Una soluzione contenente una miscela di NADPH e NAD+ viene
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1 UnasoluzionecontenenteunamisceladiNADPHeNAD+vieneanalizzata spettrofotometricamente.L’assorbanzaditalemiscela,misuratainunacuvettada1cmdi lunghezza,èparia: A260nm=0,85 A340nm=0,11 CalcolarelaconcentrazionediNADPHeNAD+contenutinellamiscelae,sapendoilpeso molecolaredelleduesostanze(PMnad+=663.4g/mol,PMnadph=744.4g/mol),laquantitàin microgrammipresentinellasoluzionedipartenza,ilcuivolumetotaleeraparia58ml.I coefficientidiestinzionedelNADPHedelNAD+allelunghezzed’ondasoprariportatesonoi seguenti: ε (M-1cm-1) Composto 260nm 340nm NAD+ 16900 ~0 NADPH 16900 6220 2 Analizzareiseguentidatidicineticaenzimatica(veditabellasottostante),utilizzandoilsia ilgraficodelleiperbolicheilgraficodeidoppireciproci.Le“velocitàiniziali2”sonostate misurareinpresenzadiunsostanzaaggiuntanelsaggioenzimaticoallaconcentrazionedi50 µM.Qualefenomenostiamoosservandoinpresenzaditalesostanza?Dalgraficodeidoppi reciprocimisuratesperimentalmentelecostanticineticheapparenti(KmeVmax)ediscutetei risultati. Concentrazione disubstrato[S] Velocitàiniziale1 (Vi) Velocitàiniziale2 (Vi) 1/[S] 1/[Vi]1 1/[Vi]2 (?) (?) (?) (M•10-3) (mmoli•L-1•min-1) (mmoli•L-1•min-1) 0,020 0,157 0,066 0,035 0,201 0,095 0,050 0,232 0,125 0,100 0,275 0,182 0,300 0,334 0,267 Calcolareinoltrelakcat,sapendoche: - laconcentrazionedell’enzimapurificatoèstatacalcolataspettrofotometricamente. Lospettrorelativo(vedifigurasotto)siriferiscea50µldienzimain1mldivolume finale,inunacuvettada1cm. ilcoefficientediestinzionemolaredell’enzimaa280nmèparia42000M-1•cm-1. inognisaggioenzimaticosonostatiutilizzati5µldiunasoluzionediluita250volte dienzima,inunvolumefinaledi600µlincuvetta. 0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 250 260 270 280 290 300 310 320 Lunghezze d'onda (nm) 3 InAllegato 1èfornitalamappadelcDNA(piùregionifiancheggianti)codificanteperla treonina sintasidiEscherichiacoli,cheaveteadisposizioneinunaprovettadaqualche parteinfondoalfreezer.Lastrutturaprimariadellaproteinaèlaseguente: 1 MKLYNLKDHNEQVSFAQAVTQGLGKNQGLFFPHDLPEFSLTEIDEMLKLDFVTRSAKILSAFIGDEIPQEILEERVRAAFA FPAPVANVESDVGCLELFHGPTLAFKDFGGRFMAQMLTHIAGDKPVTILTATSGDTGAAVAHAFYGLPNVKVVILYPRGKI SPLQEKLFCTLGGNIETVAIDGDFDACQALVKQAFDDEELKVALGLNSANSINISRLLAQICYYFEAVAQLPQEARNQLVV SVPSGNFGDLTAGLLAKSLGLPVKRFIAATNVNDTVPRFLHDGQWSPKATQATLSNAMDVSQPNNWPRVEELFRRKIWQLK ELGYAAVDDETTQQTMRELKELGYTSEPHAAVAYRALRDQLNPGEYGLFLGTAHPAKFKESVEAILGETLDLPKELAERAD LPLLSHNLPADFAALRKLMMNHQ428 Evidenziatesullamappainallegatoilcodonediiniziodellaregionecodificanteeilcodone distop.Verificateditrovarvinellaregionecodificantetraducendoiprimi5codoniegliultimi 5,utilizzandoilcodonusage(Allegato2). Disegnatedeglioligonucleotidi(dellalunghezzadi25-30nucleotidi)cheservanodaprimer perunareazionediPCRperl’amplificazionedelcDNAdellatreoninasintasi,inmododapoter poi