Alcuni trasparenti mostrati a lezione.

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Citosol
Ribosomi
Sintesi proteica
Introduzione al Sistema di Endomembrane Biotecnologie_2011
CITOSOL (2)
CITOSOL (1)
• Tutta la porzione non strutturata che costituisce la parte liquida del citoplasma. In esso si trovano in soluzione tutte le molecole necessarie per il metabolismo cellulare.
• E’ una soluzione acquosa concentrata che occupa gli spazi tra gli organuli e il citoscheletro. Di fatto è un gel
di base acquosa che contiene grandi quantità di molecole sia di grandi che di piccole dimensioni; nella maggio parte delle cellule è di solito il compartimento più voluminosos, in misura variabile da cellula a cellula.
• Nei procarioti è l’unico compartimento intracellulare
CITOSOL (3)
E’ nel citosol che si svolgono molte delle funzioni più importanti per il metabolismo cellulare, come le prime tappe della degradazione delle molecole nutrienti e la sintesi di molte delle macromolecole che costituiscono la cellula.
Nonostante molte molecole del citosol si trovino in uno stato di soluzione vera e si spostino rapidamente da un posto all’altro per diffusione libera, altre si trovano in forma rigorosamente ordinata. Queste strutture ordinate (ad es. i complessi multienzimatici) conferiscono al citosol una organizzazione interna che costituisce una zona preferenziale per la sintesi e decomposizione di macromolecole e che canalizza molte delle reazioni chimiche cellulari lungo vie metaboliche preferenziali, impedendo che i prodotti intermediari prendano vie alternative.
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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21603/figure/A864/
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Decodificazione di una molecola di mRNA
Ogni aminoacido addizionato all’estremità crescente della catena polipeptidica viene selezionato mediante appaiamento complementare di basi fra l’anticodone nel tRNA a cui é legato e il codone successivo nella catena del mRNA
Ribosomi liberi, segue
Si trovano in numero maggiore rispetto ai ribosomi legati in quelle cellule che trattengono la maggior parte delle proteine che fabbricano.
Sono responsabili delle proteine che vanno in soluzione, o formano strutture citoplasmatiche
di grandi dimensioni o elementi mobili (ad es. il citoscheletro), o vanno nel nucleo o nei mitocondri, cloroplasti o perossisomi.
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Ribosomi legati
Si trovano legati all’esterno del reticolo endoplasmatico (RE) costituendo il reticolo endoplasmatico ruvido/rugoso (RER).
Sono presenti in numero maggiore a quello dei ribosmi liberi in quelle cellule che secernono le proteine sintetizzate (ad es. nelle cellule pancreatiche che producono enzimi digestivi).
Altre localizzazioni dei ribosomi
Si trovano inoltre nei mitocondri e nei cloroplasti delle cellule eucariotiche.
Questi ribosomi hanno sempre minori dimensioni rispetto ai ribosomi citoplasmatici e sono paragonabili ai ribosomi dei procarioti sia in dimensioni che in sensibilità agli antibiotici.
PANORAMICA DELLO SMISTAMENTO
DELLE PROTEINE
Nelle cellule eucariotiche superiori, lo smistamento iniziale delle proteine mediato dal reticolo endoplasmatico ha luogo ancora durante il processo della traduzione. Le proteine sintetizzate sui ribosomi liberi o rimangono nel citosol oppure sono trasportate al nucleo, mitocondri, cloroplasti o perossisomi. Viceversa, le proteine sintetizzate sui ribosomi legati alla membrana del RE sono traslocati verso l’ER ancora nel corso della loro traduzione. Esse possono essere sia trattenute all’interno del RE oppure trasportate all’apparato del Golgi e da qui ai lisosomi, alla membrana plasmatica o all’esterno della cellula mediante vescicole di secrezione.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21480/figure/A4668/
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Ribosomi liberi e legati alla membrana del reticolo endoplasmatico
Eventi post-traduzionali
Specifici segnali, contenuti nella sequenza amminoacidica delle
proteine, le dirigono alle loro destinazioni cellulari finali
Una riserva comune di ribosomi viene utilizzata per sintetizzare sia le proteine che rimangono nel citopolasma che quelle che sono trasportate verso il reticolo endoplasmatico (ER). Un segnale di indirizzamento su di una catena polipeptidica neo‐formata indirizza il ribosoma impegnato verso la membrana del ER. La molecola di mRNA rimane permanentemente legata all’ER come parte di un poliribosoma, mentre i ribosomi si muovono lungo di esso e vengono riciclati. Alla fine di ogni giro di sintesi proteica, le subunità ribosomali vengono rilasciate e raggiungono il “pool” comune nel citosol.
