Lymphoscreen DR 30x2

[IT]
Lymphoscreen DR 30x2
per la determinazione degli anticorpi HLA-DR/DQ
[REF] 7
823 350
[MZP] Micropiastre per test cellulari
[COMP] Complemento
Usi
Il Lymphoscreen DR 30x2 contiene due panel di linfociti congelati tipizzati per lo
screening e la differenziazione degli anticorpi citotossici HLA-DR/DQ complemento-dipendente (1,5).
Ciascuna piastra [MZP] contiene due identici pannelli di linfociti B congelati e
tippizzati per HLA (6).
Introduzione
Dopo trasfusioni di sangue, trapianti di organi e durante una gravidanza possono
formarsi anticorpi-HLA-DR/DQ citotossici(2,3,4). Con l’aiuto di Lymphoscreen DR
30x2 è possibile un rapido screening dei sieri di donne in gravidanza e di pazienti
trasfusi o trapiantati. La determinazione degli anticorpi HLA-DR/DQ citotossici
contro un panel di linfociti B HLA-tipizzati è una metodica che può essere
eseguita in ogni laboratorio con esperienza nel settore del sistema HLA.
Principio del test di microlinfocitotossicità
I linfociti B con antigeni-HLA noti sono incubati con un siero di specificità HLA
sconosciuta e complemento di coniglio. In caso di presenza dell’antigene
corrispondente, l’aggiunta di siero in presenza di complemento porta alla lisi
dei linfociti B visibile mediante l’uso di una sostanza colorante (es. eosina Y) che
penetra all’interno dei linfociti. La valutazione dei linfociti B lisati e di quelli vitali
viene effettuata con un microscopio a contrasto di fase invertito.
Il siero del paziente deve essere stato precedentemente controllato per la
presenza di anticorpi HLA-ABC (es. con Lymphoscreen ABC 60). In caso di
risultato positivo, è necessario rimuovere gli anticorpi HLA-ABC mediante
assorbimento con un pool di trombociti sufficientemente ampio.
Descrizione del prodotto
Nel Lymphoscreen DR 30x2 i linfociti B tipizzati del sangue periferico,
proveniente da diversi donatori, vengono congelati in micropiastre [MZP]. La
membrana dei linfociti congelati viene stabilizzata con DMSO (dimetilsulfossido),
composto tossico per le cellule, e pertanto deve essere rimosso immediatamente, mediante opportuni lavaggi, non appena le micropiastre vengono
portate a temperatura ambiente per lo scongelamento.
Una confezione di Lymphoscreen DR 30x2 contiene 6 piastre [MZP]. In ogni
piastra [MZP] possono essere testati i sieri di 2 soggetti. Il Lymphoscreen DR
30x2 contiene due panel identici congelati di 26 linfociti B tipizzati necessari per
lo screening di due pazienti e 2 pool di linfociti (4 pozzetti) per i doppi controlli
positivi e negativi. Le posizioni dei controlli sono identificate mediante dei colori.
Per ogni pozzetto si mettono 2 ul di sospensione linfocitaria in 13 ul di soluzione
congelante. Il numero dei linfociti è di ca. 7000 per pozzetto.
Precauzione
[IVD] Reagenti solo per diagnostica in vitro
Il test deve essere effettuato da tecnici di laboratori autorizzati e ben preparati.
Tutti i materiali di origine umana impiegati per questo prodotto sono stati testati
con kit approvati dalla FDA per rilevare l'eventuale presenza di :
HBsAg, anti-HCV ed anti-HIV-1/2 con esito negativo.
Tuttavia, tutti i prodotti di origine umana devono essere considerati potenzialmente in grado di trasmettere epatiti, HIV o altre malattie infettive.
Il complemento è materiale biologico derivante da conigli sani. Come tutti i
componenti biologici, deve essere trattato come potenzialmente infetto.
DMSO è tossico.
Si raccomanda di attenersi alle procedure di sicurezza opportune.
Questo prodotto contiene lattice che potrebbe causare reazioni allergiche.
Conservazione
Le Lymphoscreen DR 30x2 sono stabili fino alla data dichiarata sull' etichetta.
Il Lymphoscreen DR 30x2 deve essere conservato ad almeno -70°C. Le confezioni consegnate in ghiaccio secco devono essere immediatamente trasferite
in un congelatore a -70°C. Le confezioni di Lymphoscreen DR 30x2, una volta
aperte, non possono essere conservate insieme al ghiaccio secco.
