RIVASalerno2007

LA SINDROME DA MICRODELEZIONE NF1:
ANALISI MEDIANTE FISH CONVENZIONALE E
AVANZATA
Paola Riva
Dipartimento di Biologia e Genetica per le Scienze Mediche
Università degli Studi di Milano
Convegno Neurofibromatosi NF1
Salerno
22 Giugno 2007
NEUROFIBROMATOSI DI TIPO 1 (NF1)
Transmissione: autosomico-dominante
Incidenza: 1/3500
Penetranza: completa a 8 anni
Espressività: variabile
NEUROFIBROMA
Schwan cells, neuroni, cells perineuronali, fibroblasti
MACCHIE CAFFE’ LATTE
iperpigmentazione dermica
NODULI DI LISCH
amartomi dell’iridie
OMIM*162200
NEUROFIBROMATOSI DI TIPO 1
NIH CRITERI CONSENSUS
Presenza di almeno 2 dei seguenti segni clinici:
- 6 o più chiazze café-au-lait
- 2 o più neurofibromi
- 1 o più neurofibromi plexiformi
- Freekling ascellare o inguinale
- 2 o più noduli di Lisch
- Glioma ottico
- Una lesione ossea distinta
displasia dello sfenoide
displasia o assottigliamento della corticale
delle ossa lunghe
- Un parente di primo grado affetto da NF1
ESPRESSIVITA’ VARIABILE
INTER- E INTRA- FAMILIARE
NEUROFIBROMATOSI DI TIPO 1 (NF1)
Gene NF1
17q11.2
Struttura del gene of NF1
357 kb, 60 exons,
geni OMG, EVI2B, EVI2A incastonati in IVS27b
NF1 mRNA
Proteina
12 kb, 8 forme di splicing alternativo
alcune con espressione tessuto-specifica
neurofibromina, 2818 aa, GTPasi Activating
Protein (GAP related domain), oncosoppressore
SINDROME DA
MICRODELEZIONE NF1
segni clinici di NF1
+
dismorfismi
anomalie scheletriche
difficoltà di apprendimento
ritardo mentale
anomalie cardiovascolari
insorgenza precoce di molti neurofibromi
aumentato rischio per lo sviluppo di MPNSTs
NEUROFIBROMATOSI DI TIPO 1- MUTAZIONI
ALTO TASSO DI MUTAZIONE
50% familiari
50% de novo
90 - 95% Mutazioni puntiformi
80% PROTEINA TRONCA
5 - 10% Grosse delezioni (80% REP)
SINDROME DA MICRODELEZIONE NF1
80% delle microdelezioni NF1
ha una lunghezza di 1.4 Mb,
bkp localizzati in due regioni
Duplicate a monte e a valle di NF1:
NF1-REPs prossimale e mediale
Meccanismi che generano le
delezioni
SINDROME DA MICRODELEZIONE NF1
APLOINSUFFICIENZA del GENE NF1 e dei GENI CONTIGUI
DELEZIONI generate dalla RICOMBINAZIONE OMOLOGA INEGUALE fra
SEQUENZE DUPLICATE (NF1-REP, sequenze JJAZ1) che fiancheggiano il
gene NF1
NF1
REP-P ψ−JJAZ1
JJAZ1
REP-M
1.4 Mb (Tipo I)
1.2 Mb (Tipo II)
delezioni atipiche
Fenotipo clinico più grave con segni clinici aggiuntivi oltre a quelli
presenti nella Neurofibromatosi di tipo 1 classica
LOW-COPY REPEATS FIANCHEGGIANO DELEZIONI/DUPLICAZIONI
