L , ω L )
i =1, 3
3
Introduzione (4)
Outline:
1. Spettroscopia nel dominio delle frequenze.
Spettroscopia di singola molecola
Abbinamento con microscopia confocale
2. Spettroscopia nel dominio dei tempi
Decadimento di fluorescenza
Dipendenza dalla polarizzazione: effetti riorientazionali
Dipendenza dalla frequenza: dinamica di solvatazione o
processi di rilassamento conformazionale.
4
2
Fluorescenza: risolta in frequenze (1)
Nell’approssimazione di Condon la distribuzione in frequenza dello spettro
di fluorescenza rispecchia la struttura vibrazionale dello stato fondamentale.
5
Single molecule spectroscopy
Fluorescenza: risolta in frequenze (2)
La tecnica di fluorescenza è arrivata ad un livello tale di sensibilità da essere in
grado di rilevare una singola molecola (1989-1990).
I primi studi in questo senso hanno portato alla rilevazione di una singola
molecole di pentacene o perilene o terrilene dispersa in un cristallo di p-terfenile
6
3
Fluorescenza: risolta in frequenze
Single molecule spectroscopy (1)
Per riuscire ad osservare una
singola molecola si preparano
campioni estremamente diluiti e
si focalizza la r.e.m. eccitatrice
su una zona di campione molto
piccola (10-100 µm3).
Si utilizza una concentrazione
dell’ordine di 10-7 - 10-9 mol/mol,
ed inoltre si eccita il campionea
lunghezze d’onda che cadono ai
bordi della banda di
assorbimento del cromoforo
ospitato, dove è possibile
rilevare assorbimenti di singole
molecole.
T prossime a 0K, per evitare
allargamenti dovuti ad
accoppiamenti con vibrazioni di
7
bassa energia della matrice
Fluorescenza: risolta in frequenze
Single molecule spectroscopy (2)
Set Up sperimentali usati per rilevare
la fluorescenza di singola
molecola, nei primi studi diretti in
tal senso.
a) Il fascio viene focalizzato su un
campione e la fluorescenza,
raccolta da uno specchio
parabolico, viene inviata al
detector.
b) B) il campione viene illuminato
dalla punta di una fibra ottica e la
fluorescenza, raccolta da uno
specchio parabolico, vine inviata al
detector.
8
4
Fluorescenza: risolta in frequenze
Single molecule spectroscopy (3)
a) Spettro di eccitazione di
fluorescenza di pentacene in pterfenile a T =1.5 K.
Lunghezza d’onda centrale:
592.321 nm
b) Osservando sui lati dello spettro
si notano delle linee singole che
rappresentano lo spettro di
eccitazione di fluorescenza di
singole molecole.
c) Spettro di eccitazione di
fluorescenza di una singola
molecola che assorbe a 592.407 nm
9
Fluorescenza: risolta in frequenze
Single molecule spectroscopy (4)
Pseudoimmagine di emissione di singole molecole.
Asse x: lunghezza d’onda di eccitazione, Asse y: posizione spaziale
Asse z: intensità
10
5
Fluorescenza: risolta in frequenze
Single molecule spectroscopy (5)
Schema dell’emissione di fluorescenza
osservata per una singola molecola.
Nell’emissione si notano periodi
luminosi e bui che si alternano con un
tempo medio di attesa che coincide con
il tempo di vita dello stato di tripletto,
Osservando invece il comportamento
all’interno di questi pacchetti si notano
effetti di antibouncing proporzionali
all’inverso della frequenza di Rabi.
Infatti per poter assorbire un nuovo
fotone la molecola deve attendere un
tempo confrontabile con la frequenza di
Rabi:
2
⎛µ E⎞
ω Rabi = ⎜⎜ eg ⎟⎟ + ωeg2
⎝ h ⎠
(3)
11
Fluorescenza: risolta in frequenze
Single molecule spectroscopy (6)
Spettri eccitazione di fluorescenza di
singola molecola misurati in funzione del
tempo. a) ogni 0.25 s.