Due modi per costruire un segnale di smistamento
(“sorting”) in una proteina: Il segnale risiede in un singola e ristretta sequenza lineare di aminoacidi, detta “peptide segnale” che é esposta nella proteina ripiegata. I peptidi segnali spesso si trovano all’estremità di una catena polipeptidica (come illustrato), ma possono anche trovarsi in un’altra zona.
Un “patch” segnale (pezza, toppa) si può formare mediante giustapposizione di amnoacidi di regioni che sono separate fisicamente prima che la proteina si ripieghi (come illustrato); in alternativa, “patches” separati sulla superficie della proteina ripiegata distanziati in modo fisso potrebbero formare il segnale. In qualsiasi caso, il segnale di trasporto dipende dalla conformazione tridimensionale della proteina, il che rende difficile localizzare il segnale con precisione.
In 1980 Blobel propose che le proteine di nuova sintesi siano indirizzate (“targeted”) verso e importate nei vari organelli all’interno della cellula mediante sequenze segnale incorporate. I segnali sono corte sequenze di aminoacidi codificate dal gene che specifica la proteina. Esse possono essere localizzate in qualsiasi delle estremità (N‐terminale o C‐
terminale) della proteina o da qualche parte al suo interno.
http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1999/illpres/signal.html
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“MATURAZIONE” DELLE PROTEINE
E ALTRE MODIFICAZIONI POST‐TRADUZIONALI (1)
• Ripiegamento tridimensionale corretto (aiuto di chaperoni molecolari): struttura terziaria.
• Assemblaggio delle subunità peptidiche di proteine con struttura quaternaria
• Rimozione di aminoacidi:
– sequenze segnale di indirizzamento al reticolo endoplasmatico
– metionina iniziale
– sequenze presenti nei precursori di altre molecole (es. ormoni, molecole delle proteine della cascata di coagulazione del sangue o del complemento [sistema per marcare una cellula per la distruzione da parte del sistema immunitario], monomeri di proteine destinate alla polimerizzazione extracellulare [es. collageni, elastina]) http://porpax.bio.miami.edu/~cmallery/150/cells/organelle.htm
“MATURAZIONE” DELLE PROTEINE
E ALTRE MODIFICAZIONI POST‐TRADUZIONALI (2)
“MATURAZIONE” DELLE PROTEINE
E ALTRE MODIFICAZIONI POST‐TRADUZIONALI (3)
• Formazione di legami S‐S fra gruppi laterali di cisteine (richiesto ambiente ossidante)
• Aggiunta di carboidrati e successiva elaborazione (rimozione di residui e/o aggiunta di nuovi residui)
• Aggiunta di code lipidiche (acido grasso o gruppo farnesilico a proteine associate al fogletto citosolico della membrana plasmatica; coda di glicosil‐inositol‐fosfato [GPI] a proteine associate al versante extracellulare della membrana plasmatica). • Modificazioni covalenti di aminoacidi: legame di un gruppo chimico ai gruppi carbossilici o aminici terminali o a gruppi reattivi nelle catene laterali dei residui interni. Es:
– fosforilazione/defosforilazione [mediata da chinasi e fosfatasi rispettivamente] di residui OH di tirosina, serina o treonina)
– acetilazione (ad es. degli istoni)
– metilazione (id., importante per il silenziamento dei geni)
– idrossilazione (importante per la formazione di ponti d’idrogeno fra proteine; es. collageno).
