Diapositiva 1 - Istituto Superiore di Sanità

METODI DI ANALISI PER LA
DETERMINAZIONE DELLE
AFLATOSSINE
NEGLI ALIMENTI
Elena Pannunzi
Istituto Superiore di Sanità
Centro Nazionale per la Qualità degli Alimenti e per i Rischi
Alimentari
Reparto OGM e Xenobiotici di Origine Fungina
AFLATOSSINE
 NUCLEO BIS-FURANO CUMARINICO
 SERIE B: ANELLO PENTENONICO
 SERIE G: ANELLO LATTONICO A SEI TERMINI
 AFM1: METABOLITA OSSIDRILATO DELLA AFB1
SCALA DI TOSSICITÁ: AFB1 >AFM1≥ AFG1>AFB2 >AFG2
ALIMENTI SUSCETTIBILI DI
CONTAMINAZIONE DA AFLATOSSINE
ARACHIDI, PISTACCHI, FRUTTA SECCA
SPEZIE
CEREALI
MANGIMI
ALIMENTI PER L’ INFANZIA
LATTE E FORMAGGI
Metodi ufficiali AOAC e CEN
Micotossina
Matrice
Riferimento
Metodo
Aflatossine
(AFB1 e AFtot)
Cereali, frutta a
guscio e
prodotti
derivati
AOAC - 991.31
CEN–EN
12955:1999
IAC-HPLC con
derivatizzazione post
colonna e rivelazione
fluorimetrica
Mais
AOAC-993.16
ELISA
AOAC–2003.02
IAC-HPLC con
derivatizzazione post
colonna e rivelazione
fluorimetrica
Aflatossine
(AFB1, AFB2, AFG1,
AFG2)
Aflatossina B1
Aflatossina B1
Mangimi
Baby foods
CEN–EN ISO
17375:2006
AOAC–2000.16
IAC-HPLC con
derivatizzazione post
colonna e rivelazione
fluorimetrica
Metodi ufficiali AOAC e CEN
Micotossina
Matrice
Riferimento
Metodo
Aflatossine
(AFB1, AFB2,
AFG1, AFG2)
Burro di arachidi,
pasta di pistacchio,
pasta di fichi,
paprika
AOAC-999.07
IAC-HPLC con
derivatizzazione post
colonna e rivelazione
fluorimetrica
CEN–EN
14123:2003
HPLC con
derivatizzazione
fotochimica post
colonna
Aflatossine
Nocciole e prodotti
AOAC–2005.08
derivati
Aflatossine
Mandorle, arachidi,
pistacchi, nocciole
brasiliane
AOAC-994.08
Mycosep-HPLC
Aflatossine
Burro di arachidi
AOAC-991.45
ELISA
Aflatossine
Arachidi e mais
AOAC-993.17
TLC
Metodi ufficiali AOAC e CEN
Micotossina
Matrice
Riferimento
AOAC–
2000.08
Metodo
IAC-HPLC con
rivelazione
fluorimetrica
Aflatossina M1
Latte e latte
in polvere
Aflatossina M1
Latte e latte
in polvere
CEN–EN ISO
14675:2003
ELISA
Aflatossina M1
Latte e
formaggio
AOAC-980.21
TLC
CEN–EN ISO
14501:1999
VANTAGGI
SVANTAGGI
HPLC
•Eccellenti performance
•Bassi livelli di rivelabilità
•Sicurezza per l’operatore
•Costoso
•Richiede addestramento
dell’operatore
•Tempi di analisi
ELISA
•Risultati rapidi
•Alto numero di campioni
•Non richiede attrezzature costose
•Semplice da utilizzare dopo un breve
training dell’operatore
•Fase di automatizzazione
•Permette determinazioni precise (per livelli
superiori a 2ng/g)
•Costi limitati
•Possibilità di falsi positivi
•Reazioni collaterali
•Interferenza della matrice
•Precisione meno attendibile
rispetto ai metodi di
laboratorio jn HPLC
•Universale
•Altamente sensibile e selettiva
•Possibilità di determinare diverse
micotossine contemporaneamente
•Possibilità di ridurre ed eliminare la fase di
clean-up
•Costi elevati
•Richiede addestramento
dell’operatore
•Elevati costi di manutenzione
TLC
MS
•Uso di solventi considerati
pericolosi per l’ambiente
SAGGI ELISA IMMUNO-ENZIMATICI
 Preparazione del campione
 Saggio immunoenzimatico con kit
 Lettura al colorimetro
SAGGIO DIRETTO
ANTICORPO
SAGGIO COMPETITIVO
ENZIMA CONIUGATO
TOSSINA
ALLA TOSSINA
TOSSINA
ANTICORPO-ENZIMA
ANTICORPO
CONCENTRAZIONE TOSSINA
INTENSITÁ COLORAZIONE
INTENSITÁ COLORAZIONE
SUBSTRATO
CROMOFORO
SUBSTRATO
CROMOFORO
CONCENTRAZIONE TOSSINA
KIT ELISA QUANTITATIVI IN COMMERCIO
FORNITORE
Test Kit
Range di
quantificazione
Limite di
rivelabilità
Tempo di
incubazione
Aflatossine
Totali
1-20ppb
1ppb
20min
4-40ppb
3ppb
20min
Aflatossina
M1
5-100ppt
5ppt
130min
Aflatossine
Totali
1-20ppb
1ppb
15-20min
Aflatossina
M1
5-100ppt
5ppt
120min
Aflatossine
Totali
5-40,5ppb
5ppb
60min
1,7-45ppb
1,7ppb
15min
Aflatossina
M1
5-80ppt
5ppt (latte)
50ppt (form.)