clonare tale cDNA dentro al plasmide pET22b(+) (mappa in Allegato 3), tra i siti di restrizione NdeI e EcoRI. È possibile utilizzare questi due enzimi di restrizione per il clonaggio?AltrimentiutilizzateXhoIcomesitodiclonaggioavalle.Clonatetuttalasequenza dellatreoninasintasi,comprendendosialametioninainizialecheilcodonedistop. Il punto isoelettrico della treonina sintasi è pari a 5.71. Se per la purificazione della proteina voleste utilizzare una resina a scambio ionico, facendo in modo che la proteina si attacchiallaresinainuntampone20mMpotassiofosfatopH7.2,cheresinaascambioionico scegliereste: una CM-sephadex (carbossimetil-sephadex, scambio cationico) o una DEAEsepharosio (dietilamminetil-sepharosio, scambio anionico)? Che tampone utilizzereste per eluirepoilaproteinadallaresina? 4 UnasoluzionecontieneunamisceladiNADHeATPvengonoanalizzati spettrofotometricamente.L’assorbanzaditalemiscela,misuratainunacuvettada1cmdi lunghezza,èparia: A260nm=0,89 A340nm=0,12 CalcolarelaconcentrazionediNADPHeATPcontenutinellamiscela,esapendoilpeso molecolaredelleduesostanze(PMatp=507.1g/mol,PMnadph=664.3g/mol),laquantitàin microgrammipresentinellasoluzionedipartenza,ilcuivolumetotaleeraparia36ml.I coefficientidiestinzionedelNADPHedell’ATPallelunghezzed’ondasoprariportatesonoi seguenti: εmol(M-1cm-1) Composto 260nm 340nm ATP 15400 ~0 NADH 16900 6220 5 L’AspartatoaminotransferasidafegatoeluiscedaunacromatografiaBiogelP-300(gelfiltrazione)aunaposizionecorrispondentealpesomolecolaredi90kDa.Lastessa proteina,sottopostaaelettroforesiinpresenzadiSDS,mostraunpesomolecolaredi45kDa. Unsaggiosuuncampionediaspartatoaminotrasferasimostralapresenzadi5,43µgdi piridossale5’-fosfato(PM=247,1)permilligrammodiproteina. Checonclusionisipossonotrarresullastrutturadell’aspartatoaminotransferasi? 6 IltessutoepaticoembrionalecontieneunenzimachecatalizzalareazioneSèP.Ancheil tessutoepaticoadultomostrataleattivitàenzimatica.Analizzareidatidiattività enzimaticarelativiaidueenzimi(veditabellasottostante),utilizzandosiailgraficoVivs[S] cheilgraficodeidoppireciproci.Determinare,dalgraficodeidoppireciproci,laKmelaVmax). Chedifferenzac’èfral’enzimaembrionaleequelloadulto? Concentrazioneiniziale disubstrato[S] Velocitàiniziale(Vi) (µmoli•L-1•min-1) (M•10-4) Enzima adulto Enzima embrionale 1,05 1,54 1,98 2,86 3,78 5,00 5,00 6,66 8,00 10,00 11,67 13,33 0,16 0,25 0,33 0,5 0,7 1 1,5 1,67 2,0 3,0 6,67 7,15 8,00 10,00 15,0 15,4 16,0 17,1 Inoltre,calcolarelakcat,sapendoche: - laconcentrazionedeglienzimipurificatièstatacalcolataspettrofotometricamente. Glispettrirelativi(vedifiguresotto)siriferisconoa15µldienzimain1mldi volumefinale,inunacuvettada1cm. ilcoefficientediestinzionemolaredell’enzimaadultoa280nmèparia46000M-1• cm-1,mentrequellodell’enzimaembrionaleèparia32000M-1•cm-1. inognisaggioenzimaticosonostatiutilizzati3µldiunasoluzionediluita50volte dienzima,inunvolumefinaledi600µlincuvetta. Enzimaadulto 