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Passi della creazione di una proteina funzionale. Come indicato, la traduzione di una sequenza di mRNA in una sequenza di aminoacidi sul ribosoma non é la fine del processo di formazione di una proteina.
Per essere utilizzata dalla cellula, la catena polipeptidica completa deve essere ripiegata correttamente nella sua conformazione tridimensionale, legare eventuali cofattori necessari, ed assemblarsi con le sue catene proteiche partner (se é una proteina con struttura quaternaria). Queste modificazioni sono rese possibili dalla formazione di legami non covalenti. Come indicato, molte proteine subiscono inoltre modificazioni covalenti su aminoacidi particolari. Nonostante le più frequenti di questi siano la glicosilazione delle proteine e la fosforilazione delle proteine, si conoscono più di 100 tipi diversi di modificazioni covalenti. Sistema di endomembrane
SISTEMA DELLE ENDOMEMBRANE
Il sistema delle endomembrane è un insieme di strutture membranose coinvolto nel trasporto all’interno della cellula. I principali componenti del sistema delle endomembrane sono il reticolo endoplasmatico, l’apparato di Golgi, vescicole, la membrana plasmatica
e l’involucro nucleare.
I componenti del sistema di endomembrane si scambiano materiali sia mediante conttato diretto che mediante l’uso di vescicole. Tutte i componenti del sistema di endomembrane sono fatti da singole membrane.
http://micro.magnet.fsu.edu/cells/endoplasmicreticulum/endoplasmicreticulum.html
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Funzione del sistema delle endomembrane
Il sistema delle endomembrane è il sistema di trasporto della cellula. I materiali sono passati lungo la cellula e si muovono verso la membrana plasmatica da dove possono venire scaricati dalla cellula. Le vescicole si formano sia nel reticolo endoplasmatico che nell’apparato di Golgi.
I lisosomi sono prodotti a partire da vescicole che si distaccano dall’apparato di Golgi. Alcune vescicole immagazzinano i prodotti per uso successivo. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=cooper&part=A1466&rendert
ype=figure&id=A1492
Trasporto vescicolare dal ER al Golgi
Proteine e lipidi sono trasportate del ER al Golgi in vescicole di trasporto che gemmano dalla membrana del ER e si fondono per formare vescicole e tubuli nel compartimento intermedio ER‐Golgi (ER‐Golgi intermediate compartment; ERGIC). Le proteine che si trovano nel lume del ER sono sono inglobate dalle vescicole e rilasciate nel lume del Golgi. Le proteine di membrana mantengono lo stesso orientamento nel Golgi che avevano nel ER. RETICOLO ENDOPLASMATICO
http://endoplasmicreticulum.net/
http://www.microscopy.fsu.edu/cells/endoplasmicreticulum/endoplasmicreticulum.html
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Reticolo endoplasmatico (1)
Il reticolo endoplasmatico fabbrica, processa e trasporta una gran varietà di composti biochimici che verranno utilizzati all’interno e all’esterno della cellula.
Molte delle proteine che si trovano nel lume del reticolo sono lì soltanto di passaggio.
Altre proteine, tuttavia, sono marcate per rimanere constantemente nel lume e sono note come proteine residenti del reticolo.
Queste proteine speciali, necessarie perchè il RE svolga le sue funzioni specializzate, contengono un segnale di retenzione specializzato che consiste in una sequenza specifica di aminoacidi che permette alla proteina di venire trattenuta nell’organello.
Esempio: proteina “chaperone” BiP (chaperone immunoglobulin‐
binding protein), che identifica altre proteine che sono state sintetizzate o processate in modo inappropriato ed impedisce loro di venire spedite alle loro destinazioni finali.