NELLE SINDROMI DA MICRODELEZIONE/MICRODUPLICAZIONE
DELEZIONE REP
SIZE (Mb) SIZE (kb)
SINDROME
DEL/DUP
REGIONE
Williams-Beuren
7q11.23
Prader-Willi
Angelman
15q11-13
4
>500
Smith-Magenis
17p11.2
5
250
Charcot-Marie-Tooth1A17p11.2
HNPP
1.5
24
Neurofibromatosi 1
1.5
85
Velo-Cardio-Facciale
DiGeorge
17q11.2
22q11
1.6-2
>320
3.0 or 1.5 >225
RACCOLTA PAZIENTI CON SINDROME DA MICRODELEZIONE NF1
Inviati da Centri Nazionali ed Internazionali
Mariano Stabile
Centro di Genetica ZIGOTE
Federica Natacci
ICP Milano
Romano Tenconi
Unità di Genetica Clinica ed Epidemiologica
Dipartimento di Pediatria, Università di Padova
Bruce Korf
University of Alabama, US
Concepcion Hernandez
Molecular Gentics Unit, Hospital Ramon y Cajal, Madrid, Spain
Meena Upadhyaya
Institute of Medical Genetics, University of Wales College of Medicine, Cardiff UK
Identificazione dei SEGNI DISTINTIVI
della Sindrome da microdelezione NF1
Identificazione DELEZIONE (FISH
O SEGREGAZIONE ALLELICA)
CARATTERIZZAZIONE CITOGENETICO-MOLECOLARE DELEZIONI
ANALISI DI SEGREGAZIONE ALLELICA
MICROSATELLITI
M
M
F
F
F
P
P
P
eterozigote
emizigote
M
M
F
F
P
P
non informativo non informativo
delezione
DELEZIONE NF1 E REGIONI FIANCHEGGIANTI
Pt 93
RsaI RFLP ex 5
1 1
1 -*
1 1
2034, ex 13
1 1
1 -*
1 1
IVS27b
(CAn )
1 2
2 -
1 1
FATHER
12 IVS27b
PROBAND
1-? IVS27b
MOTHER
1-1 IVS27b
FATHER
D17S1800
IVS27b
(EVI-20)
2 1
1 -
2 2
IVS38
(CA/GTn )
1 2
2 -
1 1
1 2
D17S1800
PROBAND
D17S1800
1-?
D17S1800
10647, ex 49
1 1
1 -
1 1
MOTHER
D17S1800
1 2
2 -
1 1
1-1
D17S1800
D17S1800
* : inferred by FISH data
FISH
Verificare la natura delle delezioni: REP di tipo I,
di tipo II, atipiche
Delezione Tipo I
1
2
3
4
NF1
REP-P ψ−JJAZ1
5
6
JJAZ1
7
REP-M
8
Delezione Tipo II
Identificare delezioni atipiche e mappare i breakpoint
FISH – Fluorescent In Situ Hybridization
DENATURAZIONE DEL DNA
Energia richiesta per rompere legami H
DNA sonda
DNA cromosomico
IBRIDAZIONE MOLECOLARE
DNA CROMOSOMICO + DNA SONDA
Il DNA della sonda denaturato è presente in eccesso sul vetrino. La riassociazione
specifica richiede un’incubazione da 3h a più giorni
LAVAGGI POST IBRIDAZIONE
VIENE ELIMINATA DAL VETRINO LA SONDA IN
ECCESSO NON APPAIATA SPECIFICAMENTE
IMMUNOFLUORESCENZA
SONDA MARCATA CON APTENE (NON FLUORESCENTE)
RICONOSCIUTA DA ANTICORPO FLUORESCINATO
Permette di visualizzare la sonda sulla specifica regione cromosomica
IBRIDAZIONE MOLECOLARE
Target DNA
Probe DNA
denaturazione
riassociazione
Target DNA
homoduplex