60min
250-2000ppt
<3670ppt
15min
KIT ELISA QUANTITATIVI IN COMMERCIO
FORNITORE
Test Kit
Aflatossine
Totali
Range di
quantificazione
Limite di
rivelabilità
Tempo di
incubazione
2-80ppb (cereali)
2ppb
15min
3-100ppb (cereali)
3ppb
40min
1-16ppb (paprica)
1ppb
50min
-
(qualitativo)
5ppb
3min
-
<20ppb o
>20ppb
20min
(qualitativo
Charm
Toxi-Test
Transia
Diagnostix
Tepne
Neogen
Diffchamb
Strategic Diagnostics Inc
International Diagnostic
Systems
Elisa-Tek
Vicam
Idexx
DETERMINAZIONE SIMULTANEA LC-ESI-MS/MS DI 39
MICOTOSSINE IN CEREALI SENZA CLEAN-UP
API 4000 Q trap
LC-MS/MS
M. Sulyok, F. Berthiller, R. Schuhmacher, R. Krska Rapid Commun. Mass Spectrom.
2006; 20: 2649–2659
IN GENERALE
GLI STEPS TIPICI PER L’ANALISI DELLE AFLATOSSINE
SONO:
 ESTRAZIONE
 CLEAN-UP
 RIVELAZIONE
 METODO PER LA DETERMINAZIONE DI AFB1 E
TOTALI IN MAIS E MANGIMI
METODO INTERNO VALIDATO
ESTRAZIONE:
Pesare 50.0g di campione in blender + 5.0g di NaCl
 Estrarre con 250ml MeOH:H2O 80:20 (v:v)
 Filtrare su filtro di carta
 Prelevare 20ml di filtrato
 Diluire con 20ml di PBS*
Filtrare su filtro a microfibra di vetro
*Phosphate Buffered Saline pH=7.4
0.20g di cloruro di potassio
0.20g di di-idrogenofosfato di potassio
1.16g di idrogeno fosfato disodico anidro
8.00g di cloruro di sodio in 900 mL di
acqua bidistillata
Portare a pH 7.4 con HCl (0,1 mol/L) o con NaOH (0,1 mol/L). Portare ad un litro con
acqua bibistillata.
CLEAN-UP:
Colonnine di immuno-affinità (IAC)
INTERAZIONE
ANTIGENE-ANTICORPO
L’estratto viene fatto passare attraverso la
colonnina. La micotossina si lega al sito
specifico dell’anticorpo. Il materiale
estraneo viene eliminato tramite lavaggio
con acqua. Il legame aflatossina-anticorpo
è rimosso mediante eluizione con
opportuno solvente.