RETICOLO ENDOPLASMATICO (2)
Gioca un ruolo fondamentale nella biosintesi dei lipidi e proteine
La sua membrana é il sito di produzione di tutte le proteine transmembrana della maggior parte degli organelli cellulari, incluso:
ER stesso
apparato di Golgi
lisosomi
endosomi
vescicole di secrezione
membrana plasmatica
La membrana dell’ER é inoltre il sito di produzione della maggior parte dei lipidi
per le membrane di tutti gli organelli, incluso:
Mitocondri
Perossisomi
Cloroplasti
Inoltre sono inizialmente inserite nella cavità (lume) del ER: tutte le proteine che verranno secrete verso l’esteriore della cellula
le proteine (solubili in acqua) destinate al lume dell’ER, dell’apparato di Golgi o dei lisosomi.
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Indirizzamento co‐traduzionale delle proteine di secrezione verso il reticolo endoplasmatico (ER). La sequenza segnale dell’ormone della crescita
La maggior parte delle sequenze segnale contengono una
sequenza di amminoacidi idrofobici preceduta da residui
basici (ad es. Arginina)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9889/figure/A1474/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9889/figure/A1475/?report=objectonly
Indirizzamento co‐traduzionale delle proteine di secrezione verso il reticolo endoplasmatico (ER). Piegamento delle proteine nel Reticolo Endoplasmatico (RE)
• Passo 1. Man mano che la sequenza segnale emerge dal ribosoma, essa viene riconosciuta e legata alla particella di riconosciment del segnale (SRP). • Passo 2: La SRP scorta il complesso fino alla membrana del ER, dove esso si lega al recettore SRP. • Passo 3: La SRP viene rilasciata, il ribosoma si lega ad un complesso di proteine Sec61 di traslocazione sulla membrana, e la sequenza segnale viene inserita in un canale di membrana. • Passo 4: La traduzione riprende e la catena polipeptidica in crescita viene traslocata attraverso la membrana. • Passo 5: La scissione delle sequenza segnale da parte di peptidasi del segnale rilascia il polipeptide nel lume dell’ER. La proteina “chaperone” BiP si lega alle catene polipeptidiche mentre attraversano la membrana del RE e facilita il piegamento della proteina e l’assemblaggio all’interno dell’ER. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9889/figure/A1484/?report=objectonly
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I PONTI S-S DELLE PROTEINE
SONO FORMATI NEL RETICOLO
ENDOPLASMATICO
La formazione dei ponti disulfuro fra le catene laterali dei residui di cisteina è un importante aspetto del ripiegamento e assemblaggio delle proteine all’interno del Reticolo Endoplasmatico. Questi legami non si formano nel citosol, che è caratterizzato da un ambiente riducente che mantiene i residui di cisteina nel loro stato ridotto (‐SH). Tuttavia, all’interno del ER, un ambiente ossidante promuove la formazione dei legami disulfuro (S‐S), e i legami disulfuro che si formano nel ER giocano ruoli molto importanti nella struttura di proteine di secrezione o della superficie cellulare. La formazione dei ponti disulfuro è facilitata dall’enzima “protein disulfide isomerase”, che si trova nel lume dell’ER.
LEGAMI DISULFURO
(FORMATI NEL LUME DEL RETICOLO ENDOPLASMATICO)
Importanza per le Biotecnologie (1)
• La maggior parte delle proteine utilizzate a scopo terapeutico nell’uomo e negli animali è costituita da proteine secretorie stabilizzate da legami disulfuro (S‐S).
• Utilizzando la tecnologia del DNA recombinante si possono sintetizzare proteine secretorie di mammifero in cellule bacteriche, ma generalmente queste proteine non sono secrete (anche quando la sequenza segnale batterica viene inserita al posto di quella normale).
– Queste tendono piuttosto ad accumularsi nel citosol del batterio, dove spesso si denaturano e precipitano a causa della mancata formazione di legami disulfuro.
– Per permettere il ripiegamento di queste proteine fatte produrre dai batteri sono necessari metodi chimici molto sofisticati e pertanto molto costosi.
