RIVASalerno2007
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LA SINDROME DA MICRODELEZIONE NF1: ANALISI MEDIANTE FISH CONVENZIONALE E AVANZATA Paola Riva Dipartimento di Biologia e Genetica per le Scienze Mediche Università degli Studi di Milano Convegno Neurofibromatosi NF1 Salerno 22 Giugno 2007 NEUROFIBROMATOSI DI TIPO 1 (NF1) Transmissione: autosomico-dominante Incidenza: 1/3500 Penetranza: completa a 8 anni Espressività: variabile NEUROFIBROMA Schwan cells, neuroni, cells perineuronali, fibroblasti MACCHIE CAFFE’ LATTE iperpigmentazione dermica NODULI DI LISCH amartomi dell’iridie OMIM*162200 NEUROFIBROMATOSI DI TIPO 1 NIH CRITERI CONSENSUS Presenza di almeno 2 dei seguenti segni clinici: - 6 o più chiazze café-au-lait - 2 o più neurofibromi - 1 o più neurofibromi plexiformi - Freekling ascellare o inguinale - 2 o più noduli di Lisch - Glioma ottico - Una lesione ossea distinta displasia dello sfenoide displasia o assottigliamento della corticale delle ossa lunghe - Un parente di primo grado affetto da NF1 ESPRESSIVITA’ VARIABILE INTER- E INTRA- FAMILIARE NEUROFIBROMATOSI DI TIPO 1 (NF1) Gene NF1 17q11.2 Struttura del gene of NF1 357 kb, 60 exons, geni OMG, EVI2B, EVI2A incastonati in IVS27b NF1 mRNA Proteina 12 kb, 8 forme di splicing alternativo alcune con espressione tessuto-specifica neurofibromina, 2818 aa, GTPasi Activating Protein (GAP related domain), oncosoppressore SINDROME DA MICRODELEZIONE NF1 segni clinici di NF1 + dismorfismi anomalie scheletriche difficoltà di apprendimento ritardo mentale anomalie cardiovascolari insorgenza precoce di molti neurofibromi aumentato rischio per lo sviluppo di MPNSTs NEUROFIBROMATOSI DI TIPO 1- MUTAZIONI ALTO TASSO DI MUTAZIONE 50% familiari 50% de novo 90 - 95% Mutazioni puntiformi 80% PROTEINA TRONCA 5 - 10% Grosse delezioni (80% REP) SINDROME DA MICRODELEZIONE NF1 80% delle microdelezioni NF1 ha una lunghezza di 1.4 Mb, bkp localizzati in due regioni Duplicate a monte e a valle di NF1: NF1-REPs prossimale e mediale Meccanismi che generano le delezioni SINDROME DA MICRODELEZIONE NF1 APLOINSUFFICIENZA del GENE NF1 e dei GENI CONTIGUI DELEZIONI generate dalla RICOMBINAZIONE OMOLOGA INEGUALE fra SEQUENZE DUPLICATE (NF1-REP, sequenze JJAZ1) che fiancheggiano il gene NF1 NF1 REP-P ψ−JJAZ1 JJAZ1 REP-M 1.4 Mb (Tipo I) 1.2 Mb (Tipo II) delezioni atipiche Fenotipo clinico più grave con segni clinici aggiuntivi oltre a quelli presenti nella Neurofibromatosi di tipo 1 classica LOW-COPY REPEATS FIANCHEGGIANO DELEZIONI/DUPLICAZIONI NELLE SINDROMI DA MICRODELEZIONE/MICRODUPLICAZIONE DELEZIONE REP SIZE (Mb) SIZE (kb) SINDROME DEL/DUP REGIONE Williams-Beuren 7q11.23 Prader-Willi Angelman 15q11-13 4 >500 Smith-Magenis 17p11.2 5 250 Charcot-Marie-Tooth1A17p11.2 HNPP 1.5 24 Neurofibromatosi 1 1.5 85 Velo-Cardio-Facciale DiGeorge 17q11.2 22q11 