Dottorato di Ricerca in Medicina Sperimentale XXX ciclo,

Dottorato di Ricerca in Medicina Sperimentale XXX ciclo,
Dipartimento di Medicina Clinica e Molecolare.
Dottoranda: Serena Recalchi
Tutor: Prof. Maurizio Sorice
Laboratorio di Autoimmunità
RELAZIONE DEL SECONDO ANNO
Titolo del Progetto:
Ruolo delle modificazioni post-traduzionali nell’induzione di risposte autoimmunitarie.
Le modificazioni post-traduzionali sono definite come modificazioni covalenti, a carico delle proteine, che si verificano a
livello delle catene laterali aminoacidiche; possono essere causate da modificazioni enzimatiche o sorgere
spontaneamente. In condizioni fisiologiche la cellula utilizza queste modificazioni post-traduzionali, per controllare la
funzione e la regolazione dell’attività delle proteine, infatti queste variano la carica netta della proteina e
conseguentemente la loro struttura terziaria e quaternaria. Tuttavia, l’assenza, la carenza o un eccesso di modificazioni
post-traduzionali può evolvere nella generazione di autoantigeni che possono portare a risposte autoimmuni, con perdita
della tolleranza verso il self. Queste modificazioni post-traduzionali insorgono durante le risposte cellulari, quali per
esempio l’infiammazione, e gli autoantigeni generati, saranno riconosciuti e processati dalle cellule presentanti l’antigene
(APCs). Le cellule T CD4+, che riconoscono i peptidi presentati dalle APCs, amplificheranno la risposta autoimmunitaria,
portando alla formazione di autoanticorpi rivolti contro quel peptide modificato. La ricerca sulle modificazioni posttraduzionali si è rivelata negli ultimi anni di grande interesse poiché in patologie autoimmuni, quali l’artrite reumatoide, il
lupus eritematoso sistemico e la sindrome da anticorpi antifosfolipidi, queste modificazioni possono rivestire un ruolo
importante.
Questa ricerca è volta a valutare il ruolo di due particolari modificazioni post-traduzionali, la citrullinazione e la
carbamilazione, nell'induzione di risposte autoimmunitarie in corso di artrite reumatoide, una patologia sistemica
autoimmune caratterizzata da infiammazione delle sinovie con una conseguente degradazione articolare. Essendo una
patologia multifattoriale, essa è causata da una predisposizione genetica, da fattori ambientali e da un’aberrante
attivazione dell’immunità inntata ed adattativa. Nell’artrite reumatoide sono presenti sia proteine citrullinate che proteine
carbamilate e, conseguentemente, autoanticorpi rivolti contro queste proteine. La citrullinazione è una modificazione
enzimatica mediata dalla peptidil arginin deaminasi (PAD), un enzima che converte i residui aminoacidici di Arginina in
Citrullina attraverso un processo di deaminazione, in presenza di calcio; la carbamilazione invece, è una modificazione
chimica che può avvenire in presenza di cianato, il quale va a legarsi ai residui di Lisina, generando così l’omocitrullina.
Una fonte di cianato è la spontanea degradazione dell’urea. L’infiammazione può generare cianato attraverso un
meccanismo mediato dalla mieloperossidasi, un enzima abbondante nei neutrofili che converte il tiocianato in cianato in
presenza di perossido d’idrogeno. Fonti esterne di tiocianato sono rappresentate da fattori ambientali, quali il fumo, lo
smog e l’alimentazione.
