Diapositiva 1

Enzimi, membrane
e antiossidanti naturali
prof. Roberto Stevanato
d.ssa Sabrina Fabris, d.ssa Mariangela Bertelle
d.ssa Elena Gregoris, p.i. Achille Zanin
Gruppo di Biochimica Fisica, Dipartimento di Chimica Fisica
PURIFICAZIONE DI ENZIMI E LORO CARATTERIZZAZIONE
INTERAZIONE DI BIOMOLECOLE E DRUGS CON MEMBRANE BIOLOGICHE
Gli enzimi sono catalizzatori biologici estremamente efficienti presenti nelle matrici naturali. La loro
estrazione e purificazione permette: a) di studiarne i meccanismi chimici del processo catalitico; b) di
utilizzarli in chimica analitica e per la sintesi di farmaci e chemicals; c) per applicazioni industriali.
In virtù delle conoscenze chimiche, il gruppo di ricerca ha messo a punto nuove metodiche di
purificazione, basate in particolar modo sulla cromatografia di affinità, per ottenere enzimi di elevata
purezza (>95%) con buona resa, notevole attività e mediante un numero limitato di passaggi di
purificazione. Sugli enzimi così purificati è stato possibile condurre studi di caratterizzazione cinetica
correlando i risultati alla possibile struttura del loro sito attivo.
Il gruppo di ricerca si è interessato della purificazione e della caratterizzazione cinetica dei seguenti
enzimi:
● ammino ossidasi di plasma ovino
● ammino ossidasi di soia
● ammino ossidasi di pisello
● ammino ossidasi mitocondriale
Le membrane biologiche, formate da un doppio strato lipidico idrofobico contornato di superfici
idrofiliche, costituiscono la barriera di separazione e di protezione della cellula dall’ambiente
circostante; sono però selettivamente permeabili a ioni e molecole. Le modificazioni delle proprietà
meccaniche della membrana per effetto di molecole idrofobiche sono alla base dell’azione di
anestetici ed alcuni farmaci; inquinanti alimentari e molecole estranee possono influire
negativamente sulle proprietà di membrana provocando un malfunzionamento cellulare o la morte
della cellula stessa.
analisi terspin (ESR) ha stule membrane natu(propofol e omologhi) ,
inquinanti alimen(resveratrolo, pi-
In questo contesto il gruppo di ricerca, utilizzando tecniche di
mica differenziale (DSC) e di risonanza elettronica di
diato gli effetti su liposomi fosfolipidici (che mimano
rali) di biomolecole (poliammine biogene), anestetici
farmaci (prozac), composti chimici (ammine di sintesi),
tari (ITX) e molecole naturali con proprietà antiossidanti
ceide, polifenoli del vino e del tè, flavonoidi del propolis).
piceide, vitamina E e BHT,
Nell’immagine a fianco: modello di dislocazione nel doppio strato lipidico di resveratrolo,
un antiossidante di sintesi.
Nell’immagine a fianco: schema del sito attivo della
ammino ossidasi di plasma bovino costruito sulla base di studi cinetici
Toninello, A., Dalla Via L., Stevanato, R., Yagisawa S. Biochemistry, 39/2, 324-331 (2000).
OH
Momo, F., Fabris, S., Bindoli, A., Scutari, G., Stevanato,
R Current Topics in Biophysics 26/1, 75-81 (2002)
Momo, F., Fabris, S., Wisniewska, A., Fiore, C., Bindoli, A., Scutari, G., Stevanato, R. Biophys Chem. 103/3, 213-22 (2003)
HO
O
Momo F., Fabris S., Stevanato
R Biophysical
Chemistry 118, 15-21 (2005)
Momo F.,dei
Fabris S., Stevanato R. Biophysical Chemistry, 127, 36-40 (2007)
Strutture
Fabris
S., Momo F., Ravagnan, G., Stevanato R Biophysical Chemistry 135, 76-83 (2008)
flavonoidi
esaminati
OH
O
contenuti in
significative
quantità nel
PROPRIETA’
ANTIOSSIDANTI DI MOLECOLE DELL’AGROALIMENTARE
propolis
Vianello, F., Malek-Mirzayans, A., Di Paolo, M.L., Stevanato, R., Rigo, A. Protein Expr. Purif. 15(2), 196-201 (1999)
Di Paolo M.L., Scarpa, M., Corazza, A., Stevanato, R., Rigo, A. Biophys. J. 83/4, 2231-2239 (2002)
Di Paolo, M.L., Stevanato, R., Corazza, A., Vianello, F., Lunelli, L., Scarpa, M., Rigo, A. Biochemical Journal 371/2, 549-556 (2003)
Cardillo, S., De Iuliis, A., Battaglia, V., Toninello, A., Stevanato, R., Vianello, F. Submitted to Arc. Biochem. Biophys. (2008)
DETERMINAZIONE ENZIMATICA DI ANALITI
le poliammine
La freschezza di certuni alimenti è inversamente proporzionale al contenuto di
poliammine.
La metodica messa a punto prevede la loro determinazione per via spettrofotometrica
mediante l’impiego dell’enzima ammino ossidasi bovino accoppiando la reazione
principale ad una indicatrice catalizzata dall’enzima perossidasi, nella quale l’H2O2
prodotta dalla prima reazione viene utilizzata per la perossidazione di un composto
incolore in un colorante caratterizzato da elevato valore di assorbanza molare:
R-CH2NH3 + H2O + O2 2 R-CHO + NH + H2O2
+
+
4
Dyered + 2H2O2
Dyeox + 4H2O2
Gli antiossidanti alimentari limitano gli effetti deleteri provocati dalle specie reattive
dell’ossigeno (ROS) responsabili di seri danni alla cellula, quali denaturazione degli
enzimi, alterazione del DNA, perossidazione lipidica delle membrane, ecc., che nell’uomo
possono provocare gravi patologie fra cui carcinogenesi, artrite reumatoide, diabete,
malattie neurodegenerative, ecc. Fra gli antiossidanti naturali i polifenoli occupano un
ruolo di primo piano.