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 250 260 270 280 290 300 310 Lunghezza d'onda (nm) 0.14 Enzimaembrionale 0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00 250 270 280 290 Lunghezza d'onda (nm) 260 300 310 7 Diecigrammidiburrosonostatisaponificati;lafrazionenonsaponificabileèstata estrattain50mldicloroformio.L’assorbanzaditalefrazione,misuratainunacuvettada1 cmdilunghezza,èparia: A328nm=0,27 A458nm=0,24 CalcolarelaquantitàdicaroteneevitaminaAcontenutinelpanettooriginariodiburro(inµg disostanzapergrammodiburro).IcoefficientidiestinzionedelcaroteneedellavitaminaA allelunghezzed’ondasoprariportatesonoiseguenti: a1%inCHCl3 Composto 328nm 458nm Carotene 340 2200 VitaminaA 1550 ~0 8 LaglicogenofosforilasidamuscoloeluiscedaunacromatografiaBiogelP-300 (cromatografiapergel-filtrazione)aunaposizionecorrispondentealpesomolecolaredi 360kDa.Lastessaproteina,sottopostaaelettroforesiinpresenzadiSDS,mostraunpeso molecolaredi90kDa.Unsaggiosuuncampionedellaglicogenofosforilasimostralapresenza di2,75µgdipiridossale(PM=247,1)permilligrammodiproteina. Checonclusionisipossonotrarresullastrutturadellaglicogenofosforilasi? 9 Analizzareiseguentidatidicineticaenzimatica(veditabellasottostante),utilizzandoil graficodeidoppireciproci.Qualeinaspettatofenomenostiamoosservando?Èpossibile stimarelecostanticinetiche(KmeVmax)? Concentrazione iniziale disubstrato[S] Velocità Iniziale(Vi) 1/[S] (?) 1/[Vi] (?) (M 10-3) • 0,6 1,3 2,5 5,0 10,0 20,0 (µmoli•L-1•min-1) 13,26 24,50 37,45 51,15 48,08 40,50 40,0 33,08 DopoaverstimatolaVmax,calcolarelakcat,sapendoche: - laconcentrazionedell’enzimapurificatoèstatacalcolataspettrofotometricamente. Lospettrorelativo(vedifigurasotto)siriferiscea25µldienzimain800µldi volumefinale,inunacuvettada1cm. ilcoefficientediestinzionemolaredell’enzimaa280nmèparia31800M-1•cm-1. inognisaggioenzimaticosonostatiutilizzati5µldiunasoluzionediluita150volte dienzima,inunvolumefinaledi1000µlincuvetta. 10 InAllegato4èfornitalamappadelcDNA(piùregionifiancheggianti)codificanteper lapiridossalkinasiumana(hPLK),cheaveteadisposizioneinunaprovettadaqualche parteinfondoalfreezer.Lastrutturaprimariadellaproteinaèlaseguente: 1 MEEECRVLSIQSHVIRGYVGNRAATFPLQVLGFEIDAVNSVQFSNHTGYAHWKGQVLNSDELQELYEGLR LNNMNKYDYVLTGYTRDKSFLAMVVDIVQELKQQNPRLVYVCDPVLGDKWDGEGSMYVPEDLLPVYKEKV VPLADIITPNQFEAELLSGRKIHSQEEALRVMDMLHSMGPDTVVITSSDLPSPQGSNYLIVLGSQRRRNP AGSVVMERIRMDIRKVDAVFVGTGDLFAAMLLAWTHKHPNNLKVACEKTVSTLHHVLQRTIQCAKAQAGE GVRPSPMQLELRMVQSKRDIEDPEIVVQATVL312 Evidenziatesullamappainallegatoilcodonediiniziodellaregionecodificante(èilprimo ATGcheincontrate)eilcodonedistop.Verificateditrovarvinellaregionecodificante traducendoiprimi5codoniegliultimi5,utilizzandoilcodonusage(Allegato2). VogliamoinserireilcDNAcodificanteperlahPLKnelvettorepET22(mappainAllegato3), traisitidirestrizioneNdeIeEcoRI.