Condizionare la colonnina di
immunoaffinità con 5.0ml di PBS
 Passare in IAC 20ml di campione
 Lavare la IAC con 10ml di H2O
 Eluire con 1000 l + 1000 l di MeOH per
HPLC
 Portare a volume in matraccio da 5ml con
H2O bidistillata
CLEAN-UP
COLONNINE DI
IMMUNO AFFINITÀ
(IAC)
ESTRAZIONE IN FASE
SOLIDA (SPE)
VANTAGGI
SVANTAGGI
Alta selettività
accuratezza e
sensibilità (anticorpi
specifici)
Costi elevati
Monouso
Rapido
Possibilità di analisi
multimicotossina
Minore selettività
RIVELAZIONE:
HPLC/FLUORIMETRICA
Le aflatossine B1 e G1 non hanno gruppi che diano elevata fluorescenza
naturale alla molecola. È necessaria la formazione di un derivato stabile
PBPB
POST/COLONNA
Derivatizzatore
elettrochimico
Soluzione sovrasatura
di iodio cristallino
UV
PRE/COLONNA
Acido Trifluoro Acetico
(TFA)
Brominazione
del doppio
legame
Iodurazione
del doppio legame
Derivatizzazione
fotochimica
Idratazione del doppio
legame furanico
RIVELAZIONE:
HPLC/FLUORIMETRICA
Corsa cromatografica
senza agente
derivatizzante
Corsa
cromatografica
con agente
derivatizzante
PBPB
(pyridine hydrobromide
perbromide)
:
Una soluzione di PBPB 50mg/L è
pompata a 0.4ml/min da una pompa
esterna nella valvola a T
Si fa passare nel derivatizzatore la fase mobile
contenente bromuro di potassio (precursore
DERIVATIZZATORE dell’agente derivatizzante). Si genera bromo
:
ELETTROCHIMICO ELETTROCHIMICAMENTE
applicando
un
potenziale costante agli elettrodi di lavoro
I2:
Una soluzione satura di I2 è pompata a 0,7ml/min in tubo di
Teflon a 60°C
UV:
TFA:
Si irradia il campione mediante lampada UV a 254nm
Formazione dell’emiacetale per addizione di acqua al doppio
legame furanico
SISTEMI DI DERIVATIZZAZIONE
PBPB/I2
TFA
COLONNA
CROMATOGRAFICA
POMPA
ANALITICA
VALVOLA
AT
T
POMPA
DERIVATIZZANTE
VALVOLA DI
INIEZIONE
FASE MOBILE/
F.M. + KBr
UV/DERIV.
ELETTROCH.
RIVELATORE
VANTAGGI
PBPB
DERIVATIZZATORE
ELETTROCHIMICO
I2
UV
TFA
•Attendibilità e ripetibilità
•T ambiente
•Brevi tempi di analisi
•Non è necessaria una seconda pompa
•Assenza di agenti derivatizzanti
•Attendibilità e ripetibilità
•Automatizzazione
•Non necessita di preparazione di
soluzioni
•Non è necessaria una seconda pompa
•Richiede una sola pompa per HPLC
SVANTAGGI
•Richiede seconda
pompa
•Manutenzione e
pulizia delle linee
•Preparazione della
soluzione
•Costo per uno
strumento dedicato
•Manutenzione
•Richiede seconda
pompa e bagno
termostatico
•Manutenzione
•Preparazione della
soluzione di fresco
•Aumento dei tempi di
ritenzione
•Leggera perdita in
sensibilità
•Pericolosità dell’acido
trifluoroacetico
•Scarsa ripetibilità
 METODO PER LA DETERMINAZIONE DI AFB1, G1, B2, G2
IN BURRO DI ARACHIDI, PASTA DI PISTACCHIO, PASTA
DI FICHI, PAPRIKA (CEN–EN 14123:2003)
 Pesare 50.0g di campione in blender o in beuta da 500ml + 5.0g di NaCl
 Estrarre con 200/300ml MeOH:H2O 80:20 (v:v) + 100ml n-esano in
blender per 3 min o con agitatore a braccia per 30 min (paprika)
 Filtrare su filtro di carta
 Prelevare 15ml di filtrato
 Diluire con 90ml di PBS (Phosphate Buffered Saline pH=7.4)
 Filtrare su filtro a microfibra