Il gruppo di ricerca, oltre ad aver messo a punto un metodo analitico per la
determinazione dei polifenoli, ha studiato le proprietà antiossidanti del propofol (un
anestetico di largo impiego) , di resveratrolo e piceide (presenti nel vino rosso), mentre
attualmente sta indagando sulle straordinarie proprietà antiossidanti del propoli (un
prodotto dell’alveare).
(enzima Ammino Ossidasi)
(enzima Perossidasi)
(incolore: ε ≅ 0 a 512 nm) (colorato: ε ≅ 22000 a 512 nm)
i polifenoli
Sono antiossidanti naturali dotati di notevoli proprietà benefiche all’organismo (ad es.
inibiscono la perossidazione lipidica); sono presenti soprattutto nei vegetali, nel vino e nel
tè.
La metodica messa a punto prevede la loro determinazione per via spettrofotometrica
mediante l’impiego dell’enzima perossidasi che catalizza la reazione di coupling
perossidativo fra i polifenoli del campione e il reagente 4-amminofenazone in presenza di
H2O2 secondo la reazione sotto riportata. I differenti polifenoli danno luogo alla
formazione di una famiglia di composti colorati caratterizzati da elevato valore di
assorbanza molare.
HO
OH
OH
OH
HO
O
HO
+ HO
N
+ 2H2O2
O
NH2
OH
OH
OH
fenolo
enzima perossidasi
OH
Struttura di un
generico flavonoide
+ 4H2O
N
8
dye ox (forma presunta)
4'
2'
7
4-amminofenazone
O
O
3'
N
N
O
O
O
O
N
O
6
1
O
1'
B
5'
Rezione fra il resveratrolo ed un i iziatore radicalico
Rigobello, M.P.,
R., Momo, F., Fabris, S., Scutari, G., Boscolo, R., Folda, A., Bindoli, A. Free Rad. Res. 38/3, 315-321
6'
2 Stevanato,
A (2004).C
Fabris S., Momo
3 F., Ravagnan, G., Stevanato R Biophysical Chemistry 135, 76-83 (2008)
4 R., Fabris S., Bertelle M., Momo F. In press on Acta Alimentaria (DOI: 10.1556/AAlim.2008.0031).
5 Stevanato
Stevanato, R., Fabris, S., Momo, F. J. Agric. Food Chem. 52, 6287-6293 (2004).
Stevanato R., Fabris S., Bertelle M., Momo F. In press on Acta Alimentaria (DOI: 10.1556/AAlim.2008.0031).
Possibili forme di risonanza
di un radicale libero
sull’ossidrile in posizione 3
dell’anello C .
IMMOBILIZZAZIONE DI ENZIMI
Ricerca di nuovi supporti
La immobilizzazione dell’enzima ad un supporto solido permette di
riutilizzare il catalizzatore finché conserva attività. Il gruppo di
ricerca ha individuato e studiato un supporto solido che interagisce
direttamente con le proteine mediante legami idrogeno e non richiede
quindi reagenti specifici per l’immobilizzazione. Si tratta di un
polichetone che grazie all’elevato numero di gruppi carbonilici ed
alla loro regolare disposizione può formare innumerevoli legami
idrogeno con i gruppi –NH delle catene polipeptidiche elle proteine.
A questo supporto sono stati immobilizzati, in modo irreversibile e
con resa elevata, diversi enzimi di classe differente. I catalizzatori
eterogenei sono
stati utilizzati per la costruzione di
microbioreattori. O
O
O
O
le strutture
O
polipeptidica
H
N
O
O
N
H
F., Tempera G.,
Toniolo L.,
S., Momo F.,
of
127/4, 670-678 (2007).
H
N
O
O
O
N
H
H
N
O
O
legami idrogeno fra
N polichetonica e
H
Agostinelli E., Belli
Mura A., Floris G.,
Vavasori A., Fabris
Stevanato R. Journal
Biotechnology
Costruzione di
microbioreattori enzimatici
A scopi analitici o per
bioconversioni, contengono
un supporto solido sul quale
è immobilizzato l’enzima. La
conversione viene rilevata
polarograficamente,
amperometricamente o
spettrofotometricamente.
Date le ridotte dimensioni
del reattore (poche decine di
µ L)
sono
possibili
determinazioni mediante la
tecnica
flow
injection
analysis (FIA) con sensibilità
dell’ordine delle nanomoli.
microreattore enzimatico inserito in un
sistema FIA
Agostinelli E., Belli F., Tempera G., Mura A.,
Floris G., Toniolo L., Vavasori A., Fabris S.,
Momo F., Stevanato R.
Journal of Biotechnology 127/4, 670-678
(2007).
Costruzione di biosensori amperometrici
Un sottile strato di enzima, immobilizzato sulla superficie
elettrodica, catalizza la trasformazione del substrato con
consumo o produzione d i una specie elettroattiva che viene
determinata amperometricamente. C aratterizzato da
elevata sensibilità, riproducibilità, stabilità e facilità d’uso,
permette la determinazione di analiti a concentrazione
µ molare in pochi minuti. Il gruppo di ricerca ha messo a
punto biosensori amperometrici per la determinazione
delle poliammine – indice di f reschezza – presenti negli
alimenti.
Segnali di risposta del biosensore per la determinazione delle poliammine
Gasparini, R., Scarpa, M., Di Paolo, M.L., Stevanato, R., Rigo, A., J. Bioelectroanal.
Chem.
320,
307
(1991).