Linkage Lezione 4 (riprendere il testo di Genetica ) By NA 1 Tipi di mappe: mappe genetiche Mappe genetiche : si basano sulla frequenza di ricombinazione fra locus identificati attraverso marcatori di varia natura: fenotipo dell’ individuo, fenotipo tissutale, fenotipo cellulare, fenotipo proteico, fenotipo del DNA. Sono la connessione fra una realta’ biologica e il genoma corrispondente, senza di loro spesso non si puo’ procedere, By NA 2 Le mappe genetiche Si basano sugli studi di linkage cioe’ sull’analisi della segregazione alla meiosi di marcatori genetici. Se due o piu’ marcatori vengono ereditati preferenzialmente nelle combinazioni parentali si deduce che mappino nella stessa regione genomica Ricordate? L’unita’ di mappa e’ il centimorgan(cM): 1cM indica che due locus ricombinano fra loro con una frequenza pari a 0.01. Si assume che 1cM sia pari a ~1.5Mb anche se la relazione diretta non c’e’: la mappa genetica puo’ essere By NA piu’ lunga di quella fisica. 3 Ricordiamo la seconda legge di Mendel Durante la formazione dei gameti la segregazione di una coppia di alleli di un locus e’ indipendente dalla segregazione degli alleli di un’altro locus By NA 4 Risultati possibili Rapporto fenotipico diverso dovuto alla formazione di 4 tipi di gameti che si originano tutti con la stessa probabilita’ e diano tutte le possibili combinazioni RY 1/4 Gameti ry 1/4 rY 1/4 RRYY 1/16 RRYy 1/16 RrYy 1/16 RrYY 1/16 Ry 1/4 RRYy 1/16 RRyy 1/16 Rryy 1/16 RrYy 1/16 ry 1/4 RrYy 1/16 Rryy 1/16 rryy 1/16 rrYy 1/16 rY 1/4 RrYY 1/16 RrYy 1/16 rrYy 1/16 rrYY 1/16 RY 1/4 By NA Ry 1/4 9 : 3 : 3 :1 5 Rapporto mendeliano nell’assortimento indipendente A1 A1 P B1 A1/A1;B1/B1 A2 A2 X B1 B2 B2 A2/A2;B2/B2 A1 A2 F1 B1 B2 A1/A2;B1/B2 Meiosi 4 tipi di gameti in rapporti uguali A1 B1 1A1B1 F2 A1 1A1B2 A1 A1 A2 B1 1A2B1 B1 B1 X B2 B1 gamete A1/A1 B1/B1 A2 A1 A2 A1 B2 B1 : A1 1A2B2 A1 A1 1 A1/A1;B1/B1 By NA B2 A2 1 A1/A1;B1/B2 B2 B1 B1 B1 : 1 A1/A2;B1/B1 : 1 A1/A2;B1/B2 6 Rapporto genotipico nell’associazione completa A1 P A1/A1;B1/B1 B1 A1 X B2 B1 By NA A2 B2 meiosi A1 F2 B2 A1/A2;B1/B2 F1 1 A2 A2/A2;B2/B2 B1 A1 B1 A2 A2 2 tipi di gameti in rapporti uguali X 1 B2 A1 A2 A2 A2 B1 B2 B2 B2 A1/A2;B1/B2 A2 A2/A2;B2/B2 gamete A2;B2 B2 7 Rapporto genotipico nella associazione parziale A1 P A1/A1;B1/B1 B1 A1 A2 X A2/A2;B2/B2 B2 B1 A1 A2 B2 A2 A1/A2;B1/B2 F1 B1 B2 4 tipi di gameti in rapporti non uguali 80% parentali 20% ricombinanti F2 By NA A1 A2 A1 A2 B1 B2 B2 B1 A1 X B1 A1 A1 A2 A1 A1 A1 A2 A1 B1 B1 B2 B1 B2 B1 B1 B1 4 A1/A1;B1/B1 : 4 A1/A2;B1/B2 : 1 A1/A1;B1/B2 gamete A1;B1 : 1 A1/A2;B1/B1 8 Ricordiamo l’incrocio a 3 punti A B 1 a parentali B C b c A b c a B C crossing over #2 crossing over 1+2 Ma questo incrocio ha “l’aplotipo” By NA c tutti i possibili gameti a crossing over #1 2 b A C A B a b A b a B c C C c noto! 9 Ripuntualizziamo la definizione di gene il “gene” mendeliano e’ un entita’ astratta identificata dalla modalita’ di segregazione e dalla mappatura in un locus il “gene” molecolare e’ una sequenza codificante con una organizzazione definita: 5’UTR, esoni,introni, 3’UTR .... corrispondente ad una sequenza amminoacidica o piu’genericamente ad un trascritto il locus e’ una regione genomica la cui espressione porta ad un fenotipo: per cui e’ piu’ giusto parlare di locus-malattia che di gene-malattia. Il locus puo’ essere