Target-ProbeDNA
heteroduplex
Probe DNA
homoduplex
FISH
DENATURAZIONE
VISUALIZZAZIONE AL
MICROSCOPIO
A FLUORESCENZA
IBRIDAZIONE
IMMUNOFLUORESCENZA
FISH
2-3 Mb
Cromosomi Metafasici
i
n
c
r
e
m
e
n
t
o
r
i
s
o
l
u
z
i
o
n
e
200 Kb
1Mb
Nuclei Interfasici
Cromosomi Stirati
1 Kb
Fibre di DNA
STUDIO MEDIANTE FISH AD ALTA RISOLUZIONE
DI MICRODELEZIONI NF1 IN 20 PAZIENTI
•Identificare delezioni non ricorrenti e mappare i
breakpoint
•Caratterizzare regioni genomiche prone alla
ricombinazione oltre ai già descritti REPs
•Identificare il/i meccanismi molecolari che causano
le delezioni
•Identificare il contenuto genico delle delezioni
MULTISTEP FISH ANALISI
•17q11.2 PACs/BACs su cromosomi metafasici
lunghezza delle delezioni
per stabilire la
•17q11.2 PACs/BACs su cromosomi stretched e fibre di DNA per
valutare la distanza tra i cloni che comprendono le regioni dei
breakpoint
•Produzione di piccole sonde specifiche per la regione dei bkp
restringere l’intervallo genomico che comprende i breakpoint
per
Isolamento breakpoint mediante PCR e loro sequenziamento
CARATTERIZZAZIONE DEI PAZIENTI NF1 MICRODELETI
MEDIANTE FISH CON CLONI 17q11.2-SPECIFICI
Table 3. 17q11.2 PAC and BAC clones used for refined FISH characterization of microdeleted NF1 patients
144O22
952K8
474K4
640N20
904A12
805L22
772K16
41C23
1080
23O13
977D19
932D9
525H19
753N3
778K9
271K11
268F2
252O24
403E9
88B16
104I20
68I3
Patient
82O19
Clones
7
65
72
75
76
77
78
82
85
93
94
DELEZIONI REP
tipo I
116
119
124
125
126
128
103
118
6
DELEZIONE
REP tipo II
GROSSA DELEZIONE
signals on both chromosomes 17,
absence of signal on one chromosome 17,
NF1 GENE TEL BKP
diminished signal on one chromosome 17
cen
NF 1
REP-P
271K11
640N20
778K9
904A12
474K4
4.3-
Kb
b
271K11 474K4
c
128
7
124
125
76
75
72
65
CN
C+
d
C-
a
M
Delezioni
1.4 Mb
REP tipo I
tel
REP-M
cen
tel
NF 1
REP-P
778K9
REP-M
932D9
805L22
753N3
640N20
904A12
Delezione
1.2 Mb
REP tipo II
Pt 103
*
a
1
778K9 640N20
2
271K11 474K4
b
c
cen
Delezione
atipica
3 Mb
REP-P
403E9
NF 1
tel
REP-M
205P19
268F2
31I22
1J8
252O24
Pt 6
a
252O24 1J8
b
c
cen
NF 1
REP-P
82O19
104I20
Delezione
atipica
1.5 Mb
932D9
23O13
977D19
Pt 118
a
82O19 23O13
b
tel
252o24
Top down FISH
definizione
dei bkp
da
> 100 kb
30M
29M
REP-P
28M
31M
32M
REP-M
753N3
1J8
904A12
NF1 region
chr17
tel
cen
753N3 (153 Kb)
904A12
37Kb
(139 Kb)
37Kb
904f 904b 904c 904d 753a 753b 753c 753d
28M
904a
29M
904b 904c 904d
30M
REP-P
904e
904f
31M
pt103
32M
REP-M
NF1 region
chr17
a