Recenti risultati ottenuti nel nostro laboratorio hanno dimostrato che l'autofagia, un processo fisiologico che promuove il
“turnover” delle proteine e degli organelli danneggiati in condizioni di stress cellulare, può essere responsabile della
generazione di modificazioni post-traduzionali delle proteine che possono alterare la loro antigenicità. Molti epitopi autoantigenici sono di derivazione intracellulare e, l’ultima tappa dell’autofagia, il riciclo delle macromolecole, può portare
all’esposizione di tali macromolecole a livello del recettore MHC-II. In questo scenario l'autofagia potrebbe quindi essere
rilevante per l'induzione o la perdita della tolleranza verso molecole intracellulari e in questo modo potrebbe essere
responsabile dell'innesco di processi autoimmunitari. Il nostro interesse si è dunque focalizzato sulla possibile relazione
esistente tra PAD ed il processo autofagico. PAD appartiene ad una famiglia di 5 isoenzimi, di cui il più rappresentativo è la
PAD4. Per questa ricerca sono stati utilizzati come modello cellulare, fibroblasti umani, sinoviociti umani di controllo e
saranno successivamente utilizzati sinoviociti da pazienti con Artrite Reumatoide.
Lo studio è organizzato in tre obiettivi principali:
1)
Valutazione
in vitro
dell'effetto
dell'autofagia
sulla
citrullinazione
e
sulla
carbamilazione.
2) Valutazione degli stimoli fisiologici e patologici in grado di indurre in vitro processi di carbamilazione.
3) Valutare se tali modificazioni post-traduzionali delle proteine possano essere alla base delle risposte autoimmunitarie
in corso di Artrite reumatoide.
Come primo “step” ci siamo focalizzati sul ruolo dell’autofagia nella generazione di proteine citrullinate in fibroblasti
umani ed in sinoviociti di controllo, un modello cellulare più coerente con la patologia dell’artrite reumatoide, analizzando
l’effetto dell’autofagia sull’attività della PAD4 utilizzando un saggio per l’attività della PAD ( antibody based assay for PAD activity,
ABAP). Le cellule sono state stimolate con la rapamicina o con la tunicamicina, effettori che inducono autofagia
rispettivamente bloccando la via di mTOR e generando stress del reticolo endoplasmatico. Questi stimoli sono stati indotti
a tempi differenti, mostrando che l’enzima è attivato già dopo 5 minuti dallo stimolo autofagico. Nei sinoviociti l’effetto
risulta maggiormente evidente.
Al fine di chiarire il possibile ruolo di PAD4 nel meccanismo autofagico, abbiamo indagato la sua presenza a livello degli
autofagosomi, analizzando la sua possibile associazione con LC3-II. LC3 è una proteina solubile distribuita
ubiquitariamente nella cellula. Durante l’autofagia, la forma citosolica di LC3 (LC3-I) viene lipidata per formare LC3-II, che
localizza sulla membrana dell’autofagosoma, LC3-II è definito infatti un marker autofagico.
Per dimostrare la generazione di proteine citrullinate, abbiamo iniziato il nostro studio sui fibroblasti umani, i quali sono
stati stimolati in vitro con la rapamicina e con la tunicamicina. L’analisi mediante Western Blot , affrontando le membrane
con un anticorpo che riconosce proteine citrullinate, ha mostrato numerose bande, corrispondenti alle proteine
citrullinate dopo stimolo autofagico. Per caratterizzare meglio le bande più evidenti nei campioni, le membrane sono state
affrontate con anticorpi rivolti contro le principali proteine note in letteratura candidate alla citrullinazione: I risultati
ottenuti hanno documentato che le principali proteine citrullinate sono la vimentina e l’alfa-enolasi. Per confermare che lo
stimolo autofagico è fondamentale nell’indurre la citrullinazione di queste proteine, abbiamo eseguito esperimenti di
immunoprecipitazione dove abbiamo analizzato gli immunoprecipitati di vimentina ed alfa-enolasi in western blot,
analizzati dopo incubazione con anticorpi che riconoscono proteine proteine citrullinate. In questo modo è stato
confermato che stimoli autofagici portano alla citrullinazione della Vimentina e dell’alfa-enolasi. Questi dati sono stati
ulteriormente confermati dall’analisi sui sinoviociti, nei quali è evidente ancora la citrullinazione di Vimentina e alfaEnolasi, dopo stimolo autofagico.In parallelo, l’autofagia è stata verificata utilizzando un anticorpo anti-LC3 totale,
valutando l’aumento dell’espressione di LC3-II dopo stimolo autofagico. Inoltre è stata ulteriormente confermata in
citofluorimetria ed in immunofluorescenza, utilizzando un kit (Cito-ID, Enzo Life Sciences), che ha permesso di monitorare
l’autofagia, con un approccio rapido, preciso e quantitativo. Dopo aver confermato che processi autofagici sono in grado di
generare in vitro processi di citrullinazione, abbiamo ipotizzato che l’autofagia potesse indurre anche carbamilazione.
