enzimi e membrane

FACOLTÀ DI SCIENZE MM.FF.NN.
Gruppo di Biochimica/Biofisica
enzimi e membrane
studi e applicazioni di macromolecole e
strutture sopramolecolari biologiche
prof. Roberto Stevanato
prof. Federico Momo
d.ssa Sabrina Faris
dssa Mariangela Bertelle
p.i. Achille Zanin
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Perché la Chimica Biologica nei corsi di laurea in
Chimica e Chimica Industriale?
o
Per uno studio più prettamente chimico dei processi
biologici;
o
Per rispondere ad esigenze di sintesi ed analisi
“difficili” con la chimica tradizionale;
o
Per creare una chimica più ecocompatibile.
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Gli enzimi: oscuri oggetti del desiderio?
•
Sono proteine (lunghe sequenze di 20 specifici L-α-amminoacidi legati
assieme mediante legame ammidico)
•
che catalizzano reazioni biologiche (rispettando le regole della
chimica)
•
caratterizzate da alta specificità (di reazione, di substrato, di legame,
stereospecificità e prochiralità)
•
di straordinaria efficienza catalitica (incrementano la velocità di
reazione di 108÷1020 volte)
•
che operano in condizione blande (solvente H2O, pH ≅ 7, T ≅ 37°C)
•
che sono in grado di autoregolarsi (nei sistemi biologici) o di essere
regolate (in vitro)
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Gli enzimi: illustri sconosciuti?
30.000
è il numero di enzimi presumibilmente
presenti in natura;
3.000
è il numero di enzimi noti;
300
è il numero di enzimi studiati;
30
è il numero di enzimi utilizzati
industrialmente.
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Il contributo del gruppo di Biochimica/Biofisica
1. Studio del sito attivo e del meccanismo
catalitico delle ammino ossidasi
R-CH2NH3+ + H2O + O2 R-CHO + NH4+ + H2O2
♦
utilizzando enzimi ad elevato grado di purezza (≅ 95%)
appositamente purificati (da siero bovino, da soia, da
pisello) con il contributo determinante del gruppo;
♦
mediante misure di attività a differenti condizioni
chimicofisiche (T, pH, I), in presenza di differenti tamponi,
differenti ioni e controioni e con l’impiego di substrati
amminici a struttura chimica predefinita;
♦
con il supporto di misure ESR (risonanza elettronica di
spin), NMR (risonanza magnetica nucleare).
Rappresentazione
“a nastro”
nastro” dell’
dell’ammino
ossidasi bovina.
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. . . e con quali risultati?
EFFETTO FOSFATO
Il fosfato, utilizzato per decenni come tampone nelle misure di attività
attività dell’
dell’ammino
ossidasi bovina, complessa i substrati poliamminici che in tale forma non sono
riconosciuti come substrati e quindi agisce come inibitore dell’
dell’enzima
SPM + 2Pi SPM.Pi2
substrato
no substrato
Queste misure
hanno permesso
di determinare
con precisione la
costante di
formazione del
complesso
SPM.Pi2.
Corazza, A., Stevanato, R., Di Paolo, M.L., Scarpa, M., Mondovì, B., Rigo, A.Biochem. Biophys. Res. Commun. 189/2, 722 (1992).
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EFFETTO IONI ALCALINI
E ALCALINO TERROSI
Ioni alcalini e alcalino terrosi
si legano all’’ammino ossidasi
bovina con differenti affinità
modificandone
l’attività
catalitica.
In particolare, K+ e Ca2+
agiscono
da
inibitori
competitivi nei confronti dei
substrati naturali spermina e
spermidina.
Di Paolo M.L., Scarpa, M., Corazza, A., Stevanato, R., Rigo, A. Biophys. J. 83/4, 2231-2239 (2002)
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EFFETTO FORZA IONICA
A basse concentrazioni di substrato la velocità
velocità
della reazione catalizzata da ammino ossidasi
bovina è influenzata dalla forza ionica del
mezzo con andamento proporzionale al numero
di cariche positive del substrato.
Ad elevate concentrazioni di substrato la
velocità
velocità della reazione risulta indipendente
dalla forza ionica.
Questi risultati hanno permesso di ipotizzare il numero e la natura di gruppi
carichi presenti nel sito attivo che intervengono nella formazione del
complesso enzima-substrato.
Stevanato, R., Mondovì, B., Befani, O., Scarpa, M., Rigo, A. Biochem. J. 299, 317 (1994).
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EFFETTO TEMPERATURA
L’ammino ossidasi bovina presenta un
andamento non rettilinio nel plot di
Arrhenius
evidenziando
una
discontinuità
discontinuità dovuta probabilmente a
differenti rate determining steps
dipendenti dalla temperatura.