1.6-2 >320 3.0 or 1.5 >225 RACCOLTA PAZIENTI CON SINDROME DA MICRODELEZIONE NF1 Inviati da Centri Nazionali ed Internazionali Mariano Stabile Centro di Genetica ZIGOTE Federica Natacci ICP Milano Romano Tenconi Unità di Genetica Clinica ed Epidemiologica Dipartimento di Pediatria, Università di Padova Bruce Korf University of Alabama, US Concepcion Hernandez Molecular Gentics Unit, Hospital Ramon y Cajal, Madrid, Spain Meena Upadhyaya Institute of Medical Genetics, University of Wales College of Medicine, Cardiff UK Identificazione dei SEGNI DISTINTIVI della Sindrome da microdelezione NF1 Identificazione DELEZIONE (FISH O SEGREGAZIONE ALLELICA) CARATTERIZZAZIONE CITOGENETICO-MOLECOLARE DELEZIONI ANALISI DI SEGREGAZIONE ALLELICA MICROSATELLITI M M F F F P P P eterozigote emizigote M M F F P P non informativo non informativo delezione DELEZIONE NF1 E REGIONI FIANCHEGGIANTI Pt 93 RsaI RFLP ex 5 1 1 1 -* 1 1 2034, ex 13 1 1 1 -* 1 1 IVS27b (CAn ) 1 2 2 - 1 1 FATHER 12 IVS27b PROBAND 1-? IVS27b MOTHER 1-1 IVS27b FATHER D17S1800 IVS27b (EVI-20) 2 1 1 - 2 2 IVS38 (CA/GTn ) 1 2 2 - 1 1 1 2 D17S1800 PROBAND D17S1800 1-? D17S1800 10647, ex 49 1 1 1 - 1 1 MOTHER D17S1800 1 2 2 - 1 1 1-1 D17S1800 D17S1800 * : inferred by FISH data FISH Verificare la natura delle delezioni: REP di tipo I, di tipo II, atipiche Delezione Tipo I 1 2 3 4 NF1 REP-P ψ−JJAZ1 5 6 JJAZ1 7 REP-M 8 Delezione Tipo II Identificare delezioni atipiche e mappare i breakpoint FISH – Fluorescent In Situ Hybridization DENATURAZIONE DEL DNA Energia richiesta per rompere legami H DNA sonda DNA cromosomico IBRIDAZIONE MOLECOLARE DNA CROMOSOMICO + DNA SONDA Il DNA della sonda denaturato è presente in eccesso sul vetrino. La riassociazione specifica richiede un’incubazione da 3h a più giorni LAVAGGI POST IBRIDAZIONE VIENE ELIMINATA DAL VETRINO LA SONDA IN ECCESSO NON APPAIATA SPECIFICAMENTE IMMUNOFLUORESCENZA SONDA MARCATA CON APTENE (NON FLUORESCENTE) RICONOSCIUTA DA ANTICORPO FLUORESCINATO Permette di visualizzare la sonda sulla specifica regione cromosomica IBRIDAZIONE MOLECOLARE Target DNA Probe DNA denaturazione riassociazione Target DNA homoduplex Target-ProbeDNA heteroduplex Probe DNA homoduplex FISH DENATURAZIONE VISUALIZZAZIONE AL MICROSCOPIO A FLUORESCENZA IBRIDAZIONE IMMUNOFLUORESCENZA FISH 2-3 Mb Cromosomi Metafasici i n c r e m e n t o r i s o l u z i o n e 200 Kb 1Mb Nuclei Interfasici Cromosomi Stirati 1 Kb Fibre di DNA STUDIO MEDIANTE FISH AD ALTA RISOLUZIONE DI MICRODELEZIONI NF1 IN 20 PAZIENTI •Identificare delezioni non ricorrenti e mappare i breakpoint •Caratterizzare regioni genomiche prone alla ricombinazione oltre ai già descritti REPs •Identificare il/i meccanismi molecolari che causano le delezioni •Identificare il contenuto genico delle delezioni MULTISTEP FISH ANALISI •17q11.2 PACs/BACs su cromosomi metafasici