piu’ grande del gene molecolare. Il linkage si fa fra locus, non fra geni molecolari By NA 10 Ancora terminologia Aplotipo: genotipo del gamete. Se prendo in considerazione 3 locus ognuno presente nella popolazione con 2 alleli i genotipi possibili nei gameti sono: A1,B1,C1; A2,B1,C1; A1,B2,C2; A1,B1,C2; ETC.... a priori non so chi sta con chi. Nelle popolazioni naturali solo l’analisi della progenie mi dice quale era l’aplotipo dei parentali e solo nei grandi numeri. Le cose si complicano ulteriormente quando non disponendo di “fenotipi codominanti” come i polimorfismi posso seguire i loci solo con caratteri soggetti alla dominanza e recessivita’. In alternativa al termine aplotipo si usa spesso il termine fase Ricordate fase cis e trans? Accoppiamento e repulsione? Sono sinonimi operativi di aplotipo soprattutto quando si parla di locus corrispondenti a caratteri dominanti e recessivi By NA 11 Linkage:fase ATTENZIONE ALLA RICOSTRUZIONE DELLA FASE Fase genitore. : combinazione degli alleli di una regione che deriva da ciascun Meiosi informative: sono quelle che danno informazioni sulla ricombinazione. a1a1 a2a2 a1a2 non infor. By NA a1a2 a1a2 a1a2 non infor. a1a2 a1a2 a1a1 infor. a1a2 a3a4 a1a4 infor. 12 Linkage:fase di piu locus Definizione della regione candidata con analisi di linkage: ricostruzione degli aplotipi studiando la segregazione nelle famiglie. E’ necessario risalire alla fase e identificare i ricombinanti 7 5 4 6 6 2 6 5 2 6 2 2 8 6 3 2 1 8 2 2 1 6 2 2 By NA 8 6 3 2 1 8 2 5 2 5 5 5 2 2 1 9 5 5 6 5 2 6 2 2 7 5 4 6 6 2 1 4 1 3 7 5 6 5 2 6 2 2 2 2 1 9 5 5 3 6 5 5 7 8 6 5 2 6 2 2 3 6 5 5 7 8 7 4 4 2 5 4 2 5 2 6 2 2 6 5 2 6 2 2 7 4 4 2 5 4 1 4 1 3 7 5 6 5 2 6 2 2 2 2 1 9 5 8 8 3 8 2 7 10 10 4 6 4 1 6 8 3 8 2 7 10 10 3 2 3 5 8 8 3 8 2 7 10 5 3 5 3 1 7 8 3 8 4 2 3 10 3 2 3 5 8 Possedere un particolare polimorfismo non vuol dire avere il fenotipo, lo studio di linkage e’ a livello di popolazione, serve ad individuare una regione non la mutazione 13 Linkage possibili inconvenienti Ci possono essere inconvenienti che complicano la possibilita’ di assegnare un locus a una regione definita da marcatori: Errori umani: errata lettura dei dati, scambio di campioni, paternita’…… Errori nell’interpretazione del fenotipo: un falso ricombinante.Se i marcatori sono molti e vicini la presenza di un doppio ricombinante fa sospettare un errore Eterogeneita’ genetica: famiglie con fenotipo simile vengono accorpate e non si riesce a trovare il linkage. Sclerosi tuberosa: due loci distinti E’ importante disporre di numerosi siti polimorfici, che non siano soggetti a dominanza e recessivita’. I polimorfismi del DNA sono l’ideale! By NA 14 Probabilita’ di trovare ricombinanti NB non si conosce a a la loro posizione reciproca quindi bb ci sono due possibilita’ A A B B Aa B b a a bb SE I LOCI NON SONO ASSOCIATI LA PROBABILITA’ E’ 1/2 X 1/2 X 1/2 X1/2 = 1/16=0.0625 SE I LOCI SONO ASSOCIATI LA PROBABILITA DIPENDE DA QUANTO SONO DISTANTI a a b b A a B b a a b b Aa bb RICOMBINANTE NON RICOMBINANTI SE LA FREQUENZA DI RICOMBINAZIONE E’ 10% LA P DI 3 NR E 1R= 0.1X0.9X0.9X0.9=0.073=7.3% Non ho la possibilita’ di scegliere fra le due ipotesi: solo un gran numero di osservazioni mi potrebbe permettere di riconoscere quale e’ la situazione piu’ probabile NON ESISTE NULLA CHE POSSA SOSTITUIRE I GRANDI NUMERI….COME