Segnali di deterioramento
Se il controllo negativo indica più del 10% di linfociti lisati e la tossicità di base è
>10%, è necessario ripetere il test.
Se il controllo positivo indica meno dell'80% di linfociti lisati, è necessario ripetere
il test.
Preparazione dei campioni
Il siero del paziente può essere ottenuto da:
circa 3 ml di sangue intero, oppure
circa 3 ml di sangue eparinato (trasformare il plasma in siero mediante
aggiunta di trombina), oppure
circa 3 ml di sangue trattato con EDTA o con ACD (trasformare il plasma in
siero mediante aggiunta di cloruro di calcio).
Il siero del paziente puo’ essere conservato ad almeno -20°C.
Metodica
Materiale disponibile
Lymphoscreen DR 30x2 (1 piastra-microtest [MZP] per 2 campioni)
Complemento [COMP] di coniglio liofilizzato (in ogni confezione sono acclusi 3 x 1
ml)
Worksheets (in ogni confezione sono acclusi 6 fogli).
Ulteriori materiali necessari
1. * Lymphostabil (terreno McCoy 5A, modificato sec. Park e Terasaki, privo
di Ca++ e Mg++)
2.
Siero di vitello fetale (FCS), inattivato al calore, Sigma
3. * Controllo HLA positivo
4. * Controllo HLA negativo
5.
Eosina Y(sciogliere al 5% in acqua distillata e filtrare), Merck
6.
Formaldeide per istologia, al 37%, priva di acidi (filtrare e portare a pH 7,2
± 0,2 con idrossido di sodio 0,1 N), Merck
7. * Olio minerale
8.
Carta assorbente
9. * Vetrini coprioggetti 50 x 75 mm
10.
Microsiringhe, Hamilton N.710 (0.100 ml siringhe)
11.
Dispenser per microsiringhe, Hamilton PB 600-1
12.
Microsiringhe Terasaki, Hamilton N.1725 (6 x 0.250 ml siringhe)
13.
Microdispenser per micropiastre, Greiner
14.
Microscopio a contrasto di fase invertito
solo per il procedimento alternativo di lavaggio con una centrifuga
15.
Centrifuga per micropiastre
16.
Pettine a 6 canali per lavaggi, Greiner
17.
Pompa a getto d'acqua
Preparazione dei reagenti
Soluzione di lavaggio: FCS al 10% (v/v) in Lymphostabil.
Controllo HLA positivo: ricostituire nel volume di acqua distillata indicato
sull’etichetta = Controllo positivo
Controllo HLA negativo : ricostituire nel volume di acqua distillata indicato
sull'etichetta = Controllo negativo
Procedimento di lavaggio
1. Procedimento di lavaggio con impiego di carta assorbente.
- Portare le piastre di Lymphoscreen DR 30x2 a temperatura ambiente
(20...24°C).
Attenzione: Si deve ancora vedere ghiaccio nei pozzetti!
Non scongelare più di 2 piastre [MZP] per volta!
- Pipettare in ogni pozzetto, con la microsiringa Terasaki 20 µl della soluzione
di lavaggio.
- Lasciare le piastre [MZP] per 15 minuti a temperatura ambiente (20...24°C).
- Assorbire da un angolo della piastra [MZP], con la carta assorbente, la
soluzione di lavaggio.
Tamponare, fila per fila, la rimanente soluzione di lavaggio.
Attenzione: se la soluzione di lavaggio non viene rimossa completamente, è
possibile un indebolimento delle reazioni a causa della diluizione del siero in
esame.
- Ricoprire Lymphoscreen DR 30x2 con olio (ca. 5µl per ogni pozzetto).
oppure, in alternativa
2. Procedimento di lavaggio con una centrifuga per piastre.
- Portare le piastre di Lymphoscreen DR 30x2 a temperatura ambiente
(20...24°C).
Attenzione: Si deve ancora vedere ghiaccio nei pozzetti!
Non scongelare più di 2 piastre [MZP] per volta!
- Pipettare in ogni pozzetto, con la microsiringa Terasaki, 20 µl della soluzone di
lavaggio.
- Centrifugare immediatamente le piastre [MZP] a 1000 x g per 30 secondi
(senza freno).