T=1.5K
b) e c) spostamento della frequenza
centrale di risonanza col tempo per due
molecole diverse alla stessa T=1.5 K
d) Analogo ai precedenti ma a 4 K.
T=1.5K
Le fluttuazioni vengono attribuite a
processi dinamici di diffusione spettrale
della matrice cristallina in cui sono
contenute le molecole di pentacene.
T=4K
12
6
Fluorescenza: risolta in frequenze
Microscopia Confocale (1)
La microscopia confocale è
una tecnica di fluorescenza
che permette di osservare
solo un volume molto piccolo
di campione dell’ordine dei <
1 µm3 grazie allo speciale
disegno geometrico adottato
per illuminare il campione e
raccogliere la fluorescenza
emessa da nanoparticelle di
semiconduttori o da molecole
di cromforo disperse nel
materiale.
www.olympusfluoview.com/theory/index.html
13
Fluorescenza: risolta in frequenze
Microscopia Confocale (2)
Solo la fluorescenza emessa dal piano focale
riesce a passare attraverso il pin-hole
sistemato davanti al rivelatore e raggiungere il
detector.
Questa geometria permette di focalizzare il
fascio nel piano focale (x,y) con un raggio che
al limite raggiunge dimensioni di:
⎛ λ ⎞ λ
r = 0.61⎜
⎟≈
⎝ n sin ϑ ⎠ 2
Nella direzione z,
profondità, invece, la
risoluzione è minore
e tipicamente:
d
(4)
2d
14
7
Fluorescenza: risolta in frequenze
Micorscopia Confocale (3)
Esistono già compagnie che
forniscono i probe di
fluorescenza specifici per certi
siti cellulari e i protocolli di
impregnazione, ad esempio:
http://www.invitrogen.com
15
Fluorescenza: risolta in frequenze
Micorscopia Confocale (1)
Esempio di scansione
lungo l’asse Z
http://www.olympusfluoview.com/theory/confocalintro.html
16
8
Fluorescenza: risolta in frequenze
Micorscopia Confocale (1)
17
Teoria (1)
Fluorescenza: risolta nei tempi
Gli esperimenti di fluorescenza risolta nel tempo permettono di rivelare
informazioni sulla dinamica del sistema materiale a seguito dell’eccitazione.
Dopo aver eccitato il sistema, il ritorno alla condizione di equilibrio può avvenire
attraverso diversi tipi di processi:
e
w
ωL
ωS
ωS
g
18
9
Teoria (2)
Fluorescenza: risolta nei tempi
L’intensità del segnale di fluorescenza è una funzione del tempo e della frequenza.
Se si suppone che il fascio di pompa genera istantaneamente una popolazione
stato eccitato e, di natura incoerente, allora:
2
2
I FLU (ω S , t ) ∝ φeg µ eg (ω S ) ne (t ) + φwg µ wg (ωS ) nw (t )
µij (ωS )
(5)
= momento di dipolo di transizione per unità di frequenza.
ni (t ) =
Popolazione del livello “i”-esimo
Le popolazioni dei livelli i, vengono descritte attraverso semplici
equazioni cinetiche, che vengono risolte imponendo come condizioni
iniziali che ne(0)= ne e ni (0) = 0 per tutti gli altri livelli eccitati.
19
Teoria (3)
Fluorescenza: risolta nei tempi
dne (t )
= −k re ne (t ) − k nre ne (t ) − kew ne (t )
dt
dnw (t )
= + kew ne (t ) − k rw nw (t ) − k nrw nw (t )
dt
(6)
Dove le costanti di velocità k sono dei parametri fenomenologici che indicano la
velocità con cui avvengono i processi di rilassamento.
k ri
k nri
kij
Velocità di decadimento radiativo dal livello i allo stato fondamentale g
Velocità di decadimento non radiativo dal livello i allo stato fondamentale g
Velocità di decadimento dal livello eccitato i allo stato eccitato j
In genere le espressioni per le equazioni cinetiche non sono semplici e
richiedono un integrazioni numerica.