I valori di entropia di attivazione
ottenuti
hanno
permesso
di
ipotizzare la neutralizzazione di
cariche con formazione di molecole
d’acqua nel meccanismo catalitico.
Stevanato, R., Vianello, F., Rigo, A. Arch. Biochem. Biophys. 324/2, 374-378 (1995).
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EFFETTO pH
L’attività
attività dell’
dell’ammino
ossidasi bovina, a basse
concentrazioni
di
substrato, dipende dal
pH in relazione al
numero di cariche
positive presenti nel
substrato amminico.
I risultati ottenuti hanno permesso di individuare i gruppi protonabili
coinvolti nella catalisi presenti nel sito attivo e di determinarne la loro Ka.
Di Paolo, M.L., Stevanato, R., Corazza, A., Vianello, F., Lunelli, L., Scarpa, M., Rigo, A. Biochemical Journal 371/2, 549-556 (2003)
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Tutti i dati ottenuti in anni di ricerche hanno
permesso di tracciare un modello grafico dei gruppi
funzionali e delle interazioni elettrostatiche ed
idrofobiche fra substrato e sito attivo dell’
dell’ammino
ossidasi bovina (sin). Questi risultati sono stati
recentemente confermati da misure di diffrazione
raggi X su ammino ossidasi cristallina (dx).
Di Paolo, M.L., Stevanato, R., Corazza, A., Vianello, F., Lunelli, L., Scarpa, M., Rigo, A. Biochemical Journal 371/2, 549-556 (2003).
Lunelli M, Di Paolo ML, Biadene M, Calderone V, Battistutta R, Scarpa M, Rigo A, Zanotti G. J Mol Biol. 346(4):991-1004 (2005).
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2. Applicazioni biotecnologiche di enzimi
Tematiche:
purificazione di enzimi;
determinazione enzimatica di analiti;
ricerca di nuovi supporti per l’immobilizzazione di enzimi;
biosensori amperometrici;
microbioreattori enzimatici.
Enzimi utilizzati:
ammino ossidasi di plasma bovino
ammino ossidasi di soia
ammino ossidasi di pisello
ammino ossidasi di lenticchia
ascorbato ossidasi
superossido dismutasi
horse radish perossidasi
glucosio ossidasi
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PURIFICAZIONE DI ENZIMI
purificazione
ne da matrici
Lo studio di enzimi non commerciali richiede la loro purificazio
biologiche (tessuti e fluidi animali; radici, germogli e fiori; batteri).
In virtù
virtù delle conoscenze chimiche si sono messi a punto nuove metodiche di
purificazione, basate in particolar modo sulla cromatografia di affinità
affinità, per ottenere
attivittà e mediante un
enzimi di elevata purezza (>95%) con buona resa, notevole attivi
numero limitato di passaggi di purificazione.
Sono stati purificati:
ammino ossidasi di plasma bovino
ammino ossidasi di soia
ammino ossidasi di pisello
Vianello, F., Di Paolo M.L., Zennaro, L., Stevanato, R., Rigo, A. Prot. Expr. Purif., 3, 362 (1992).
Vianello, F., Di Paolo, M.L., Stevanato, R., Gasparini, R., Rigo, A. Arch. Biochem. Biophys. 307/1, 35 (1993).
Vianello, F., Malek-Mirzayans, A., Di Paolo, M.L., Stevanato, R., Rigo, A. Protein Expr. Purif. 15(2), 196-201 (1999).
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DETERMINAZIONE ENZIMATICA DI ANALITI: le poliammine
La freschezza di certuni alimenti è inversamente proporzionale al contenuto di
poliammine.
La metodica messa a punto prevede la loro determinazione per via
spettrofotometrica mediante l’l’impiego dell’
dell’enzima ammino ossidasi bovino
catalizzataa dall’
accoppiando la reazione principale ad una indicatrice catalizzat
dall’enzima
perossidasi, nella quale l’l’H2O2 prodotta dalla prima reazione viene utilizzata per la
perossidazione di un composto incolore in un colorante caratterizzato
caratterizzato da elevato
valore di assorbanza molare:
R-CH2NH3+ + H2O + O2 R-CHO + NH4+ + H2O2
Dyered + 2H2O2 Dyeox + 4H2O2
(incolore: ε ≅ 0 a 512 nm)
(cat. A.O.)
(cat. HRP)
(colorato: ε ≅ 22000 a 512 nm)
Stevanato, R., Mondovi', B., Sabatini, S., Rigo, A. Anal. Chim. Acta, 237, 391 (1990).
