04 BIOTEC GenMol 10_11 linkage

Linkage
Lezione 4 (riprendere il testo di Genetica )
By NA
1
Tipi di mappe:
mappe genetiche
 Mappe genetiche : si basano sulla frequenza di
ricombinazione fra locus identificati attraverso marcatori di
varia natura: fenotipo dell’ individuo, fenotipo tissutale,
fenotipo cellulare, fenotipo proteico, fenotipo del DNA.
 Sono la connessione fra una realta’ biologica e il genoma
corrispondente, senza di loro spesso non si puo’ procedere,
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2
Le mappe genetiche
 Si basano sugli studi di linkage cioe’ sull’analisi della
segregazione alla meiosi di marcatori genetici.
Se due o piu’
marcatori vengono ereditati
preferenzialmente nelle combinazioni parentali si deduce che
mappino nella stessa regione genomica
Ricordate? L’unita’ di mappa e’ il centimorgan(cM): 1cM
indica che due locus ricombinano fra loro con una frequenza
pari a 0.01. Si assume che 1cM sia pari a ~1.5Mb anche se
la relazione diretta non c’e’: la mappa genetica puo’ essere
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piu’ lunga di quella fisica.
3
Ricordiamo la seconda legge di Mendel
Durante la formazione dei gameti
la segregazione di una coppia di
alleli di un locus e’ indipendente
dalla segregazione degli alleli
di un’altro locus
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4
Risultati possibili

Rapporto fenotipico diverso dovuto alla formazione di 4 tipi di gameti che si
originano tutti con la stessa probabilita’ e diano tutte le possibili combinazioni
RY
1/4
Gameti
ry
1/4
rY
1/4
RRYY
1/16
RRYy
1/16
RrYy
1/16
RrYY
1/16
Ry
1/4
RRYy
1/16
RRyy
1/16
Rryy
1/16
RrYy
1/16
ry
1/4
RrYy
1/16
Rryy
1/16
rryy
1/16
rrYy
1/16
rY
1/4
RrYY
1/16
RrYy
1/16
rrYy
1/16
rrYY
1/16
RY
1/4
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Ry
1/4