LEGAMI DISULFURO
(FORMATI NEL LUME DEL RETICOLO ENDOPLASMATICO)
Importanza per le Biotecnologie (2)
• Una volta appurato che la formazione di legami disulfuro avviene spontaneamente soltanto nel nel lume del RE (ambiente ossidante, mentre il citosol è un ambiente riducente) i biotecnologi si sono resi conto che le cellule batteriche non constituiscono un sistema appropriato per la sintesi di proteine che che sono normalmente stabilizzate tramite ponti disulfuro.
• Infatti, oggigiorno, si preferisce utilizzare le culture di cellule animali per la produzione su larga scala di proteine d’importanza terapeutica, come ad es.:
Siti con bei schemi (o links a) sulla glicosilazione nell’ER
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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9889/figure/A1485/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21744/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21532/figure/A4760/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21731/figure/A4778/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9843/figure/A1214/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9889/#A1477
– Anticorpi monoclonali
– Attivatore tissutale del plasminogeno (un fattore anticoagulante)
– Eritropoietina (ormone che stimola la formazione dei globuli rossi).
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https://wikispaces.psu.edu/download/attachments/48201956/image‐1.jpg
Funzioni del Reticolo Endoplasmatico Liscio
Sintesi di ormoni steroidei nelle cellule endocrine delle gonadi e della corteccia surrenale.
Detossificazione nel fegato di un gran numero di composti organici (ad es. barbiturici, etanolo) il cui uso cronico può condurre alla proliferazione del REL nelle cellule epatiche.
La detossificazione è svolta da un sistema di enzimi che trasferiscono l’ossigeno (ossigenasi), tra cui la famiglia del citocromo P450.
Questi enzimi sono caratteristici per la mancanza di specificità del substrato, essendo capaci di ossidare migliaia di composti idrofobici differenti che convertono in derivati idrofilici, più facilmente escreti.
Gli effetti non sono sempre positivi:
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Il composto relativamente inofensivo benzo[a]pirene (che si forma quando la carne è troppo arrostita alla griglia) è convertito in un potente carcinogeno dagli enzimi “detossificanti” del REL.
– I citocromi P450 metabolizzano molti farmaci da prescrizione e variazioni genetiche di questi enzimi fra gli esseri umani possono spiegare le differenze che si riscontrano da individuo a individuo nell’efficacia e negli effetti collaterali di molti farmaci.
Sequestro di ioni calcio nel citoplasma delle cellule. Il rilascio regolato di Ca2+ dal REL di cellule muscolari scheletriche o cardiache (reticolo sarcoplasmatico delle cellule muscolari) attiva la contrazione.
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citosol
Membrana del RE
Reticoli
SINTESI DEI LIPIDI
Lume del Reticolo http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9889/figure/A1488/?report=objectonly
Il reticolo sarcoplasmatico regola i livelli citosolici di Ca2+ nel muscolo scheletrico. (a) Schema tri‐
dimensionale di una porzione di cellula muscolare (miofibra) composta da sei miofibrille. I tubuli trasversi (T), che sono introflessioni della membrana plasmatica, penetrano nelle miofibrille all’altezza dei dischi Z dove vengono a contatto con le cisterne terminali del SR, formando triadi. Le cisterne terminali immagazzinano ioni Ca2+ e sono interconnesse con la rete intrallazzata dei tubuli del SR che sovrastano la banda A. (b) Rilascio e recupero di ioni Ca2+
dal SR: la depolarizzazione di una cellula muscolare (passo 1) induce il rilascio di ioni Ca2+ immagazzinati nel SR mediante proteine di rilascio del Ca2+ della membrana del SR (passo 2). In seguito, le Ca2+‐ATPasi della membrana del SR pompano ioni Ca2+
dal citosol di nuovo verso il SR, ripristinando la concentrazione citosolica di Ca2+ al suo valore di riposo entro circa 30 millisecondi (passo 3). 13
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Reticolo Sarcoplasmatico, Mic Elett
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