5-10 kb
cen
tel
252O24 (171Kb)
1J8 (105 Kb)
5Kb
252a
252b
252c
5Kb
252d
25M
252e
26M
SSH2
252f
REP-P1
1a
1b
1c
1d
1e
pt 6
27M
REP-P2
α Cen2
1f
NF1
cen
tel
68I3 (173Kb)
23O13 (298Kb)
7Kb
68a
68b
68c
68d
8Kb
68e
α Cen2 23a 23b 23c 23d 23e 23f 23g 23h 23i 23l 23m 23n 23o
pt118
Paziente 103
i bkp della delezione 1.2 Mb mappano in piccoli blocchi REP
sequenze di 37 Kb con il 97.6% di omologia, dove sono
compresi rispettivamente il gene JJAZ1 e il suo psuedogene
delezione mediata da
NAHR
Non Allelic Homologous Recombination
una delezione analoga descritta in un pz a mosaico
(Peteck et al., 2003)
SEQUENZA DEL FRAMMENTO DI GIUNZIONE – PZ 6
Junction Fragment
AATTTGAGTTAGGAGTGATTGTAGGGATCCATTTTCTTATCTAGTCCTAATTTCTCTTCTCTGT
GTGTTTTTTACTTCTGTTAGTTATGAAGCTGTGAACTCAAAAGTCCAGTTGCTACACACATTGT
TGCCCAGGAGAATTCATGGAAATACTCTTCCCTAAAAGCCAAGCAGGATTGTTTCCTATATTTG
GTTCTAAGAAAGGATTCTTGCTCAAAAAAGAATGGGGGAAAGCTGCCCAGATAGCTACTTGGTG
CACTTTCCTCTCTGTACATAGCCTGCGTGGATGTGGGTCAAGGGCCCCCGTGCAGCCCTGCCCT
CTAAGCCACAGAGGTTTCCAGCCACAGGCAGCTGAAATCTCTCCAGAACCTTGGTTCTTTTTAT
GTCAGGGCTATAGTCAGTCAAGTTTTCCAAATGAGC
Centromeric Region - 252O24
Telomeric Region - 1J8
AATTTGAGTTAGGAGTGATTGTAGGGATCC
ATTTTCTTATCTAGTCCTAATTTCTCTTCT
CTGTGTGTTTTTTACTTCTGTTAGTTATGA
AGCTGTGAACTCAAAAGTCCAGTTGCTACA
CACATTGTTGCCCAGGAGAATTCATGGAAA
TACTCTTCCCTAAAAGCCAAGCAGGATTGT
TTCCTATATTTGGTTCTAAGAAAGGATTCT
TGCTCAAAAAACAGTGTCCTGTATGGAATG
GGCATGATTTCCCTGAAAGGATGGACTAGG
ATTCTTAGTGGAAAAATCCTTGGATGGGGA
TGATTCTCCAAAGAAAATCCTGGCCCTAAT
CATAACCGTTATTATCATTTATTGTCACCA
GAAATATTCACTGAGCATCTGGTGTGAGTT
TTGCACTGTGCTGGGTATTACTTAAAAAGA
TTAAAACAGTTGGCCCTGAGTAATTGAAGT
CCTGCACAATCCAGAGTGAGGATTCTGGGG
ATTGTGGACCTATGACATGGGCTGGCTTCT
AACATTGGCACTGGTGAGCTGGGGGGACAC
ATCTCTACCATCTGTGATCCATGTACACAT
GTGACAGTGAACTACTCCCAGCCTCTTTGC
CTCTGTTCTCAGCTCTTTCAGAAGAGGGTG
GTTGCTTTGTGGAATGGGGGAAAGCTGCCC
AGATAGCTACTTGGTGCACTTTCCTCTCTG
TACATAGCCTGCGTGGATGTGGGTCAAGGG
CCCCCGTGCAGCCCTGCCCTCTAAGCCACA
GAGGTTTCCAGCCACAGGCAGCTGAAATCT
CTCCAGAACCTTGGTTCTTTTTATGTCAGG
GCTATAGTCAGTCAAGTTTTCCAAATGAGC
RICERCA ELEMENTI RICOMBINOGENICI
•sequenze palindromiche
•elemento χ-like
•siti di taglio per la topoisomerasi
•sequenze minisatelliti
•siti di “switch” per la catena pesante delle immunoglobuline
•siti di pausa della DNA Polimerasi
Junction Fragment
AATTTGAGTTAGGAGTGATTGTAGGGATCCATTTTCTTATCTAGTCCTAATTTCTCTTCTCTGTGTGTTTTTTA
CTTCTGTTAGTTATGAAGCTGTGAACTCAAAAGTCCAGTTGCTACACACATTGTTGCCCAGGAGAATTCATGGA
AATACTCTTCCCTAAAAGCCAAGCAGGATTGTTTCCTATATTTGGTTCTAAGAAAGGATTCTTGCTCAAAAAAG