20
10
Fluorescenza: risolta nei tempi
Effetto della polarizzazionedelle r.e.m. (1)
La descrizione appena effettuata, basata sull’evoluzione della popolazione
di stato eccitato, può essere ricondotta alla descrizione basata sulla
polarizzazione non-lineare al terzo ordine dello sviluppo perturbativo,
sfruttando approssimazioni analoghe a quelle utilizzate nel caso della
spettroscopia di pump and probe. In questo caso il campo del probe viene
sostituito dal campo della fluorescenza.
Nel seguito centriamo l’attenzione su un aspetto delle r.e.m. che fino ad ora
è stato trascurato, ovvero l’influenza della polarizzazione dei campi elettrici
sulla risposta ottica del sistema.
La risposta ottica non lineare del sistema materiale dipende dalla
direzione di polarizzazione dei campi elettrici applicati, dal momento che
l’operazione di interazione è un prodotto scalare:
r
Vˆ = − µˆ ⋅ E (t )
(7)
21
Fluorescenza: risolta nei tempi
Effetto della polarizzazionedelle r.e.m. (2)
t=τ
t=0
Z
Laser
Z
Fluorescenza
Y
X
Solo una parte delle
molecole può venire
eccitata e quindi emettere
Y
X
Se si misura il segnale di fluorescenza con
polarizzazione parallela a quella della
r.e.m. incidente, dopo un certo intervallo di
tempo, si noterà una diminuzione del
segnale dovuta non solo al decadimento di
popolazione, ma anche alla riorientazione
delle molecole ancora eccitate.
22
11
Fluorescenza: risolta nei tempi
Effetto della polarizzazione delle r.e.m. (3)
La presenza di una distribuzione di possibili orientazioni delle molecole, nel
sistema materiale, come pure la possibilità che le molecole ruotino durante
l’esperimento fa si che la risposta ottica NL del sistema dipenda da questo prodotto
interno.
Se si vuole considerare anche la presenza di gradi di libertà rotazionali per la
molecola, è necessario utilizzare un Hamiltoniano, per descrivere il sistema
materiale, che tenga conto della componente rotazionale:
Se si trascura l’accoppiamento tra gradi di libertà rotazionali, vibrazionali ed
elettronici, allora l’Hamiltoniano per il sistema risulta:
Hˆ = Hˆ el + Hˆ vib + Hˆ rot
(8)
Quando si calcola la funzione responso non lineare si deve mediare su tutti
gli stati della molecola: stati elettronici, vibrazionali e rotazionali.
23
Fluorescenza: risolta nei tempi
Effetto della polarizzazione delle r.e.m. (4)
L’operatore di interazione con la r.e.m., Eq (7), possiamo riscriverlo come:
r r
Vˆ = (m ⋅ ei )µˆ Ei (t )
(9)
r
r
Dove m ed ei
sono versori unitari nella direzione del momento di dipolo
molecolare e del campo elettrico applicato, mentre µ ed Ei(t) rappresentano
l’ampiezza dell’operatore momento di dipolo e la dipendenza temporale del
campo elettrico applicato, rispettivamente.
Nel calcolare la funzione responso è possibile fattorizzare la parte che media
rispetto ai gradi di libertà rotazionali da quella che invece media rispetto ai gradi
di libertà vibrazionali ed elettronici:
(10)
R ( 3) (t3 , t 2 , t1 ) = Y ( 3) (t3 , t 2 , t1 ) ⋅ S (3) (t3 , t 2 , t1 )
ˆ
ˆ
ˆ
S (3) (t3 , t 2 , t1 ) = N µˆˆ Gˆ (t3 ) µˆˆ Gˆ (t 2 ) µˆˆ Gˆ (t1 ) µˆˆ ρˆ (−∞)
(11)
el, vib
24
12
Fluorescenza: risolta nei tempi
Effetto della polarizzazione delle r.e.m. (5)
Per descrivere la componente rotazionale Y(3) (t3,t2,t1) , si suppone di poter
trattare il moto rotazionale in maniera classica.
