relazione terzo anno
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RELAZIONE DOTTORATO 3° ANNO CAPPELLETTI EMILIA XX CICLO PROFESSORE TUTOR STEFANO MANGANI CLONAGGIO ED ESPRESSIONE DELLA PROTEINA UMANA HPRG L’oggetto della mia ricerca quest’anno è stato quello di clonare ed esprimere la proteina umana HPRG, per poterla purificare e cristallizzare, ottenendo così la struttura tridimensionale da studiare. HPRG, conosciuta anche come HRG, è un’abbondante glicoproteina plasmatica, 125_g/ml,or 1.5 _M, con emivita di tre giorni , con un’insolita alta percentuale di residui di Pro e His. Ha un peso molecolare di circa 67 KDa, è composta da 507 aa, appartiene alla superfamiglia delle cistatine ed è implicata in una serie di processi come la coagulazione del sangue, la fibrinolisi, la risposta immunitaria e il trasporto di ioni metallici. Il gene codificante per la proteina d’interesse è stato amplificato mediante una reazione di PCR con l’utilizzo della Taq Expande High Fidelity e con i primers HPRG-EXP-pGL/f, che aggiunge il sito di restrizione blunt StuI al 5’ della ORF ( open reding frame), e HPRG-EXP/r, che aggiunge il sito di restrizione BamHI dopo il codone di stop, per inserlo nel vettore di espressione pGL. HPRG-EXP-pGL/f : 5’-caaagcactcattgcactcatt HPRG-EXP/r : 5’-ccggatcctcttcaaaggaatca pGL è un vettore che deriva dal vettore commerciale pET 9a (Novagene Inc.), con le caratteristiche tipiche dei vettori pET, origine di replicazione ( dal plasmide pBR322), promotore e terminatore specifici per l’ RNA polimerasi del fago T7, sequenza consensus “Shine-Dalgarno” ma è stato modificato introducendo sequenza target HIS-tag, una sequenza codificante un peptide luminescente di 18 aminoacidi (LUMIO) e una sequenza di taglio per la proteasi TEV. Per il clonaggio del prodotto di amplificazione, il vettore precedentemente modificato è stato digerito con gli enzimi di restrizione Bam-HI e StuI. Il prodotto di amplificazione è stato digerito con il solo enzima BamHI. Dopo la ligazione dei due frammenti con l’enzima T4 DNA-ligasi, si è proceduto alla trasformazione per elettroporazione del costrutto nel ceppo di E.Coli DH5α. L’analisi dei profili di restrizione, effettuata sui plasmidi ricombinanti ottenuti, è stata effettuata tramite l’utillizzo degli enzimi di restrizione NdeI e HincII. Una volta analizzato il costrutto ricombinante, si è proceduto alla sua trasformazione nel ceppo di E.Coli Rosetta DE3. La scelta di questo tipo di cellule come ospite per l’espressione di HPRG, non è stata casuale. Le cellule Rosetta ( DE3 ), sono designate per aiutare l’espressione di proteine eucaristiche che contengono codoni rari come AGG, AGA, AUA, CUA, CCC, GGA, in quanto producono tRNAs per questi codoni su un loro plasmide compatibile, cloramfenicolo – resistente. Dopo la trasformazione in questo ceppo , sono stati analizzati alcuni cloni autenticizzati con l’analisi dei profli di restrizione con gli enzimi NdeI e HincII e con l’analisi di sequenza dell’inserto. Quindi il clone analizzato è stato inoculato in 50 ml di terreno ZYP autoinducente e fatto crescere a 37° C in agitazione. Sono stati prelevati campioni a diverse ore e dopo 24 ore, e la presenza della produzione della proteina di interesse è stata valutata con un gel di proteine. I campioni sono stati preparati con i reagenti del Lumio per permettere la visualizzazione di una banda fluorescente nel gel in corrispondenza della banda proteica, una volta che il gel fosse posto su un transilluminatore sotto effetto di raggi ultravioletti. La banda fluorescente non si è mai accesa in nessuna frazione, la proteina umana HPRG, per la sua enorme quantità di codoni rari, per il fatto di essere una proteina glicosilata non è stata prodotta in E. Coli, stò valutando l’ipotesi di esprimere tale proteina in lieviti.