- Aspirare accuratamente la soluzione di lavaggio, con il pettine a 6 canali,
mediante la pompa a getto d'acqua.
Attenzione: aspirare attentamente la soluzione di lavaggio tenendosi sul
bordo dei pozzetti, onde evitare di aspirare il sedimento cellulare.
- Ricoprire le piastre Lymphoscreen DR 30x2 con l'olio (ca. 5µl per ogni
pozzetto).
Il Lymphoscreen DR 30x2 è ora pronto per l'uso per il test di microlinfocitotossicità.
Test di microlinfocitotossicità
- Pipettare 2 µl di controllo negativo nei pozzetti 1 A, 1B, 6E e 6F.
- Pipettare 2 µl di controllo positivo nei pozzetti 5E, 5F, 10A e 10B. Le posizioni
dei controlli sono indicate sulla piastra [MZP].
- Pipettare 2 µl del siero del primo paziente nei pozzetti da 1C fino a 5D, e 2 µl
di siero del secondo paziente nei pozzetti da 6D fino a 10C.
Pipettare con cautela per evitare fenomeni di carry over.
- Incubare per 60 minuti a temperatura ambiente (20...24°C).
- 15 minuti prima del termine del tempo di incubazione, ricostituire il
complemento [COMP] con il volume di acqua distillata indicato sull'etichetta,
agitando leggermente. NON CONGELARE NUOVAMENTE! ELIMINARE IL
COMPLEMENTO RESIDUO!
- Aggiungere in ogni pozzetto 5-6 µl di complemento [COMP].
- Incubare per 120 minuti a temperatura ambiente (20...24°C).
- Aggiungere in ogni pozzetto 3-4 µl di eosina Y e lasciar colorare le cellule per
ca.3 minuti.
- Fermare le reazioni con 6-7 µl di formaldeide per ogni pozzetto.
- Coprire con un vetrino coprioggetti la piastra ultimata e leggere non prima di 30
minuti. La valutazione è ancora possibile per un massimo di 3 giorni, se le
piastre vengono conservate a 2..8°C. La lettura avviene in modo conforme ai
Worksheets di forma meandrica acclusi; dall’1 A all’1 F, dal 2 F al 2 A, dal 3
A al 3 F, ecc.
*
disponibile presso Bio-Rad
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823361/10 – 04/2014
[IT]
Controllo di qualità
Il controllo negativo si trova nelle posizioni 1A, 1B, 6E e 6F e verifica la vitalità dei
linfociti. La vitalità dovrebbe essere superiore al 90%.
Il controllo positivo si trova nelle posizioni 5E, 5F, 10A e 10B e verifica l’attività del
complemento. Il controllo positivo dovrebbe contenere più dell’ 80% di linfociti lisati.
Valutazione delle reazioni
La lettura viene eseguita con un microscopio a contrasto di fase invertito. Linfociti
vitali sono chiari e luminosi (= reazione negativa), i linfociti lisati sono scuri e più
grandi (= reazione positiva). La percentuale dei linfociti lisati rispetto alla conta
totale dei linfociti, viene espressa mediante score.
% cellule lisate
Valutazione
0 10%
=
Score 1
negativo
11 20%
=
Score 2
negativo dubbio
21 50%
=
Score 4
debolmente positivo
51 80%
=
Score 6
positivo
81 100%
=
Score 8
fortemente positivo
Score 0
non leggibile
Registrare le letture delle reazioni sui fogli di lavoro. Evidenziare gli antigeni
delle cellule con reazione positiva nella tabella degli antigeni. Mediante la
selezione degli antigeni segnati completamente si definisce la specificità HLA
degli anticorpi.
Se non è possibile riscontrare alcuna specificità, si indica la somma delle reazioni
positive come percentuale delle dimensioni del panel (% PRA = % Panel
Reactive Antibodies = % reattività del panel).
Numero delle reazioni positive
% PRA = ---------------------------------------------------------- x 100
Numero totale delle sospensioni di linfociti
Bibliografia
1. Ruder, H., Opelz, G., Lenhard, V., Schäfer, A., Daniel, V.: A Rapid
Screening Technique for Lymphocytotoxic Antibodies Using Tray-Frozen
Lymphocytes. Cryobiology 21:480-485, 1984.