Si identifica un sistema di riferimento fisso, (X,Y,Z) rispetto al quale vengono
definite le orientazioni delle polarizzazioni dei campi elettrici applicati, ed un
sistema di riferimento molecolare (x,y,z), rispetto al quale viene definita la
direzione rispetto alla quale è orientato il momento di dipolo di transizione
molecolare. E’ possibile mettere in relazione la direzione del momento di dipolo
molecolare rispetto al sistema di laboratorio, attraverso un set di tre angoli di
Eulero:
(12)
Ω = (ϑ , ϕ , χ )
Sfruttando queste approssimazioni, la funzione responso rotazionale risulta:
r r
( 3)
Yηαβγ
(t3 , t 2 , t1 ) = ∫ dΩ 3 ∫ dΩ 2 ∫ dΩ1 ∫ dΩ 0 (m3 ⋅ eη )W (Ω 3t3 , Ω 2 )×
(mr 2 ⋅ erα )W (Ω 2t2 , Ω1 )(mr1 ⋅ erβ )W (Ω1t1 , Ω 0 )(mr 0 ⋅ erγ )P(Ω 0 )
(14)
25
Fluorescenza: risolta nei tempi
Effetto della polarizzazione delle r.e.m. (6)
Dove:
α , β ,K Indicano le direzioni dei campi elettrici applicati e della polarizzazione
non lineare generata.
P (Ω 0 )
Indica la distribuzione iniziale delle direzioni possedute dai momenti di
dipolo delle singole molecole. Per un sistema isotropoil suo integrale è
uguale a (1/8π2)
W (Ω n +1t n +1 , Ω n ) Indicano la probabilità che una molecola con orientazione iniziale
Ωn assuma dopo un intervallo di tempo tn+1 un orientazione Ωn+1
Z
Z
Y
Y
X
X
26
13
Fluorescenza: risolta nei tempi
Effetto della polarizzazione delle r.e.m. (7)
Nel descrivere la fluorescenza come un processo NL al terzo ordine dello
sviluppo perturbativo, si considera:
• Le prime due interazioni avvengono con la r.e.m. eccitatrice e questa è un
impulso di durata molto minore dei tempi necessari alle molecole per ruotare o
rilassare allo stato fondamentale.
• La terza e quarta interazione descrivono la generazione della fluorescenza
dalle fluttuazioni di campo locale. Si suppone che il tempo caratteristico di
misura del rivelatore sia breve rispetto ai tempi necessari alle molecole per
ruotare o rilassare allo stato fondamentale.
t
t2
t3 , t1 << t 2
27
Fluorescenza: risolta nei tempi
Effetto della polarizzazione delle r.e.m. (8)
Considerando queste approssimazioni:
(
)
(
)
r r 2
r r
YηαFL (τ ) = ∫ dΩτ ∫ dΩ o m2 ⋅ eηS W (Ωτ τ , Ω 0 ) m1 ⋅ eαL P(Ω 0 )
(15)
Nelle misure sperimentali la r.e.m. eccitatrice viene polarizzata linearmente e la
fluorescenza viene misurata ad un angolo di 90º rispetto alla direzione di
propagazione del fascio incidente.
Z
Y
X
Se identifichiamo con Z la direzione di
polarizzazione del laser, allora la
fluorescenza viene raccolta con una
polarizzazione che è contenuta nel piano
XZ e che può formare un angolo φ a
piacere rispetto all’asse Z. In genere si
selezionano le direzioni parallela φ = 0
e perpendicolare φ = 90°
28
14
Fluorescenza: risolta nei tempi
Effetto della polarizzazione delle r.e.m. (9)
In questo caso la intensità di fluorescenza risulta:
⎤
⎡1 4
( 3)
I FLU (0°,τ ) ∝ YZZZZ
(τ ) R (3) (τ ) ∝ ⎢ + r (τ )⎥ K (t )
⎣ 3 15
⎦
⎡1 2
⎤
( 3)
I FLU (90°,τ ) ∝ YXXZZ
(τ ) R ( 3) (τ ) ∝ ⎢ − r (τ )⎥ K (t )
⎣ 3 15
⎦
K (τ ) = exp(− γ eτ )
r (τ )
(16)
(17)
Decadimento dovuto al rilassamento della popolazione di
stato eccitato
Funzione di correlazione rotazionale.