POSSIAMO OTTENERE GRANDI NUMERI NELL’UOMO??? By NA 15 Come fare il linkage Il calcolo del linkage e’ quindi statistico: occorre una progenie numerosa e bisogna conoscere la fase (aplotipo) dei parentali. come si fa visto che le famiglie umane sono di solito piccole? Si ricorre al lod score By NA 16 Linkage-lod score Il linkage e’ una relazione di vicinanza fra due loci ed e’ funzione della loro distanza. La definizione di un linkage fra due loci si basa su calcoli statistici che permettono di quantizzare la probabilta’ che i risultati ottenuti non siano dovuti al caso . Nel caso dell’uomo l’analisi della progenie di una singola famiglia raramente fornisce informazioni sia per lo scarso numero di meiosi sia per la difficolta’ di risalire alla fase. Bisogna mettere insieme i dati provenienti da piu’ famiglie. P di un assortimento genetico in una progenie se i geni sono associati Odds ratio= P di un assortimento genetico nella progenie se i geni sono indipendenti (1- Θ)n Θr (1/2)n+r Lod score: logaritmo in base 10 dei singoli rapporti di ogni famiglia, si possono cosi sommare. Un valore di 3 indica linkage. By NA 17 LOD SCORE LOD SCORE (Z): logaritmo della probabilita’ che i loci siano associati (data la frazione di ricombinazione θ ) piuttosto che non associati (θ=0.5). La probabilita’ complessiva di un gruppo di famiglie e’ il prodotto delle probabilta’ di ciascuna famiglia, percio’ la somma dei lod score. Per θ = 0.5, Z=0: infatti sono il rapporto fra probabilta’ identiche e log10(1)=0. Z=3(1000:1) e’ la soglia per accettare il linkage con una probabilita’ di errore del 5%. Z=-2 esclude il linkage. Z 4 3 2 1 0 0 0.1 0.2 0.3 0.4 Frequenza di ricombinazione Z Odds ratio= By NA 0.5 P di un assortimento genetico in una progenie se i geni sono associati P di un assortimento genetico nella progenie se i geni sono indipendenti (1- Θ)n Θr (1/2)n+r 18 La connessione fra mappe Quindi si hanno due tipi di mappe: fisica e genetica. Il problema e’ trovare il modo di legarle: la mappa fisica mi dice in che un gruppo di sequenze formano un contiguo su un frammento di cromosoma, ma non mi permette di identificare geni candidati. La mappa genetica me lo permetterebbe perche’ non riguarda specifiche sequenze, ma anche locus di cui non conosco la sequenza. Non posso pero’ studiare il gene candidato perche’ non ho la sequenza corrispondente. La possibilita’ di utilizzare STS e EST polimorfici ha permesso di risolvere il problema By NA 19 Gli STS: Sequence Target Site L’automazione del sequenziamento permette di sequenziare corte sequenze (300pb) clonate a caso da cui ricavare primers per “screenare” con la PCR ormai automatizzata le librerie e costruire mappe fisiche attraverso la creazione di contigui . Quando sono polimorfiche sono marcatori comuni alle mappe sia genetiche che fisiche e permettono di legarle fra loro 1 DNA genomico A+,B-,C+.. B+,D+,G+ Clonaggio H+,F+,T-.. Sequenziamento GACTTAG........CATAGCA ~300bp B* D G* H F* Q 2 mappa fisica:contiguo A C B D G H F Q A-,B+,C+.. F+,T-,Q+.. screening library con PCR STS A,B,C.. By NA A* C scelta dei primers x A,B,C.. mappa genetica: A, G e F sono in linkage il loro ordine e’ F-A-G H F Q A C B D G I due contigui sono sullo stesso cromosoma e via cosi.... 20 Il materiale didattico e’ presente in rete: NON sono dispense, ma un ausilio allo studio sul libro By NA 21