AATGGGGGAAAGCTGCCCAGATAGCTACTTGGTGCACTTTCCTCTCTGTACATAGCCTGCGTGGATGTGGGTCA
AGGGCCCCCGTGCAGCCCTGCCCTCTAAGCCACAGAGGTTTCCAGCCACAGGCAGCTGAAATCTCTCCAGAACC
TTGGTTCTTTTTATGTCAGGGCTATAGTCAGTCAAGTTTTCCAAATGAGC
Immunoglobulin Heavy
chain class switch repeat
Topoisomerase II
pattern
Paziente 6
Identificazione del frammento di giunzione mediante LR-PCR
No omologia di sequenza (LCR) tra le regioni dei bkp prox e dist
delezione mediata da
NHEJ Non Homologous End Joining
Sequence ricombinogeniche fiancheggiano bkp telomerico
cen bkp: - 10 Kb dal promotore di BLMH
- BLMH trascritto in testicoli
favorisce la ricombinazione
- vicino bkp centr descritto in pz microdeleto (Jenne, 2000)
tel bkp: - in IVS1 del gene ACCN1
- vicino bkp t(1;17) associata a neuroblastoma (Van Roy, 2002)
- vicino a bkps telomerico di due grosse delezioni (Dorschner,
2000)
SEQUENZA DEL FRAMMENTO DI GIUNZIONE – PZ 118
REGIONE BKP CEN (Introne 4 gene SSH2)
ACCAAAACACACAAATGTTGAAAGCTATCAGCAAATATTTATTGGGCATCCAGTATGTGCAAGTGACTGTTGTTATGGGTTTTCAA
AGAGGTGTACTCCAAGTGTGATTCCTGGATCAGCAGCATCAGCAGTGTTTCGAAACTGGCTTAAAAATACAAATTATCTCTGCTTC
CCCTTTACTAATCGAACTCTGCATGTGGAGTCCACCAATTGGTGATTTAACAAAGCTCTCCATGTGATTCTGATATACTTTAAAGT
TGGAGAATCATTGCTTCAGATGATGATGATGATTATTATTAGAGGGTCTTGCACTGTTGCCCAGGTTGAGGGCAGTGGCGTGATCA
TGGCTCACTGCAGCCTTGACCTGCCAGGCTCAAGCAATACTCCCACTGCAGCCTCCCGAGTAGCTGGCATGCCACTATGCCCAGCC AluJb
AATTTTTTACTTTTTGTAGAGACAGGGTTTTGCCATGTTGCCTAGGCTGGTCTTGAACTCCTGGGCTCAAGCGATCCTCCTGCCTT
GGCCTCCCAAAGTGCTAGGATTACAGACATGAGCCACCACACCCCAATCA…
IDENTITA’ 85%
REGIONE BKP TEL (Introne 23a gene NF1)
…TCTGCCTTTATTTATTTATTTATTTATTTATTTTGAGACAGTCTCTCTGTCACCCAGATTGGAGTGCAGTGGCACGATGGCTCACT
GCAACCTCCACCTCCTGGGTTTAAGCGATTCTCCTGCCTTAGCCTTCCAAGTAGCTGGGATTACAGGTGTGGCTCCACCATGTCCAG
AluSx
CTAATTTTTGTATTTTTAGTAGAGATGGGGTTTTGCCATGTTGGCCAGGCTGGTTTCGAACTCCTAGCCTCAAGTGATCTGCCCGCC
TCGGCCTCCCAGAGTGCTGGGATTACAGGCATGAGCCACCACGCCCAGCCAGAGAATTGTCTAAGATTAAAATTTGGGAGTTTTAGA
AAACCACTCAGTAGCAATGATGGTCTATGAATATTCTAAAATTATGTGAAGAATTTTGTGTGTGTGAATGCATACATTCATTT
Sequenze Alu
sequenze di circa 400 paia di basi altamente ripetute
nel genoma umano
PAZIENTE 118
Identificazione del frammento di giunzione mediante LR-PCR
delezione mediata da
Alu repeat
RICERCA ELEMENTI RICOMBINOGENICI
•sequenze palindromiche
•elemento χ-like
•siti di taglio per la topoisomerasi
•sequenze minisatelliti
•siti di “switch di classe” per la catena pesante delle immunoglobuline
•siti di pausa della DNA Polimerasi
Cen
F.G.