Per un angolo generico
φ
I FLU (φ ,τ ) = cos 2 φ ⋅ I FLU (0°,τ ) + sin 2 φ ⋅ I FLU (90°,τ )
(18)
29
Fluorescenza: risolta nei tempi
Effetto della polarizzazione delle r.e.m. (10)
Combinando le espressioni (16) e (17) si nota come:
I (0°,τ ) − I (90°,τ )
I (0°,τ ) + 2 I (90°,τ )
(19)
K (τ ) = I FLU (54,7°,τ )
(20)
r (τ ) =
La forma della funzione r(τ) che descrive il moto rotazionale, dipende dalla
forma della molecola e dalle caratteristiche del solvente che la circonda, ad
esempio, viscosità, temperatura, polarizzabilità, esistenza di interazioni
specifiche col soluto.
Dalla Teoria di Debye-Stokes-Einstein, valida per una molecola descritta da
un rotatore sferico immerso in un solvente che può essere considerato come
un mezzo continuo caratterizzato dalla sola viscosità:
V=volume del
rotatore sferico
k BT
r (τ ) = exp(− 6 DRτ )
DR =
(21)
η(T) = viscosità del
6Vη (T )
solvente
30
15
Fluorescenza: risolta nei tempi
1º Esempio (1)
G. R. Fleming
Chemical Applications of Ultrafast Spectroscopy
Oxford University Press, 1986
31
Fluorescenza: risolta nei tempi
1º Esempio (2)
Apparato Strumentale
laser
Detector per la fluorescenza che
permette di ottenere una risoluzione
temporale di 6-8 ps.
32
16
Fluorescenza: risolta nei tempi
1º Esempio (3)
Misure di fluorescenza effettuate su Rose Bengal ed in diversi solventi
X= Z = I
Y=OX’=Cl
Y’=O
Z’=CO2-
Come solventi sono stati utilizzati sia solventi che formano legami a
idrogeno come metanolo, etanolo etc., che solventi polari come il
DMSO, ma che non generano legami a idrogeno..
33
Fluorescenza: risolta nei tempi
0º
90º
1º Esempio (4)
Misura del decadimento di
fluorescenza misurato con il
polarizzatore della fluorescenza
parallelo o perpendicolare rispetto alla
polarizzazione della r.e.m. eccitatrice.
Curve di rilassamento della
popolazione e funzione di
correlazione riorientazionale calcolate
dai dati sperimentali.
Linee continue sono fit monoesponenziali.
34
17
Fluorescenza: risolta nei tempi
1º Esempio (5)
Andamento della costante di tempo
riorientazionale in funzione della
viscosità del solvente impiegato
Come si nota essa dipende dalla natura
del solvente.
Nel caso dei solventi protici si ha una
pendenza maggiore rispetto a quella
osservata per solventi aprotici.
Questo andamento viene spiegtao
considerando che le molecole di
solvente sono fortemente legate al
soluto e ne aumentano il volume,
rendendolo simile ad una sfera e
cadendo nel comportamento “stick”.
35
Fluorescenza: risolta nei tempi
1º Esempio (6)
Comportamento della costante
di tempo orientazionale
dell’eritrosina B nella serie di
alcool che passa da metanolo a
undecanolo.
Come si nota la teoria di Debye-Stokes-Einstein, non è in grado di prevedere
l’andamento sperimentale, che invece viene riprodotto considerando un rotatore
sferico di volume maggiore rispetto a quello effettivo della molecola di eritrosina.
Questo comportamento viene ascritto a molecole di solvente attaccate al soluto.
36
18
Fluorescenza: risolta nei tempi
2º Esempio (1)
37
Fluorescenza: risolta nei tempi
2º Esempio (2)
Esempio . Studio della dinamica riorientazionale del Blu di Nilo e
della Cumrina 153 in etanolo bulk e segregato in matrice di SiO2
poroso.
