Proteine - Dipartimento di Chimica, Biologia e Biotecnologie

Ottobre 2016
PLS
Raimondo Germani
Università degli Studi di Perugia
Dipartimento di Chimica, Biologia e Biotecnologie
Fase 4: In Laboratorio – Esperimenti & Dimostrazioni
Dimostrazioni

Riconoscimento materiale proteico

Tecniche di separazione di proteine

Proteine come enzimi
Le Proteine
Il legame ammidico o peptidico si forma per condensazione tra il gruppo amminico NH2 di un amminoacido e quello carbossilico -COOH, di un altro amminoacido con
perdita di una molecola di acqua.
Legame ammidico
Gruppo amminico
terminale
Gruppo carbossilico
terminale
Sequenza: struttura primaria
Strutture Proteine
PRIMARIA
SECONDARIA
TERZIARIA
Collagene
Albumina
QUATERNARIA
Denaturazione Proteine
 Cambiamenti nelle condizioni sperimentali possono causare uno srotolamento
(disorganizzazione spaziale) della proteina e la perdita delle sue funzioni biologiche
(denaturazione).
– Temperatura
– pH (acido, basico)
– Solvente
– Forza ionica (concentrazione specie ioniche)
– Stress meccanico
– Additivi di natura non ionica (es. urea)
Forma nativa
Diverse forme denaturate
Dimostrazione
Per dimostrare la presenza di proteine in soluzione, si può sfruttare la capacità degli amminoacidi di
legarsi ai sali di rame dando origine a complessi intensamente colorati.
Materiale occorrente:
Soluzione di idrossido di sodio (NaOH), (12%) 12 grammi in 100 ml d’acqua;
Soluzione di solfato di rame (CuSO4 5 H2O) (1%), 1 grammo in 100 ml d’acqua;
Soluzioni acquose di solfato di ammonio (NH4)2SO4 al 5%, 20% e 40%;
Alcune provette o contenitori di vetro similari (termoresistenti);
Cilindro da 10 ml;
Becco Bunsen, phon o bagno di acqua calda;
Tre beakers da 100 ml o tre bicchieri di vetro;
Campioni alimentari su cui testare la presenza di proteine: latte, latticini in generale,
albume d'uovo, carne, succhi di frutta ecc.
ATTENZIONE: NaOH è un prodotto corrosivo evitare di ingerirlo e di metterlo a contatto con gli
occhi. Il solfato di rame, come tutti i sali di metalli pesanti, è velenoso.
Dimostrazione I
Le sostanze contenenti proteine reagiscono, in soluzione o in emulsione basica ed a caldo, con
una soluzione basica di ioni Cu 2+ (reattivo di Biuret) dando una colorazione che va dal blu al bluvioletto. La colorazione iniziale del reattivo di Biuret è celeste per la presenza di ioni rameici.
In una provetta s’introducono 1-2 ml d’albume d’uovo, quindi si
agita omogeneizzando con 5 ml d’acqua distillata. Si aggiungono
poi 2 ml circa della soluzione d’idrossido di sodio e 2 ml della
soluzione di rame. Mentre si agita la provetta, cambia di colore.
In pochi secondi, si osserva il cambiamento del colore della miscela
verso un blu-viola; questo indica la formazione di complessi dello
ione rameico (Cu2+) con la proteina.
NH
HN
O
R
O
NH
HN
R
HN
O
2+
Cu
O
NH
O O
R2
R2
NH
HN
Maggiore è il contenuto proteico più intenso sarà il
colore risultante.
Dimostrazione I
Il colore della soluzione dipende dalla natura
del complesso rameico e dal numero di
questi complessi.
Come materiale proteico si può testare anche il
latte. In questo caso dopo del tempo si formerà
un precipitato rosso mattone a causa della
presenza del lattosio, zucchero riducente che
ridurrà il Cu2+ a ossido rameoso CuO insolubile.
H
O
-
O
L'esperienza può essere eseguita anche con
materiali solidi di natura proteica come
formaggio, carne macinata o farina di legumi.
Introdurre in una provetta 2 ml di soluzione di
NaOH e una spatola di formaggio grattugiato.
Agitare con una bacchetta e scaldare, quindi
aggiungere 2 ml di soluzione di solfato di
rame.
Anche i questo caso si osserverà una emulsione
colorata in blu-viola.
HN
H
2+
Cu
-
H
NH
H
O
O
Alimenti che non contengono proteine, come il succo
della frutta o l’olio, non causano alcun cambiamento di