Siamo andati a valutare quindi la presenza di proteine carbamilate, in fibroblasti e sinoviociti umani, dopo stimolo
autofagico a tempi diversi con tunicamicina e rapamicina; i lisati cellulari sono stati analizzati mediante Western Blot,
utilizzando un anticorpo che riconosce proteine carbamilate a livello di residui di lisina. Abbiamo potuto osservare come,
dopo stimolo autofagico, alcune proteine vengono carbamilate già ad un’ora, e le bande sono maggiormente evidenti dopo
4 ore di stimolo. Inoltre, abbiamo analizzato la più comune delle proteine soggette a modificazioni post-traduzionali, la
vimentina, immunoprecipitandola ed affrontandola con un anticorpo che riconosce proteine carbamilate. La presenza di
bande, corrispondenti alla vimentina ci indica come anche nel caso della carbamilazione, dopo stimolo autofagico, la
proteina venga carbamilata. L’autofagia dunque induce anche carbamilazione.
In conclusione, si può affermare che stimoli autofagici attivano la PAD4 già dopo 5 minuti, che la PAD4 coimmunoprecipita con LC3-II indicando la sua presenza a livello degli autofagosomi e che stimoli autofagici inducono la
generazione di modifiche post-traduzionali, che portano alla formazione di proteine citrullinate e carbamilate, in
particolare la vimentina.
I prossimi obiettivi che mi propongo di raggiungere saranno quelli di valutare e studiare il ruolo funzionale della PAD4 in
corso di autofagia, con un approccio biomolecolare, utilizzando l’RNA silencing, valutare gli stimoli fisiologici e patologici
in grado di indurre in vitro processi di citrullinaione e carbamilazione ed analizzare il ruolo della citrullinazione e della
carbamilazione utilizzando come modello cellulare sinoviociti da pazienti con Artrite Reumatoide. Infine, valuterò se tali
modificazioni post-traduzionali delle proteine possano essere alla base delle risposte autoimmunitarie in corso di Artrite
reumatoide. A questo proposito saranno utilizzati sieri di pazienti con artrite reumatoide, nei quali sarà analizzata la
presenza di anticorpi anti-proteine carbamilate, al fine di valutare se essi possano rappresentare un marker diagnostico,
suggerendo un possibile significato patogenetico.
PUBBLICAZIONI 2015/2016:
Antibodies to age-β2 glycoprotein I in patients with anti-phospholipid antibody syndrome. Sorice M, Buttari B, Capozzi A,
Profumo E, Facchiano F, Truglia S, Recalchi S, Alessandri C, Conti F, Misasi R, Valesini G, Riganò R. Clin Exp Immunol. 2016
May;184(2):174-82. doi: 10.1111/cei.12762..
Altered Traffic of Cardiolipin during Apoptosis: Exposure on the Cell Surface as a Trigger for "Antiphospholipid
Antibodies". Manganelli V, Capozzi A, Recalchi S, Signore M, Mattei V, Garofalo T, Misasi R, Degli Esposti M, Sorice M. J
Immunol Res. 2015;2015:847985. doi: 10.1155/2015/847985.
"New" antigenic targets and methodological approaches for refining laboratory diagnosis of antiphospholipid syndrome.
Misasi R, Capozzi A, Longo A, Recalchi S, Lococo E, Alessandri C, Conti F, Valesini G, Sorice M. J Immunol Res.
2015;2015:858542. doi: 10.1155/2015/858542.