Tel
elemento χ-like
nei batteri
sequenza associata alla ricombinazione
DELEZIONI STUDIATE
26M
SSH2
Alu + χ-like
element
REP-P1
27M
REP-P2
JJAZ1ψ
17 casi
NF1
Alu + χ-like
element
JJAZ1
1.4 Mb (REP, tipo 1)
5 casi descritti a livello molecolare
1 caso
1.2 Mb (JJAZ-med, tipo 2)
1.5 Mb
1 caso
atipico
1 caso
atipico
3 Mb
REP-M
3 Mb
1.2-1.4 Mb REP
1.5 Mb
CONTENUTO GENICO DELLE DELEZIONI REP E ATIPICHE
SLC6A4:
SLC6A4:solute
solutecarrier
carrierfamily
family66(neurotransmitter
(neurotransmittertransporter,
transporter,serotonin),
serotonin),member
member44
BLMH:
BLMH:bleomycin
bleomycinhydrolase
hydrolase
CPD:
CPD:carboxypeptidase
carboxypeptidaseDD
GOSR1:
GOSR1:golgi
golgiSNAP
SNAPreceptor
receptorcomplex
complexmember
member11
CRLF3:
CRLF3:cytokine
cytokinereceptor-like
receptor-likefactor
factor33
CENTA2:
CENTA2:centaurin,
centaurin,alpha
alpha22
OMG:
OMG:oligodendrocyte
oligodendrocytemyelin
myelinglycoprotein
glycoprotein
EVI2B:
ecotropic
viral
integration
NF1
EVI2B: ecotropic viral integrationsite
site2B
2B
EVI2A:
ecotropic
viral
integration
site
2A
EVI2A: ecotropic viral integration site 2A
RAB11-FIP4:
RAB11-FIP4:rab11-family
rab11-familyinteracting
interactingprotein
protein44(KIAA1821,
(KIAA1821,MGC11316)
MGC11316)
HCA66:
HCA66:hepatocellular
hepatocellularcarcinoma-associated
carcinoma-associatedantigen
antigen66
66
JJAZ1:
JJAZ1:joined
joinedtotoJAZF1
JAZF1
MIRO-1:
MIRO-1:mitochondrial
mitochondrialRho
Rho11(FLJ11040)
(FLJ11040)
RHBDL4:
RHBDL4:rhomboid,
rhomboid,veinlet-like
veinlet-like44(Drosophila)
(Drosophila)
NJMU-R1:
NJMU-R1:protein
proteinkinase
kinaseNjmu-R1
Njmu-R1
ZNF207:
ZNF207:zinc
zincfinger
fingerprotein
protein207
207
PSMD11:
proteasome
(prosome,
PSMD11: proteasome (prosome,macropain)
macropain)26S
26Ssubunit,
subunit,non-ATPase,
non-ATPase,11
11
CDK5R1:
cyclin-dependent
kinase
5,
regulatory
subunit
1
(p35)
CDK5R1: cyclin-dependent kinase 5, regulatory subunit 1 (p35)
MYO1D:
MYO1D:myosin
myosinIDID
ALLP17:
ALLP17:lysozyme-like
lysozyme-likesperm-specific
sperm-specificsecretory
secretoryprotein
proteinALLP17
ALLP17(LOC124912)
(LOC124912)
ACCN1:
amiloride-sensitive
cation
channel
1,
neuronal
(degenerin)
ACCN1: amiloride-sensitive cation channel 1, neuronal (degenerin)
CONCLUSIONI
La caratterizzazione mediante FISH ad alta risoluzione di 20 pz con
Sindrome da microdelezione NF1 ha permesso di:
• distinguere le delezioni in gruppi REP I e II originate da
e atipiche
NAHR
•sequenziare i bkp identificare i meccanismi patogenetici alla base delle