9
:
3
: 3
:1
5
Rapporto mendeliano nell’assortimento indipendente
A1 A1
P
B1
A1/A1;B1/B1
A2 A2
X
B1
B2 B2
A2/A2;B2/B2
A1 A2
F1
B1 B2
A1/A2;B1/B2
Meiosi
4 tipi di gameti in rapporti uguali
A1
B1
1A1B1
F2
A1
1A1B2
A1 A1
A2
B1
1A2B1
B1 B1
X
B2
B1
gamete A1/A1
B1/B1
A2 A1
A2 A1
B2 B1
:
A1
1A2B2
A1 A1
1 A1/A1;B1/B1
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B2
A2
1 A1/A1;B1/B2
B2 B1
B1 B1
:
1 A1/A2;B1/B1
:
1 A1/A2;B1/B2
6
Rapporto genotipico nell’associazione completa
A1
P
A1/A1;B1/B1
B1
A1
X
B2
B1
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A2
B2
meiosi
A1
F2
B2
A1/A2;B1/B2
F1
1
A2
A2/A2;B2/B2
B1
A1
B1
A2
A2
2 tipi di gameti in
rapporti uguali
X
1
B2
A1
A2
A2
A2
B1
B2
B2
B2
A1/A2;B1/B2
A2
A2/A2;B2/B2
gamete A2;B2
B2
7
Rapporto genotipico nella associazione parziale
A1
P
A1/A1;B1/B1
B1
A1
A2
X
A2/A2;B2/B2
B2
B1
A1
A2
B2
A2
A1/A2;B1/B2
F1
B1
B2
4 tipi di gameti in rapporti non uguali
80% parentali
20% ricombinanti
F2
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A1
A2
A1
A2
B1
B2
B2
B1
A1
X
B1
A1
A1
A2
A1
A1
A1
A2
A1
B1
B1
B2
B1
B2
B1
B1
B1
4 A1/A1;B1/B1
:
4 A1/A2;B1/B2
:
1 A1/A1;B1/B2
gamete A1;B1
:
1 A1/A2;B1/B1
8
Ricordiamo l’incrocio a 3 punti
A
B
1
a
parentali
B
C
b
c
A
b
c
a
B
C
crossing
over #2
crossing
over 1+2
 Ma questo incrocio ha “l’aplotipo”
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c
tutti i possibili gameti
a
crossing
over #1
2
b
A
C
A
B
a
b
A
b
a
B
c
C
C
c
noto!
9
Ripuntualizziamo la definizione di gene
 il “gene” mendeliano e’ un entita’ astratta identificata dalla modalita’
di segregazione e dalla mappatura in un locus
 il “gene” molecolare e’ una sequenza codificante con una
organizzazione definita: 5’UTR, esoni,introni, 3’UTR .... corrispondente
ad una sequenza amminoacidica o piu’genericamente ad un trascritto
 il locus e’ una regione genomica la cui espressione porta ad un fenotipo:
per cui e’ piu’ giusto parlare di locus-malattia che di gene-malattia. Il locus
puo’ essere piu’ grande del gene molecolare. Il linkage si fa fra locus,
non fra geni molecolari
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10
Ancora terminologia
 Aplotipo: genotipo del gamete. Se prendo in considerazione 3 locus
ognuno presente nella popolazione con 2 alleli i genotipi possibili nei gameti sono:
A1,B1,C1; A2,B1,C1; A1,B2,C2; A1,B1,C2; ETC.... a priori non so chi sta
con chi. Nelle popolazioni naturali solo l’analisi della progenie mi dice quale era
l’aplotipo dei parentali e solo nei grandi numeri. Le cose si complicano
ulteriormente quando non disponendo di “fenotipi codominanti” come i polimorfismi
posso seguire i loci solo con caratteri soggetti alla dominanza e recessivita’.
 In alternativa al termine aplotipo si usa spesso il
termine fase
Ricordate fase cis e trans? Accoppiamento e repulsione? Sono
sinonimi operativi di aplotipo soprattutto quando si parla di locus
corrispondenti a caratteri dominanti e recessivi
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11
Linkage:fase
ATTENZIONE ALLA RICOSTRUZIONE DELLA FASE
Fase
genitore.
: combinazione degli alleli di una regione che deriva da ciascun
Meiosi informative: sono quelle che danno informazioni sulla ricombinazione.
a1a1
a2a2
a1a2
non infor.
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a1a2
a1a2
a1a2
non infor.
a1a2
a1a2
a1a1
infor.
a1a2
a3a4
a1a4
infor.
12
Linkage:fase di piu locus
 Definizione della regione candidata con analisi di linkage: ricostruzione degli aplotipi studiando la
segregazione nelle famiglie. E’ necessario risalire alla fase e identificare i ricombinanti
7
5
4
6
6
2
6
5
2
6
2
2
8
6
3
2
1
8
2
2
1
6
2
2
By NA
8
6
3
2
1
8
2
5
2
5
5
5
2
2
1
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5
5
6
5
2
6
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3
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6
2
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2
2
3
6
5
5
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4
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2
2
6
5
2
6
2
2
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4
4
2
5
4
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5
6
5
2
6
2
2
2
2
1
9
5
8
8
3
8
2
7
10
10
4
6
4
1
6
8
3
8
2
7
10
10
3
2
3
5
8
8
3
8
2
7
10
5
3
5
3
1
7
8
3
8
4
2
3
10
3
2
3
5
8
 Possedere un particolare polimorfismo
non vuol dire avere il fenotipo, lo studio di
linkage e’ a livello di popolazione, serve ad
individuare una regione non la mutazione
13
Linkage
possibili inconvenienti
 Ci possono essere inconvenienti che complicano la possibilita’ di assegnare
un locus a una regione definita da marcatori:
 Errori umani: errata lettura dei dati, scambio di campioni, paternita’……
 Errori nell’interpretazione del fenotipo: un falso ricombinante.Se i marcatori
sono molti e vicini la presenza di un doppio ricombinante fa sospettare un errore

Eterogeneita’ genetica: famiglie con fenotipo simile vengono accorpate e
non si riesce a trovare il linkage. Sclerosi tuberosa: due loci distinti