Èunasceltaopportunaobisognasceglierealtrienzimidi restrizione?PerprimacosabisognaamplificareilcDNA,inserendoalleestremitàisitidi restrizioneadeguati.Disegnareglioligonucleotidi(20-30nucleotididilunghezza)da utilizzarecomeprimerperlareazionediPCR.Disegnateduecoppiediprimer,unaper eliminarelacodadipoli-HisalC-terminaledellaproteina,el’altrapermantenerelacodadi istidine.Attenzioneanonandarefuoriframe. 11 Analizzareiseguentidatidicineticaenzimatica(veditabellasottostante),utilizzando ilgraficoVivs[S].Determinaresel’enzimaobbedisceaunacineticaiperbolicao sigmoidale,magariingrandendolaparteinizialedelgrafico.Stimarelecostanticinetiche(Km o[S]0,5*eVmax). *La[S]0.5equivaleallaKmperunenzimachemostracooperatività(andamentosigmoidedella curva). Concentrazioneiniziale disubstrato[S] Velocità Iniziale(Vi) (M•10-4) (µmoli•L-1•min-1) 1,54 5,88 20,0 50,0 80,0 94,12 98,46 99,61 6,25 12,5 25,0 50,0 100,0 200,0 400,0 800,0 Inoltre,calcolarelakcat,sapendoche: - laconcentrazionedell’enzimapurificatoèstatacalcolataspettrofotometricamente. Lospettrorelativo(vedifigurasotto)siriferiscea50µldienzimain800µldi volumefinale,inunacuvettada1cm. ilcoefficientediestinzionemolaredell’enzimaa280nmèparia53000M-1•cm-1. inognisaggioenzimaticosonostatiutilizzati2µldiunasoluzionediluita25volte dienzima,inunvolumefinaledi600µlincuvetta. 0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 250 260 270 280 290 300 310 Lunghezze d'onda (nm) 320 12 Cercateinbancadati(PubMedNucleotide)lasequenzadelcDNAcodificanteperla homoserinekinasediEscherichiacoli.Sitrattadell’enzimacon “protein_id=AAN78504.1"inPubMedProtein.MappatelasequenzadicDNAutilizzando Webcutter2econtrollatechecodifichieffettivamenteperlahomoserinekinase(utilizzandoil codonusagediE.coli,Allegato2). Chereazionecatalizzal’enzima?Scrivetelestrutturedisubstratieprodotti.Qualèl’“E.C. number”dell’enizma?Dicheviabiosinteticafaparte? DisegnatedeglioligonucleotidicheservanodaprimerperunareazionediPCRper l’amplificazionedelcDNAdellahomoserinekinase,inmododapoterpoiclonaretalecDNA dentroalplasmidepET22b(+)(Allegato3),traisitidirestrizioneNdeIeXhoI.Èpossibile utilizzarequestidueenzimidirestrizioneperilclonaggio?Ipotizzateduediversiclonaggi.Nel primodovreteaggiungereallahomoserinekinasi,inposizioneC-terminale,lacodadiistidine presentenelplasmide.Nelsecondoclonaggioinvecedovetefareinmodochelacodadi istidinenonvengatradotta. 13 LaserinaidrossimetiltransferasiumanaeluiscedaunacromatografiaBiogelP-300a unaposizionecorrispondentealpesomolecolaredi200-220kDa.Lastessaproteina, sottopostaaelettroforesiinpresenzadiSDS,mostraunpesomolecolaredicirca53kDa.Un saggiosuuncampionediserinaidrossimetiltrasferasimostralapresenzadi3,85µgdi piridossale5’-fosfato(PM=247,1)permilligrammodiproteina. Checonclusionisipossonotrarresullastrutturadellaserinaidrossimetiltrasferasi?discutete lastechiometriadelpiridossale5’-fosfato:checosapotrebbeesseresuccessodurante l’analisi?