delezioni atipiche:
Pz 6 delezione 3 Mb no omologia in regioni bkp
NHEJ
Topoisomerase II consensus sequences fiancheggiano centr e tel bkps
Pz 118 delezione 1.5 Mb sequenze Alu in regioni bkp
• stabilire l’esatto contenuto genico delle delezioni
χ element
•la FISH è attualmente l’approccio più sensibile per l’identificazione
dei breakpoint delle delezioni
•L’evidenza che delezioni non ricorrenti possano essere mediate da
meccanismi diversi, NAHR, NHEJ, può essere indicativa della
presenza di strutture genomiche complesse prone alla ricombinazione
•l’esatto contenuto genico potrebbe essere comparato fra le delezioni
non-REP e REP per indirizzare studi di correlazione genotipo-fenotipo
STUDIO DI CORRELAZIONE GENOTIPO-FENOTIPO
SINDROME DA MICRODELEZIONE NF1
FENOTIPO COMPLESSO RISPETTO A NF1 CLASSICA
NEL GRUPPO DI PAZIENTI CON MICRODELEZIONE SONO
IDENTIFICABILI SEGNI CLINICI CON UNA INCIDENZA
SIGNIFICATIVAMENTE PIU’ ELEVATA RISPETTO AI PAZIENTI
CON NF1 CLASSICA
DATI CLINICI DI 92 PAZIENTI NF1 DELETI DI CUI 28 VALUTATI DA NOI
E 64 RIPORTATI IN LETTERATURA
(CASI DI MOSAICISMO ESCLUSI)
Età, sesso, altezza
Presenza, numero ed età d’insorgenza dei neurofibromi
Macrocefalia, microcefalia
Anomalie della crescita
Dismorfismi cranio-facciali
Anomalie cardiache
Ritardo mentale
Difficoltà di apprendimento, ritardo del linguaggio
Anomalie del SNC e neurologiche
Tumori (neurofibromi plessiformi o spinali, sarcomi, glioma ottico etc.)
Anomalie scheletriche
Caratteristiche di mani e piedi
Altre caratteristiche
SEGNI CLINICI NON INCLUSI NEI CRITERI CONSENSUS NF1
CONFRONTO STATISTICO fra l’incidenza di alcuni segni clinici non inclusi nei criteri
diagnostici in un campione di 92 pazienti NF1 portatori di delezione con l’incidenza degli
stessi segni relativi alla popolazione NF1 generale
Pazienti NF1 deleti
Segni clinici
Neurofibroma plessiforme
Macrocefalia
Dismorfismi facciali
Ipertelorismo
Ritardo Mentale
Epilessia
Malformazioni cardiovascolari
Sordità
Scoliosi
Pectus excavatum-carinatum
Pazienti NF1
Totale
Valutati
88
63
88
64
63
56
Totale
Affetti
25
20
69
27
36
5
%
28
32
78
42
57
9
%
25-30
40-50
5-15
15
4-8
3.8-6
Discordanza (χ2)
no (0.36-0.13)
no (1.6-6.48)
sì (1065.8-264.6)
sì (48.60)
sì (702-300.1)
no (7.11-1.5)
61
82
60
58
11
2
9
10
18
2
15
17
2.1
5,3
10-30
20
sì (120.39)
no (2.05)
no (2.5-7.5)
no (0.45)
P<0.001
Venturin et al., J Med Genet (2004)
Incidenza maggiore:
RITARDO MENTALE
ANOMALIE
CARDIOVASCOLARI
RITARDO MENTALE
57% pz microdeleti