 Condizionare la colonnina di immunoaffinità (I.A.C.) con 5.0ml di PBS
 Passare in IAC 70ml di campione
 Lavare la IAC con 15ml di H2O
 Eluire con 500 l + 750 l di MeOH per HPLC
 Portare a volume in matraccio da 5ml con H2O bidistillata
 CONDIZIONI CROMATOGRAFICHE
 Fase mobile AcCN : MeOH : H2O 17 : 29 : 54
 Flusso: 1 ml/min
 Derivatizzazione post colonna con PBPB
 Flusso pompa derivatizzante 0.4 ml/min
 Vinj= 150 l
 Colonna C18 250x4.6 mm 5
 La colonna termostatata a 40°C  1°C
em = 435nm
 Spettrofluorimetro: ecc = 365nm
Cromatogramma mais
AFB1≈ 20µg/Kg
Cromatogramma pistacchi
AFB1≈ 2µg/Kg
PARAMETRI DEI METODI
Campo di applicazione
0,10 - 20 µg/Kg
Calibrazione e linearità
0,10 - 6,60 µg/Kg MAIS
0,10 - 4,80 µg/Kg PISTACCHI
Limite di rivelabilità
0,03 µg/Kg
Limite di quantificazione
0,10 µg/Kg
Incertezza espansa
0,76 µg/Kg
(AFB1 liv. 1,58 µg/Kg)
Recupero (n=10)
Livello di
contaminazione
g/Kg
RSD(r)%
Recupero %
1
40
50-120
1-10
20
70-110
> 10
15
80-120
PISTACCHI
AFB1 88%
AFB2 93%
AFG1 92%
AFG2 93%
MAIS
AFB1 87%
AFB2 91%
AFG1 90%
AFG2 70%
Criteri di rendimento per le
aflatossine
(REG. (CE) N. 401/2006)
FATTORE DI RECUPERO
BIANCO
SPIKE
PROCEDURA
ANALITICA
Contaminazione
spike
Contaminazione
bianco
Livello di contaminazione
X 100
 METODO PER LA DETERMINAZIONE DI AFM1 IN
LATTE E LATTE IN POLVERE
(CEN–EN ISO 14501:1999)
 Latte in polvere: ricostituire 15g con 75 ml di acqua a 50°C
 Latte: preriscaldare il campione a 37°C
 Centrifugare per 15 min a 10000rpm
 Eliminare lo strato superiore di grasso
 Filtrare e raccogliere 50 ml
 Passare in IAC 50 ml di filtrato
CLEAN-UP:
 Lavare la IAC con 15 ml di H2O
 Eluire con 1000 l + 1000 l di AcCN per HPLC
 Portare a secco
 Riprendere con 1 ml di AcCN:H2O 90:10 (v/v)
 METODO PER LA DETERMINAZIONE DI AFM1
NEL FORMAGGIO
ESTRAZIONE:
CLEAN-UP:
Pesare 10.0g di campione in blender + 5g di celite
 Estrarre con 80ml di CH2Cl2
 Lavare con 40ml di CH2Cl2
 Filtrare su filtro di carta
 Evaporare il filtrato al Rotavapor
 Sciogliere con 1ml di MeOH, 30ml H2O, 50ml n-esano
 Trasferire in imbuto separatore
 Recuperare la fase acquosa sottostante
 Lavare la fase organica 2 volte con 10ml H2O e riunire le fasi
acquose
 Passare in IAC un volume noto di fase acquosa
 Lavare la IAC con 15ml di H2O
 Eluire con 500 l + 500 l + 500 l di AcCN per HPLC
 Portare a secco
 Riprendere con 500 l di AcCN:H2O 90:10 (v/v)
 METODO ENZIMATICO PER LA
DETERMINAZIONE DI AFM1 NEL FORMAGGIO*
ESTRAZIONE:
Pesare 5.0g di campione in beuta
 Estrarre con 50ml di soluzione di pepsina allo 0,2% in HCl
0,1N
 Porre in stufa o bagno ad acqua a 42°C per tutta la notte
(16 ore) sotto continua agitazione
 Centrifugare a 10000 rpm per 10 min
 Eliminare il grasso
 Filtrare su filtro di carta a pieghe
 Neutralizzare con NaOH 5N
 Passare in IAC un volume noto di filtrato
CLEAN-UP:
 Lavare la IAC con 5ml di H2O
 Eluire con 1000 l + 1000 l di MeOH per HPLC
 Portare a secco
 Riprendere con 1000 l di AcCN:H2O 25:75 (v/v)
*UNIVERSITÁ CATTOLICA DEL S. CUORE DI PIACENZA
A. PIETRI, T. BERTUZZI, P. FORTUNATI, G. PIVA
 CONDIZIONI CROMATOGRAFICHE