ClO4(C2H5)2N
NH2+
O
N
Blu di Nilo
N
O
CF3
Immagine SEM di un vetro sol-gel
poroso
Cumarina 153
38
19
Fluorescenza: risolta nei tempi
1,0
(a)
Iparal
0,8
signal [a.u.]
2º Esempio (3)
Le molecole di Nile Blu sono
adsorbite sulle pareti dei
canalicoli della struttura porosa
BULK
0,6
0,4
Iperp
0,2
0,0
1,0
signal [a.u.]
0,8
(b)
75 Å sol-gel
0,6
0,4
0,2
0,0
1,0
signal [a.u.]
0,8
(c)
50 Å sol-gel
0,6
0,4
0,2
0,0
-1000
0
1000
2000
3000
4000
5000 6000
time [ps]
Fluorescenza: risolta nei tempi
7000
R. Baumann, et al., J. Chem.
Phys., 114, (2001), 5781
39
2º Esempio (4)
Le molecole di Cumarina 153
invece sono libere di ruotare nei
pori della matrice sol-gel.
40
20
Dinamica di solvatazione (1)
Fluorescenza: risolta nei tempi
Negli spettri di assorbimento ed emissione di molecole in solventi organici si nota
spesso che il massimo di assorbimento non coincide con il massimo di
emissione.
La distanza tra i due massimi viene chiamata Stokes –Shift, ed essa può
raggiungere anche valori di 5000-80000 nm per molecole polari in solventi polari.
Fisicamente lo Stokes shift nasce da vari contributi che tendono a variare il gap di
energia che c’e’ tra lo stato fondamentale ed eccitato nei processi di
assorbimento ed emissione rispettivamente, tra essi ci sono:
• Accoppiamento tra la transizione elettronica e modi di vibrazione sia della
molecola stessa che del bagno che la circonda
• Moti riorientazionali che variano l’intorno della molecola nello stato
fondamentale ed eccitato.
• Processi di riarrangiamento conformazionale della molecola di cromoforo che
mutano la superficie di energia potenziale di stato fondmentale ed eccitato.
41
Dinamica di solvatazione (2)
Fluorescenza: risolta nei tempi
Ass C153/Cicloesano
Ass C153/Etanolo
Flu C153/Cicloesano
Flu C153/Etanolo
1,0
Intensita' [a.u.]
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
250
300
350
400
450
500
550
600
650
Lunghezza d'onda [nm]
Si nota come sia in cicloesano che in etanolo la cumarina presenti uno
Stokes-Shift, e come quest’ultimo dipenda fortemente dalla natura del
solvente
42
21
Dinamica di solvatazione (3)
Fluorescenza: risolta nei tempi
Molecola polare in solvente
polare
Il processo di eccitazione fa
mutare istantaneamente il
momento di dipolo permanente
della molecola dallo stato
fondamentale allo stato eccitato.
A seguito di questa variazione, le
molecole di solvente polari
tenderanno a riorientarsi intorno
al soluto, diminuendo l’energia
dello stato eccitato ma
aumentando l’energia di stato
fondamentale.
43
Dinamica di solvatazione (4)
Fluorescenza: risolta nei tempi
Se si misura lo spettro di fluorescenza a tempi brevi rispetto al tempo
caratteristico di riorientazione del solvente si dovrebbe osservare uno
spostamento dello spettro di emissione dalle alte energie a energie più
basse.
Assorbimento
Emissione
tempo
1,0
Intensità (a.u.)
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
300
350
400
450
500
550
600
650
numero d'onda
44
22
Dinamica di solvatazione (5)
Fluorescenza: risolta nei tempi
Metodo di misura e ricostruzione dello spettro di fluorescenza transiente
Zeit [ps]
t=0
Rekonstruierte Spektren
t=
8
645 nm
655 nm
663 nm
697 nm
705 nm
Si ricostruiscono gli spettri di
fluorescenza in funzione del
tempo
Intensità (a.u.)
Intensità (a.u.)