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DETERMINAZIONE ENZIMATICA DI ANALITI: i polifenoli
Antiossidanti naturali dotati di notevoli proprietà
proprietà benefiche all’
all’organismo (ad es.
inibiscono la perossidazione lipidica) sono presenti nei vegetali,
vegetali, nel vino e nel tè
tè.
La metodica messa a punto prevede la loro determinazione per via spoettrofotometrica
mediante l’l’impiego dell’
dell’enzima perossidasi che catalizza la reazione di coupling
perossidativo fra i polifenoli del campione e il reagente 44--amminofenazone in presenza
di H2O2. I differenti polifenoli danno luogo alla formazione di una famiglia
famiglia di
composti colorati caratterizzati da elevato valore di assorbanza molare.
O
N
+ 2H2O2
+ HO
N
O
N
N
NH2
N
O
4-amminofenazone
fenolo
dye ox (forma presunta)
Stevanato, R., Fabris, S., Momo, F. J. Agric. Food Chem. 52, 6287-6293 (2004).
+ 4H2O
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RICERCA DI NUOVI SUPPORTI
PER L’
L’IMMOBILIZZAZIONE DI ENZIMI
Gli enzimi sono catalizzatori biologici solubili in acqua: nelle reazioni in batch
diviene impossibile recuperare l’l’enzima al fine della reazione catalizzata, per cui
l’enzima ancora attivo viene perso.
Immobilizzando l’l’enzima ad un supporto solido è possibile recuperare il
attivit
tività
catalizzatore ancora attivo e riusarlo sino a quando presenta at
tività.
Recentemente è stato individuato un supporto solido che interagisce direttamente
direttamente
con le proteine mediante legami idrogeno e non richiede quindi reagenti
reagenti specifici per
l’immibilizzazione.
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Si tratta di un polichetone
C CH2
O
CH2
n
O
O
O
sintetizzato nei laboratori del gruppo
del prof. Toniolo che grazie all’
all’elevato
numero di gruppi carbonilici ed alla loro
O
O
O
regolare disposizione può formare
H
O
H
O
H
O
innumerevoli legami idrogeno con i
N
N
N
N
N
N
gruppi –NH delle catene polipeptidiche
O
O
H
O
H
H
delle proteine.
irreversibilee e con resa elevata,
A questo supporto sono stati immobilizzati, in modo irreversibil
diversi enzimi di classe diversa.
Il catalizzatorei eterogenei così
così ottenuti sono stati utilizzati per la costruzione di
microbioreattori.
Agostinelli E., Belli F., Tempera G., Mura A., Floris G., Toniolo L., Vavasori A., Fabris S., Momo F., Stevanato R.
Journal of Biotechnology 127/4, 670-678 (2007).
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BIOSENSORI AMPEROMETRICI
Un sottile strato di enzima (ammino
ossidasi), depositato sulla superficie
elettrodica, catalizza la trasformazione del
substrato
(ammine
biogeniche)
con
produzione di H2O2 che viene determinata
amperometricamente.
Caratterizzato da elevata sensibilità
sensibilità,
riproducibilità
riproducibilità, stabilità
stabilità e facilità
facilità d’uso,
permette la determinazione della freschezza
di prodotti proteici deperibili mediante la
misura delle poliammine.
Gasparini, R., Scarpa, M., Di Paolo, M.L., Stevanato, R., Rigo, A. J. Bioelectroanal. Chem. 320, 307 (1991).
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MICROBIOREATTORI ENZIMATICI
A scopi analitici o per bioconversioni, contengono un
supporto solido sul quale è immobilizzato l’l’enzima.
La conversione viene rilevata polarograficamente,
amperometricamente o spettrofotometricamente.
Date le ridotte dimensioni del reattore (dell’
(dell’ordine
dei µL) sono possibile determinazioni mediante la
tecnica flow injection analysis (FIA) con sensibilità
sensibilità
dell’
dell’ordine delle nanomoli.
Stevanato, R., Avigliano, L., Finazzi-Agrò, A., Rigo, A. Anal. Biochem., 149, 537 (1985).
Stevanato, R., Porchia, M., Berfani, O., Mondovi, B., Rigo, A. Biotechn. Appl. Biochem. 11, 266 (1989).
Gasparini, R., Scarpa, M., Di Paolo, M.L., Stevanato, R., Rigo, A. J. Bioelectroanal. Chem. 320, 307 (1991).
Stevanato, R., Mondovi', B., Sabatini, S., Rigo, A. Anal. Chim. Acta, 237, 391 (1990)
Agostinelli E., Belli F., Tempera G., Mura A., Floris G., Toniolo L., Vavasori A., Fabris S., Momo F., Stevanato R. J.
Biotechnol. 127/4, 670-678 (2007).