lunghezza delle delezioni per stabilire la •17q11.2 PACs/BACs su cromosomi stretched e fibre di DNA per valutare la distanza tra i cloni che comprendono le regioni dei breakpoint •Produzione di piccole sonde specifiche per la regione dei bkp restringere l’intervallo genomico che comprende i breakpoint per Isolamento breakpoint mediante PCR e loro sequenziamento CARATTERIZZAZIONE DEI PAZIENTI NF1 MICRODELETI MEDIANTE FISH CON CLONI 17q11.2-SPECIFICI Table 3. 17q11.2 PAC and BAC clones used for refined FISH characterization of microdeleted NF1 patients 144O22 952K8 474K4 640N20 904A12 805L22 772K16 41C23 1080 23O13 977D19 932D9 525H19 753N3 778K9 271K11 268F2 252O24 403E9 88B16 104I20 68I3 Patient 82O19 Clones 7 65 72 75 76 77 78 82 85 93 94 DELEZIONI REP tipo I 116 119 124 125 126 128 103 118 6 DELEZIONE REP tipo II GROSSA DELEZIONE signals on both chromosomes 17, absence of signal on one chromosome 17, NF1 GENE TEL BKP diminished signal on one chromosome 17 cen NF 1 REP-P 271K11 640N20 778K9 904A12 474K4 4.3- Kb b 271K11 474K4 c 128 7 124 125 76 75 72 65 CN C+ d C- a M Delezioni 1.4 Mb REP tipo I tel REP-M cen tel NF 1 REP-P 778K9 REP-M 932D9 805L22 753N3 640N20 904A12 Delezione 1.2 Mb REP tipo II Pt 103 * a 1 778K9 640N20 2 271K11 474K4 b c cen Delezione atipica 3 Mb REP-P 403E9 NF 1 tel REP-M 205P19 268F2 31I22 1J8 252O24 Pt 6 a 252O24 1J8 b c cen NF 1 REP-P 82O19 104I20 Delezione atipica 1.5 Mb 932D9 23O13 977D19 Pt 118 a 82O19 23O13 b tel 252o24 Top down FISH definizione dei bkp da > 100 kb 30M 29M REP-P 28M 31M 32M REP-M 753N3 1J8 904A12 NF1 region chr17 tel cen 753N3 (153 Kb) 904A12 37Kb (139 Kb) 37Kb 904f 904b 904c 904d 753a 753b 753c 753d 28M 904a 29M 904b 904c 904d 30M REP-P 904e 904f 31M pt103 32M REP-M NF1 region chr17 a 5-10 kb cen tel 252O24 (171Kb) 1J8 (105 Kb) 5Kb 252a 252b 252c 5Kb 252d 25M 252e 26M SSH2 252f REP-P1 1a 1b 1c 1d 1e pt 6 27M REP-P2 α Cen2 1f NF1 cen tel 68I3 (173Kb) 23O13 (298Kb) 7Kb 68a 68b 68c 68d 8Kb 68e α Cen2 23a 23b 23c 23d 23e 23f 23g 23h 23i 23l 23m 23n 23o pt118 Paziente 103 i bkp della delezione 1.2 Mb mappano in piccoli blocchi REP sequenze di 37 Kb con il 97.6% di omologia, dove sono compresi rispettivamente il gene JJAZ1 e il suo psuedogene delezione mediata da NAHR Non Allelic Homologous Recombination una delezione analoga descritta in un pz a mosaico (Peteck et al., 2003) SEQUENZA DEL FRAMMENTO DI GIUNZIONE – PZ 6 Junction Fragment AATTTGAGTTAGGAGTGATTGTAGGGATCCATTTTCTTATCTAGTCCTAATTTCTCTTCTCTGT GTGTTTTTTACTTCTGTTAGTTATGAAGCTGTGAACTCAAAAGTCCAGTTGCTACACACATTGT TGCCCAGGAGAATTCATGGAAATACTCTTCCCTAAAAGCCAAGCAGGATTGTTTCCTATATTTG GTTCTAAGAAAGGATTCTTGCTCAAAAAAGAATGGGGGAAAGCTGCCCAGATAGCTACTTGGTG CACTTTCCTCTCTGTACATAGCCTGCGTGGATGTGGGTCAAGGGCCCCCGTGCAGCCCTGCCCT CTAAGCCACAGAGGTTTCCAGCCACAGGCAGCTGAAATCTCTCCAGAACCTTGGTTCTTTTTAT