 Fase mobile AcCN : H2O 25 : 85
 Flusso: 1 ml/min
 Vinj= 150 l
 Colonna C18 150x4.6 mm 5
 La colonna termostatata a 40°C  1°C
 Spettrofluorimetro: ecc = 360nm
Cromatogramma di un campione
di latte ≈ 50ng/L
em = 435nm
Cromatogramma di un campione di
formaggio ≈ 300ng/Kg
PARAMETRI DEI METODI
LATTE 7 - 200 ng/L
FORMAGGIO 100 – 2000ng/Kg
Campo di applicazione
LATTE 10 – 160 ng/L
FORMAGGIO 70 – 1600 ng/Kg
Calibrazione e linearità
LATTE 3 ng/L
FORMAGGIO 30ng/Kg
Limite di rivelabilità
LATTE 7 ng/L
FORMAGGIO 100 ng/Kg
Limite di quantificazione
Recupero (n=10)
AFM1
Livello di
contaminazione (ng/Kg)
Recupero %
10-50
60-120
> 50
70-110
LATTE: 89%
FORMAGGIO: 88%
Criteri di rendimento per la
Aflatossina M1
(REG. (CE) N. 401/2006)
 PREPARAZIONE DELLE SOLUZIONI DI RIFERIMENTO
 PER
DILUIZIONE DI UNA SOLUZIONE DI RIFERIMENTO
CERTIFICATA
 PORTANDO A VOLUME NOTO UNA QUANTITÁ NOTA DI POLVERE
CON TOLUENE: ACETONITRILE 90:10 PER AFB1, AFB2, AFG1, AFG2 E
CON CLOROFORMIO PER AFM1
Il titolo esatto di tale soluzione è determinato mediante lettura allo spettrofotometro UV
Amax  M

 C.C.
  d 100
ρ= concentrazione delle aflatossine in μg/ml
Amax= assorbanza alla lunghezza d’onda di massimo assorbimento
M= peso molecolare dell’aflatossina
ε = coefficiente di estinzione molare dell’ aflatossina
d= cammino ottico in centimetri
C.C. = fattore di correzione
Le soluzioni di riferimento di lavoro si preparano portando a secco
sotto flusso di azoto una quantità nota di soluzione di riferimento a
titolo noto e riprendendo con opportuno solvente
INIEZIONI DI 5
LIVELLI DI STD DI
AFLATOSSINA B1, B2,
G1, G2
INIEZIONI DI 5
LIVELLI DI STD DI
AFLATOSSINA M1
 CURVA DI CALIBRAZIONE AFB1
Numero
minimo di
punti
dalle norme
ISO: 5
Livello
μg/Kg (MAIS)
μg/Kg
(PISTACCHI)
1
0.10
0,10
2
1,10
0.80
3
2,10
1.60
4
5,50
4.00
5
6,60
4.80
Coefficiente di correlazione
r2 = 0,999
 CURVA DI CALIBRAZIONE M1 LATTE - FORMAGGIO
Livello
ng/L (LATTE)
ng/Kg(FORMAGGIO)
1
7
70
2
20
170
3
30
340
4
90
900
5
160
1600
MASSIMO FATTORE DI
CONVERSIONE
LATTE FORMAGGIO = 9
Coefficiente di correlazione
r2 = 0,999
PROCEDURA DI DECONTAMINAZIONE
Rif. JAOAC Vol.48, 681 (1965)
American Ind.Hyg.Assoc.J., 42, 398 (1981)
IARC Sci.Publ. N. 37 (1980)
 La
vetreria, il materiale monouso e qualsiasi utensile sia stato a
contatto con matrici alimentari possibilmente contaminate o con
standard, DEVE essere decontaminato con una soluzione di IPOCLORITO
di SODIO allo 1% PER TUTTA LA NOTTE.
 Gocce accidentali sulle mani o parti del corpo devono essere trattate
con la stessa soluzione di ipoclorito di sodio 1% per 10’, successivamente
trattate con una soluzione acquosa di acetone al 5%, infine sciacquate
con abbondante acqua.
I
quantitativi di matrici alimentari superiori ai 2 Kg (p.e. slurry),
vengono decontaminati nella stessa maniera (2L almeno di soluzione
NaClO 1%);in più per facilitare il successivo smaltimento si aggiunge una
quantità di segatura sufficiente per assorbire il liquido.
 CONFERMA DELL’IDENTITÀ DELL’AFLATOSSINA B1
Spettro di
assorbimento
della AFB1
Spettro di
emissione
della AFB1