2. Groth, J., Leverenz, S., Schönemann, C., Kaden, J., May, G., Strobelt, V.,
Schirmer, R.: Donorreaktive und panelreaktive Antikörper bei Nierentransplantatempfängern - Ursachen und Einfluß auf das Transplantatschicksal.
Transplantationsmedizin 7:80-86, 1995.
3. Mueller-Eckhardt, G.: Serologischer Nachweis von HLA-Antigenen und
HLA-Antikörpern. Infusionsther. Transfusionsmed. 21:192-197, 1994.
4. Waßmuth,R.: Immungenetik, in: Medizinische Immunologie, ed. Baenkler
H.W., Ecomed Verlagsgesellschaft Landsberg/Lech, 1995
5. Middleton, D., Bodmer, J., Heyes, J., Marsh, S.:HLA typing reagents:
alloantisera and monoclonal antibodies, in: Histocompatibility Testing - A
Practical Approach, eds. P. Dyer, D. Middleton, Oxford University Press,
1992.
6. Bodmer, J.G., Marsh, S.G.E., Albert, E.D., Bodmer, W.F., Bontrop, R.E.,
Charron, D., Dupont, B., Erlich, H.A., Fauchet, R., Mach, B., Mayr, W.R.,
Parham, P., Sasazuki, T., Schreuder, G.M.Th., Strominger, J.L., Svejgaard,
A., Terasaki, P.I.: Nomenclature for factors of the HLA system, 1996.
Tissue Antigens 49: 297-321, 1997
7. DIN EN ISO 980 Graphic symbols for use in the labelling of medical
devices.
Possibilità di errori
Se il controllo negativo indica più del 10% di linfociti lisati e la tossicità di base è
>10%, è necessario ripetere il test. Possibili cause :
1. Il Lymphoscreen DR 30x2 è stato lasciato troppo a lungo, a temperatura
ambiente, all'apertura dell'imballaggio.
2. Il Lymphoscreen DR 30x2 è stato conservato ad una temperatura inferiore a
-70°C.
3. Lymphoscreen DR 30x2 era completamente scongelato, prima di essere
aggiunto il tampone di lavaggio.
Se il controllo positivo indica meno dell'80% di linfociti lisati, è necessario ripetere
il test. Possibili cause :
1. Insufficiente attività del complemento.
2. Diluizione degli anticorpi eventualmente rilevabili per insufficiente rimozione
della soluzione di lavaggio.
3. Le confezioni sono state conservate insieme al ghiaccio secco.
Né nelle direttive dell’ASHI (American Society for Histocompatibility and
Immunogenetics) né in quelle dell’EFI (European Federation of Immunogenetics)
sono nominati gli antigeni-HLA che dovrebbero essere presenti in un panel per la
differenziazione degli anticorpi-HLA-DR/DQ. Perciò i donatori presenti vengono
scelti in modo tale che tutti gli antigeni-HLA-DR/DQ conosciuti siano presenti il più
possibile.
Le frequenze dei fenotipi variano da una popolazione all’altra. Per questo gli
antigeni rappresentati in Lymphoscreen DR 30x2 possono essere diversi dalla
frequenza antigenica della popolazione da cui deriva il campione esaminato.
In Lymphoscreen DR 30x2 ci sono prevalentemente cellule di origine caucasica.
Caratteristiche specifiche
In Lymphoscreen DR 30x2 si trovano linfociti B, HLA-DR/DQ citotossici (per lo
screening e la differenziazione dipendente dal complemento) di donatori
testati con i corrispondenti antisieri HLA. La presenza degli antigeni è elencata
nel Worksheet accluso.
Ogni lotto è stato controllato con almeno 10 sieri test anti-HLA-DR/DQ
selezionati. Pertanto non è ammesso superare il 10% di reazioni false positive
ed il 5% di reazioni false negative.
Il test eseguito con un siero di controllo negativo deve dare almeno il 90% di
linfociti vitali. Nell'esame di un siero di controllo positivo, almeno il 90% delle
cellule di ogni pozzetto devono essere lisate.
Dati derivanti dal confronto di Lymphoscreen DR 30x2 e di un panel cellulare,
creato in accordo con le direttive ASHI:
7/100 Sieri negativi in entrambi i test
79/100 Sieri positivi in entrambi i test
2/100 Sieri positivi solo nel Lymphoscreen DR 30x2
12/100 Sieri positivi solo nel panel cellulare
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