GTCAGGGCTATAGTCAGTCAAGTTTTCCAAATGAGC Centromeric Region - 252O24 Telomeric Region - 1J8 AATTTGAGTTAGGAGTGATTGTAGGGATCC ATTTTCTTATCTAGTCCTAATTTCTCTTCT CTGTGTGTTTTTTACTTCTGTTAGTTATGA AGCTGTGAACTCAAAAGTCCAGTTGCTACA CACATTGTTGCCCAGGAGAATTCATGGAAA TACTCTTCCCTAAAAGCCAAGCAGGATTGT TTCCTATATTTGGTTCTAAGAAAGGATTCT TGCTCAAAAAACAGTGTCCTGTATGGAATG GGCATGATTTCCCTGAAAGGATGGACTAGG ATTCTTAGTGGAAAAATCCTTGGATGGGGA TGATTCTCCAAAGAAAATCCTGGCCCTAAT CATAACCGTTATTATCATTTATTGTCACCA GAAATATTCACTGAGCATCTGGTGTGAGTT TTGCACTGTGCTGGGTATTACTTAAAAAGA TTAAAACAGTTGGCCCTGAGTAATTGAAGT CCTGCACAATCCAGAGTGAGGATTCTGGGG ATTGTGGACCTATGACATGGGCTGGCTTCT AACATTGGCACTGGTGAGCTGGGGGGACAC ATCTCTACCATCTGTGATCCATGTACACAT GTGACAGTGAACTACTCCCAGCCTCTTTGC CTCTGTTCTCAGCTCTTTCAGAAGAGGGTG GTTGCTTTGTGGAATGGGGGAAAGCTGCCC AGATAGCTACTTGGTGCACTTTCCTCTCTG TACATAGCCTGCGTGGATGTGGGTCAAGGG CCCCCGTGCAGCCCTGCCCTCTAAGCCACA GAGGTTTCCAGCCACAGGCAGCTGAAATCT CTCCAGAACCTTGGTTCTTTTTATGTCAGG GCTATAGTCAGTCAAGTTTTCCAAATGAGC RICERCA ELEMENTI RICOMBINOGENICI •sequenze palindromiche •elemento χ-like •siti di taglio per la topoisomerasi •sequenze minisatelliti •siti di “switch” per la catena pesante delle immunoglobuline •siti di pausa della DNA Polimerasi Junction Fragment AATTTGAGTTAGGAGTGATTGTAGGGATCCATTTTCTTATCTAGTCCTAATTTCTCTTCTCTGTGTGTTTTTTA CTTCTGTTAGTTATGAAGCTGTGAACTCAAAAGTCCAGTTGCTACACACATTGTTGCCCAGGAGAATTCATGGA AATACTCTTCCCTAAAAGCCAAGCAGGATTGTTTCCTATATTTGGTTCTAAGAAAGGATTCTTGCTCAAAAAAG AATGGGGGAAAGCTGCCCAGATAGCTACTTGGTGCACTTTCCTCTCTGTACATAGCCTGCGTGGATGTGGGTCA AGGGCCCCCGTGCAGCCCTGCCCTCTAAGCCACAGAGGTTTCCAGCCACAGGCAGCTGAAATCTCTCCAGAACC TTGGTTCTTTTTATGTCAGGGCTATAGTCAGTCAAGTTTTCCAAATGAGC Immunoglobulin Heavy chain class switch repeat Topoisomerase II pattern Paziente 6 Identificazione del frammento di giunzione mediante LR-PCR No omologia di sequenza (LCR) tra le regioni dei bkp prox e dist delezione mediata da NHEJ Non Homologous End Joining Sequence ricombinogeniche fiancheggiano bkp telomerico cen bkp: - 10 Kb dal promotore di BLMH - BLMH trascritto in testicoli favorisce la ricombinazione - vicino bkp centr descritto in pz microdeleto (Jenne, 2000) tel bkp: - in IVS1 del gene ACCN1 - vicino bkp t(1;17) associata a neuroblastoma (Van Roy, 2002) - vicino a bkps telomerico di due grosse delezioni (Dorschner, 2000) SEQUENZA DEL FRAMMENTO DI GIUNZIONE – PZ 118 REGIONE BKP CEN (Introne 4 gene SSH2) ACCAAAACACACAAATGTTGAAAGCTATCAGCAAATATTTATTGGGCATCCAGTATGTGCAAGTGACTGTTGTTATGGGTTTTCAA AGAGGTGTACTCCAAGTGTGATTCCTGGATCAGCAGCATCAGCAGTGTTTCGAAACTGGCTTAAAAATACAAATTATCTCTGCTTC CCCTTTACTAATCGAACTCTGCATGTGGAGTCCACCAATTGGTGATTTAACAAAGCTCTCCATGTGATTCTGATATACTTTAAAGT TGGAGAATCATTGCTTCAGATGATGATGATGATTATTATTAGAGGGTCTTGCACTGTTGCCCAGGTTGAGGGCAGTGGCGTGATCA TGGCTCACTGCAGCCTTGACCTGCCAGGCTCAAGCAATACTCCCACTGCAGCCTCCCGAGTAGCTGGCATGCCACTATGCCCAGCC AluJb AATTTTTTACTTTTTGTAGAGACAGGGTTTTGCCATGTTGCCTAGGCTGGTCTTGAACTCCTGGGCTCAAGCGATCCTCCTGCCTT