E’ importante disporre di numerosi siti polimorfici, che non siano
soggetti a dominanza e recessivita’. I polimorfismi del DNA sono
l’ideale!
By NA
14
Probabilita’ di trovare ricombinanti
NB non si conosce
a a la loro posizione reciproca quindi
bb
ci sono due possibilita’
A A
B B
Aa
B b
a a
bb
SE I LOCI NON SONO ASSOCIATI LA PROBABILITA’ E’
1/2 X 1/2 X 1/2 X1/2 = 1/16=0.0625
SE I LOCI SONO ASSOCIATI LA PROBABILITA
DIPENDE DA QUANTO SONO DISTANTI
a a
b b
A a
B b
a a
b b
Aa
bb
RICOMBINANTE
NON RICOMBINANTI
SE LA FREQUENZA DI
RICOMBINAZIONE E’ 10%
LA P DI 3 NR E 1R=
0.1X0.9X0.9X0.9=0.073=7.3%
Non ho la possibilita’ di scegliere fra le due ipotesi: solo un gran numero di
osservazioni mi potrebbe permettere di riconoscere quale e’ la situazione piu’
probabile NON ESISTE NULLA CHE POSSA SOSTITUIRE I GRANDI
NUMERI….COME POSSIAMO OTTENERE GRANDI NUMERI NELL’UOMO???
By NA
15
Come fare il linkage
Il calcolo del linkage e’ quindi statistico:
occorre una progenie numerosa
e
bisogna conoscere la fase (aplotipo)
dei parentali.
come si fa visto che le famiglie umane
sono di solito piccole?
Si ricorre al lod score
By NA
16
Linkage-lod score
 Il linkage e’ una relazione di vicinanza fra due loci ed e’ funzione della loro
distanza. La definizione di un linkage fra due loci si basa su calcoli statistici
che permettono di quantizzare la probabilta’ che i risultati ottenuti non siano
dovuti al caso . Nel caso dell’uomo l’analisi della progenie di una singola famiglia
raramente fornisce informazioni sia per lo scarso numero di meiosi sia per la
difficolta’ di risalire alla fase. Bisogna mettere insieme i dati provenienti da
piu’ famiglie.
P di un assortimento genetico in una progenie se i geni sono associati
Odds
ratio=
P di un assortimento genetico nella progenie se i geni sono indipendenti
(1- Θ)n Θr
(1/2)n+r
Lod score: logaritmo in base 10 dei singoli rapporti di ogni famiglia, si possono cosi
sommare. Un valore di 3 indica linkage.
By NA
17
LOD SCORE
LOD SCORE (Z): logaritmo della probabilita’ che i loci siano associati (data la frazione di
ricombinazione θ ) piuttosto che non associati (θ=0.5). La probabilita’ complessiva di un gruppo
di famiglie e’ il prodotto delle probabilta’ di ciascuna famiglia, percio’ la somma dei lod score.
Per θ = 0.5, Z=0: infatti sono il rapporto fra probabilta’ identiche e log10(1)=0. Z=3(1000:1) e’ la
soglia per accettare il linkage con una probabilita’ di errore del 5%. Z=-2 esclude il linkage.
Z
4
3
2
1
0
0
0.1
0.2
0.3
0.4
Frequenza di ricombinazione
Z Odds
ratio=
By NA
0.5
P di un assortimento genetico in una progenie se i geni sono associati
P di un assortimento genetico nella progenie se i geni sono indipendenti
(1- Θ)n Θr
(1/2)n+r
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La connessione fra mappe
Quindi si hanno due tipi di mappe: fisica e genetica. Il problema
e’ trovare il modo di legarle: la mappa fisica mi dice in che un
gruppo di sequenze formano un contiguo su un frammento di
cromosoma, ma non mi permette di identificare geni candidati.
La mappa genetica me lo permetterebbe perche’ non riguarda
specifiche sequenze, ma anche locus di cui non conosco la sequenza.
Non posso pero’ studiare il gene candidato perche’ non ho
la sequenza corrispondente.
La possibilita’
di utilizzare STS e EST polimorfici ha
permesso di risolvere il problema
By NA
19
Gli STS: Sequence Target Site
L’automazione del sequenziamento permette di sequenziare corte sequenze (300pb)
clonate a caso da cui ricavare primers per “screenare” con la PCR ormai
automatizzata le librerie e costruire mappe fisiche attraverso la creazione di
contigui . Quando sono polimorfiche sono marcatori comuni alle mappe sia genetiche
che fisiche e permettono di legarle fra loro
1
DNA genomico
A+,B-,C+..
B+,D+,G+
Clonaggio
H+,F+,T-..
Sequenziamento
GACTTAG........CATAGCA ~300bp
B*
D G*
H F*
Q
2
mappa fisica:contiguo
A C B D G
H F Q
A-,B+,C+..
F+,T-,Q+..
screening
library con
PCR
STS A,B,C..
By NA
A* C
scelta dei primers x A,B,C..
mappa genetica: A, G e F
sono in linkage il loro
ordine e’ F-A-G
H F Q
A C B D G
I due contigui sono sullo stesso
cromosoma e via cosi....
20
Il materiale didattico e’ presente in rete:
NON sono dispense, ma un ausilio allo studio sul
libro
By NA
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