ANOMALIE CARDIOVASCOLARI
18% pz microdeleti
4-8% pz NF1 classica
2% pz NF1 classica
DISMORFISMI
78% pz microdeleti
5-15% pz NF1 classica
RICERCA
DI GENI CANDIDATI
REP-P
RITARDO MENTALE
Espressi nel Sistema
Nervoso Centrale
Cen
REP-M
OMG e CDK5R1
Ruolo nello sviluppo del
SNC
ACCN1
ALLP17
MYO1D
CDK5R1
PSMD11
ZNF207
NJMU-R1
RHBDL4
MIRO-1
JJAZ1
HCA66
RAB11-FIP4
EVI2A
EVI2B
OMG
CENTA2
CRLF3
GOSR1
CPD
BLMH
SLC6A4
NF1
Tel
ACCN1
ALLP17
MYO1D
CDK5R1
PSMD11
ZNF207
NJMU-R1
RHBDL4
MIRO-1
JJAZ1
HCA66
RAB11-FIP4
EVI2A
EVI2B
OMG
CENTA2
CRLF3
GOSR1
CPD
BLMH
SLC6A4
NF1
Cen
Tel
REP-P
REP-M
ANOMALIE CARDIACHE
(stenosi polmonare, difetti del setto atrio-ventricolare,
difetti valvolari)
Geni implicati nello sviluppo del cuore
?
ARRAY CGH (Comparative Genome Hybridization)
Rileva cambiamenti quantitativi del DNA
ARRAY
Cloni genomici (BAC)
copertura di tutto il GENOMA con una risoluzione di 1 Mb
Ibridazione con DNA normale e DNA da testare marcati con fluorocromi
diversi su array di cloni genomici
ARRAY
SONDA 1
SONDA 2
L’array può contenere anche 50.000 sonde diverse
CGH ARRAY
Analisi dei cloni che
mostrano un dosaggio
maggiore o un dosaggio
minore rispetto al
controllo
La perdita o
l’amplificazione di ogni
clone viene verificata
singolarmente in FISH
VANTAGGI DELLA CGH – ARRAY NELLO STUDIO
DELLE ANOMALIE CROMOSOMICHE
STUDIARE CON UN NUMERO ELEVATO DI SONDE DIVERSE
ANOMALIE CROMOSOMICHE IN UNA SOLA FASE DI IBRIDAZIONE
EVIDENZIARE RIARRANGIAMENTI CROMOSOMICI CHE SI
BASANO SUL GUADAGNO O SULLA PERDITA DI MATERIALE
GENETICO, IN CARIOTIPI APPARENTEMENTE BILANCIATI
ARRAY PER ANALISI REGIONE NF1
L’array copre 2.24 Megabasi della regione 17q11.2 in cui è compreso NF1
Risoluzione media
12 Kilobasi
Risoluzione media nel gene NF1
6.4 Kilobasi
STUDIO SINDROME DA MICRODELEZIONE NF1
RICERCA DI MICRODELEZIONI CON APPROCCI MOLECOLARI
Analisi di segregazione allelica
VANTAGGI: veloce e poco costoso
LIMITI: occorre DNA di entrambi i genitori,
raramente identificano i breakpoint di delezioni
atipiche, non distinguono casi di mosaicismo
CARATTERIZZAZIONE DI MICRODELEZIONI MEDIANTE FISH
VANTAGGI: non occorre il DNA dei
genitori,restringe le regioni dei breakpoint a
poche migliaia di basi, evidenzia casi di
delezioni a mosaico
LIMITI: più laboriosa e costosa
CARATTERIZZAZIONE DI MICRODELEZIONI MEDIANTE ARRAY
VANTAGGI: rapidità di processamento di n°
elevato di campioni per n° elevato di sonde
LIMITI: abbastanza costosa, occorre la FISH
per validare il risultato, casi di mosaicismo non
identificabili