GGCCTCCCAAAGTGCTAGGATTACAGACATGAGCCACCACACCCCAATCA… IDENTITA’ 85% REGIONE BKP TEL (Introne 23a gene NF1) …TCTGCCTTTATTTATTTATTTATTTATTTATTTTGAGACAGTCTCTCTGTCACCCAGATTGGAGTGCAGTGGCACGATGGCTCACT GCAACCTCCACCTCCTGGGTTTAAGCGATTCTCCTGCCTTAGCCTTCCAAGTAGCTGGGATTACAGGTGTGGCTCCACCATGTCCAG AluSx CTAATTTTTGTATTTTTAGTAGAGATGGGGTTTTGCCATGTTGGCCAGGCTGGTTTCGAACTCCTAGCCTCAAGTGATCTGCCCGCC TCGGCCTCCCAGAGTGCTGGGATTACAGGCATGAGCCACCACGCCCAGCCAGAGAATTGTCTAAGATTAAAATTTGGGAGTTTTAGA AAACCACTCAGTAGCAATGATGGTCTATGAATATTCTAAAATTATGTGAAGAATTTTGTGTGTGTGAATGCATACATTCATTT Sequenze Alu sequenze di circa 400 paia di basi altamente ripetute nel genoma umano PAZIENTE 118 Identificazione del frammento di giunzione mediante LR-PCR delezione mediata da Alu repeat RICERCA ELEMENTI RICOMBINOGENICI •sequenze palindromiche •elemento χ-like •siti di taglio per la topoisomerasi •sequenze minisatelliti •siti di “switch di classe” per la catena pesante delle immunoglobuline •siti di pausa della DNA Polimerasi Cen F.G. Tel elemento χ-like nei batteri sequenza associata alla ricombinazione DELEZIONI STUDIATE 26M SSH2 Alu + χ-like element REP-P1 27M REP-P2 JJAZ1ψ 17 casi NF1 Alu + χ-like element JJAZ1 1.4 Mb (REP, tipo 1) 5 casi descritti a livello molecolare 1 caso 1.2 Mb (JJAZ-med, tipo 2) 1.5 Mb 1 caso atipico 1 caso atipico 3 Mb REP-M 3 Mb 1.2-1.4 Mb REP 1.5 Mb CONTENUTO GENICO DELLE DELEZIONI REP E ATIPICHE SLC6A4: SLC6A4:solute solutecarrier carrierfamily family66(neurotransmitter (neurotransmittertransporter, transporter,serotonin), serotonin),member member44 BLMH: BLMH:bleomycin bleomycinhydrolase hydrolase CPD: CPD:carboxypeptidase carboxypeptidaseDD GOSR1: GOSR1:golgi golgiSNAP SNAPreceptor receptorcomplex complexmember member11 CRLF3: CRLF3:cytokine cytokinereceptor-like receptor-likefactor factor33 CENTA2: CENTA2:centaurin, centaurin,alpha alpha22 OMG: OMG:oligodendrocyte oligodendrocytemyelin myelinglycoprotein glycoprotein EVI2B: ecotropic viral integration NF1 EVI2B: ecotropic viral integrationsite site2B 2B EVI2A: ecotropic viral integration site 2A EVI2A: ecotropic viral integration site 2A RAB11-FIP4: RAB11-FIP4:rab11-family rab11-familyinteracting interactingprotein protein44(KIAA1821, (KIAA1821,MGC11316) MGC11316) HCA66: HCA66:hepatocellular hepatocellularcarcinoma-associated carcinoma-associatedantigen antigen66 66 JJAZ1: JJAZ1:joined joinedtotoJAZF1 JAZF1 MIRO-1: MIRO-1:mitochondrial mitochondrialRho Rho11(FLJ11040) (FLJ11040) RHBDL4: RHBDL4:rhomboid, rhomboid,veinlet-like veinlet-like44(Drosophila) (Drosophila) NJMU-R1: NJMU-R1:protein proteinkinase kinaseNjmu-R1 Njmu-R1 ZNF207: ZNF207:zinc zincfinger fingerprotein protein207 207 PSMD11: proteasome (prosome, PSMD11: proteasome (prosome,macropain) macropain)26S 26Ssubunit, subunit,non-ATPase, non-ATPase,11 11 CDK5R1: cyclin-dependent kinase 5, regulatory subunit 1 (p35) CDK5R1: cyclin-dependent kinase 5, regulatory subunit 1 (p35) MYO1D: MYO1D:myosin myosinIDID ALLP17: ALLP17:lysozyme-like lysozyme-likesperm-specific sperm-specificsecretory secretoryprotein proteinALLP17 ALLP17(LOC124912) (LOC124912) ACCN1: amiloride-sensitive cation channel 1, neuronal (degenerin) ACCN1: amiloride-sensitive cation channel 1, neuronal (degenerin) CONCLUSIONI La caratterizzazione mediante FISH ad alta risoluzione di 20 pz con Sindrome da microdelezione NF1 ha permesso di: • distinguere le delezioni in gruppi REP I e II originate da e atipiche NAHR •sequenziare i bkp identificare i meccanismi patogenetici alla base delle delezioni atipiche: Pz 6 delezione 3 Mb no omologia in regioni bkp NHEJ Topoisomerase II consensus sequences fiancheggiano centr e tel bkps Pz 118 delezione 1.5 Mb sequenze Alu in regioni bkp • stabilire l’esatto contenuto genico delle delezioni χ element •la FISH è attualmente l’approccio più sensibile per l’identificazione dei breakpoint delle delezioni •L’evidenza che delezioni non ricorrenti possano essere mediate da meccanismi diversi, NAHR, NHEJ, può essere indicativa della presenza di strutture genomiche complesse prone alla ricombinazione •l’esatto contenuto genico potrebbe essere comparato fra le delezioni non-REP e REP per indirizzare studi di correlazione genotipo-fenotipo STUDIO DI CORRELAZIONE GENOTIPO-FENOTIPO SINDROME DA MICRODELEZIONE NF1 FENOTIPO COMPLESSO RISPETTO A NF1 CLASSICA NEL GRUPPO DI PAZIENTI CON MICRODELEZIONE SONO IDENTIFICABILI SEGNI CLINICI CON UNA INCIDENZA SIGNIFICATIVAMENTE PIU’ ELEVATA RISPETTO AI PAZIENTI CON NF1 CLASSICA DATI CLINICI DI 92 PAZIENTI NF1 DELETI DI CUI 28 VALUTATI DA NOI E 64 RIPORTATI IN LETTERATURA (CASI DI MOSAICISMO ESCLUSI) Età, sesso, altezza Presenza, numero ed età d’insorgenza dei neurofibromi Macrocefalia, microcefalia Anomalie della crescita Dismorfismi cranio-facciali Anomalie cardiache Ritardo mentale Difficoltà di apprendimento, ritardo del linguaggio Anomalie del SNC e neurologiche Tumori (neurofibromi plessiformi o spinali, sarcomi, glioma ottico etc.) Anomalie scheletriche Caratteristiche di mani e piedi Altre caratteristiche SEGNI CLINICI NON INCLUSI NEI CRITERI CONSENSUS NF1 CONFRONTO STATISTICO fra l’incidenza di alcuni segni clinici non inclusi nei criteri diagnostici in un campione di 92 pazienti NF1 portatori di delezione con l’incidenza degli stessi segni relativi alla popolazione NF1 generale Pazienti NF1 deleti Segni clinici Neurofibroma plessiforme Macrocefalia Dismorfismi facciali Ipertelorismo Ritardo Mentale Epilessia Malformazioni cardiovascolari Sordità Scoliosi Pectus excavatum-carinatum Pazienti NF1 Totale Valutati 88 63 88 64 63 56 Totale Affetti 25 20 69 27 36 5 % 28 32 78 42 57 9 % 25-30 40-50 5-15 15 4-8 3.8-6 Discordanza (χ2) no (0.36-0.13) no (1.6-6.48) sì (1065.8-264.6) sì (48.60) sì (702-300.1) no (7.11-1.5) 61 82 60 58 11 2 9 10 18 2 15 17 2.1 5,3 10-30 20 sì (120.39) no (2.05) no (2.5-7.5) no (0.45) P<0.001 Venturin et al., J Med Genet (2004) Incidenza maggiore: RITARDO MENTALE ANOMALIE CARDIOVASCOLARI RITARDO MENTALE 57% pz microdeleti ANOMALIE CARDIOVASCOLARI 18% pz microdeleti 4-8% pz NF1 classica 2% pz NF1 classica DISMORFISMI 78% pz microdeleti 5-15% pz NF1 classica RICERCA DI GENI CANDIDATI REP-P RITARDO MENTALE Espressi nel Sistema Nervoso Centrale Cen REP-M OMG e CDK5R1 Ruolo nello sviluppo del SNC ACCN1 ALLP17 MYO1D CDK5R1 PSMD11 ZNF207 NJMU-R1 RHBDL4 MIRO-1 JJAZ1 HCA66 RAB11-FIP4 EVI2A EVI2B OMG CENTA2 CRLF3 GOSR1 CPD BLMH SLC6A4 NF1 Tel ACCN1 ALLP17 MYO1D CDK5R1 PSMD11 ZNF207 NJMU-R1 RHBDL4 MIRO-1 JJAZ1 HCA66 RAB11-FIP4 EVI2A EVI2B OMG CENTA2 CRLF3 GOSR1 CPD BLMH SLC6A4 NF1 Cen Tel REP-P REP-M ANOMALIE CARDIACHE (stenosi polmonare, difetti del setto atrio-ventricolare, difetti valvolari) Geni implicati nello sviluppo del cuore ? ARRAY CGH (Comparative Genome Hybridization) Rileva cambiamenti quantitativi del DNA ARRAY Cloni genomici (BAC) copertura di tutto il GENOMA con una risoluzione di 1 Mb Ibridazione con DNA normale e DNA da testare marcati con fluorocromi diversi su array di cloni genomici ARRAY SONDA 1 SONDA 2 L’array può contenere anche 50.000 sonde diverse CGH ARRAY Analisi dei cloni che mostrano un dosaggio maggiore o un dosaggio minore rispetto al controllo La perdita o l’amplificazione di ogni clone viene verificata singolarmente in FISH VANTAGGI DELLA CGH – ARRAY NELLO STUDIO DELLE ANOMALIE CROMOSOMICHE STUDIARE CON UN NUMERO ELEVATO DI SONDE DIVERSE ANOMALIE CROMOSOMICHE IN UNA SOLA FASE DI IBRIDAZIONE EVIDENZIARE RIARRANGIAMENTI CROMOSOMICI CHE SI BASANO SUL GUADAGNO O SULLA PERDITA DI MATERIALE GENETICO, IN CARIOTIPI APPARENTEMENTE BILANCIATI ARRAY PER ANALISI REGIONE NF1 L’array copre 2.24 Megabasi della regione 17q11.2 in cui è compreso NF1 Risoluzione media 12 Kilobasi Risoluzione media nel gene NF1 6.4 Kilobasi STUDIO SINDROME DA MICRODELEZIONE NF1 RICERCA DI MICRODELEZIONI CON APPROCCI MOLECOLARI Analisi di segregazione allelica VANTAGGI: veloce e poco costoso LIMITI: occorre DNA di entrambi i genitori, raramente identificano i breakpoint di delezioni atipiche, non distinguono casi di mosaicismo CARATTERIZZAZIONE DI MICRODELEZIONI MEDIANTE FISH VANTAGGI: non occorre il DNA dei genitori,restringe le regioni dei breakpoint a poche migliaia di basi, evidenzia casi di delezioni a mosaico LIMITI: più laboriosa e costosa CARATTERIZZAZIONE DI MICRODELEZIONI MEDIANTE ARRAY VANTAGGI: rapidità di processamento di n° elevato di campioni per n° elevato di sonde LIMITI: abbastanza costosa, occorre la FISH per validare il risultato, casi di mosaicismo non identificabili