Dai singoli decadimenti
alle diverse lunghezze
d’onda
Wellenlänge [nm]
45
Fluorescenza: risolta nei tempi
Dinamica di solvatazione (1)
Lo spostamento del massimo di fluorescenza fornisce una misura diretta della
variazione dell’energia della transizione in funzione del riarrangiamento
energetico del sistema solvente-soluto
S (t ) =
ν FL (t ) −ν FL (∞)
ν FL (0) −ν FL (∞)
(22)
46
23
Dinamica di solvatazione (1)
Fluorescenza: risolta nei tempi
Dinamica di solvatazione per solventi polari.
Supponendo che il solvente si comporti come un mezzo dielettrico continuo,
caratterizzato dalla sola costante dielettrica, e che il soluto sia approssimabile
ad un dipolo puntuale di forma sferica, è possibile descrivere la variazione
dell’energia di transizone in funzione della variazione del campo elettrico locale
presente nel solvente, dovuto alla variazione del momento di dipolo molecolare
all’atto dell’eccitazione. Sotto queste approssimazioni:
S (t ) =
τF =
⎛ t
ν FL (t ) −ν FL (∞)
= 1 − exp⎜⎜
ν FL (0) −ν FL (∞)
⎝τ F
2ε ∞ + 1
τD
2ε 0 + 1
⎞
⎟⎟
⎠
τ D = (DR )−1
(23)
(24)
La teoria esposta non tiene conto dei moti specifici che le molecole di solvente
possono avere. Esistono forme più evolute di tale teoria che tengono conto
delle caratteristiche molecolari del soluto.
47
Fluorescenza: risolta nei tempi
Dinamica di solvatazione (6)
Strumentazione 1
Risoluzione temporale : durata
dell’impulso e risposta temporale del
sistema di rivelazione (minimo
raggiungibile 1 ps)
Pump
:Laser a Nd:YAG ModeLocked o laser a diodi.
Rivelatore
PicoQuant GmbH
12489 Berlin
Germany
Monocromatore
Computer
48
24
Fluorescenza: risolta nei tempi
Dinamica di solvatazione (7)
Strumentazione 2
La risoluzione temporale dipende solo dalla durata dell’impulso. Per ogni
lunghezza d’onda di fluorescenza si misura il decadimento e si raggiungono
risoluzioni di 80 fs.
49
Fluorescenza: risolta nei tempi
3º Esempio (1)
50
25
Fluorescenza: risolta nei tempi
3º Esempio (2)
Spettri di assorbimento ed emissione
della Cumarina 153 in etanolo (blu) e
2-metilbutano (rosso).
Lo Stokes shift è molto maggiore nel
solvente più polare.
51
Fluorescenza: risolta nei tempi
Decadimento della
fluorescenza di C153 in
metanolo a λ = 480 nm con un
impulso di 80 fs e osservato
fino a 200 ps
3º Esempio (3)
Esempio di ricostruzione dello
spettro di fluo rescenza della
C153 in DMSO.
52
26
Fluorescenza: risolta nei tempi
3º Esempio (4)
Andamento della funzione di responso
spettrale in funzione del tempo per
alcuni solventi polari
Il decadimento avviene su diverse scale
di tempi riflettendo la complessità dei
moti del solvente.
Inizialmente si ha un decadimento di
forma gaussiana con tempi caratteristici
inferiori a 100 fs, seguito da componenti
più lente dell’ordine dei picosecondi e
delle decine o centinaia di picosecondi.
Questa varietà di tempi rispecchia i
diversi tipi di moto presenti.
La componente ultraveloce è relativa al
moto inerziale, mentre quelle che
cadono nei picosecondi si riferiscono a
moti di tipo diffusivo.
53
Fluorescenza: risolta nei tempi
3º Esempio (5)
E’ possibile confrontare la funzione S(t) con
la funzione responso spettrale ricavata da
misure di costante dielettrica del solvente
puro in funzione della frequenza e
trasformate nel dominio dei tempi.
A seconda del modello considerato per
descrivere il responso del solvente si
ottengono degli andamenti diversi per S(t)
54
27