colore del reattivo.
Dimostrazione II
La solubilità delle proteine in acqua è legata ad un fine bilancio tra interazioni elettrostatiche e legami
ad idrogeno. Se si altera il grado di solvatazione della proteina questa può separarsi per precipitazione.
Le proteine contenute nel bianco di uovo (albumine) possono essere selettivamente precipitate per
addizione di un sale quale il solfato di ammonio (NH4)2SO4 a particolari concentrazioni.
L’ammonio solfato è un sale altamente solvatato dall’acqua, la sua presenza in soluzione riduce la
quantità di acqua disponibile per l’interazione con la proteina.
In tre provette si introducono circa 1-2 ml di albume di uovo privo del tuorlo. Alla prima provetta si
addizionano 10 ml di una soluzione del sale al 5%, alla seconda 10 ml al 20% e alla terza 10 ml al 40 %.
Dimostrazione II
Nella prima provetta la concentrazione (5%) è insufficiente a far precipitare le proteine.
Aumentando la concentrazione al 20 % alcune proteine incominciano a precipitare e si forma una
piccola quantità di sospensione bianca. Ulteriore aumento della quantità di sale, riduce sempre di
più l’acqua disponibile alle proteine, determinando la loro separazione per precipitazione. A
concentrazione di ammonio solfato ≈ 40 % si manifesta una abbondante precipitazione di materiale.
Le proteine separate per precipitazione continuano a mantenere la loro struttura terziaria, non
subiscono denaturazione. Il processo di precipitazione è reversibile, infatti, diluendo la soluzione, le
albumine insolubilizzate ritornano in soluzione.
Test Xantoproteico
Il test xantoproteico è un metodo utilizzato per le proteine, che permette di riconoscere
qualitativamente la presenza di
L - amminoacidi di natura aromatica presenti nella struttura di una proteina.
Trattando del materiale proteico con acido nitrico e scaldando, in presenza di amminoacidi a
struttura aromatica, si osserva una colorazione gialla della soluzione. Se poi la soluzione viene
alcalinizzata il colore della soluzione diviene più intenso tendente all’arancio.
In presenza di acido nitrico concentrato e scaldando, l’anello aromatico dell’amminoacido subisce una
reazione di nitrazione portando alla formazione di nitroderivati, da qui il colore giallo della soluzione.
Si ottengono degli acidi Xantoproteici (Xantho = giallo dal Greco)
La reazione è particolarmente sensibile alla
presenza di tirosina e anche di triptofano nel
materiale proteico, come per esempio l’albume
di uovo.
La fenilalanina, invece, reagisce molto
lentamente
Test Xantoproteico
Gli -ammino acidi di natura aromatica sono: L-Fenilalanina, L-Tirosina, L-Triptofano.
O
O
-
-
-
O
O
O
+
+
NH3
O
HO
L-Fenilalanina
+
NH3
NH3
NH
L-Tirosina
L-Triptofano
HNO3
O
O
OH
O 2N
+
NH3
O 2N
HO
O
OH
+
NH3
Acidi xantoproteici
O2N
OH
+
NH
NH3
Dimostrazione
Materiale occorrente:
Ammino acidi: Alanina, Fenilalanina, Tirosina, Triptofano;
Acido nitrico (HNO3) 65%;
Albume di uovo;
Soluzione di NaOH 10%;
Bacchette di vetro;
Diverse provette con tappo a vite, resistenti al calore;
Bunsen, phon o altra fonte di calore;
Guanti in lattice.
ATTENZIONE: L’acido nitrico concentrato è un acido forte con proprietà ossidanti, la soluzione di soda
al 10% è caustica, prestare molta attenzione nel maneggiarli.
Dimostrazione
In diverse provette inserire 20-40 mg dei vari amminoacidi selezionati ed aggiungere 2 mL di acqua,
in una provetta inserire circa 2 mL di albume. Aggiungere, con attenzione, goccia a goccia circa 1 mL
acido nitrico, quindi tramite una bacchetta di vetro agitare bene la soluzione. Chiudere le provette e
scaldarle per alcuni minuti.
Le provette contenenti tirosina, triptofano e albume saranno colorate in giallo.
Freddare le provette, e cautamente aggiungere sotto agitazione NaOH al 10%, goccia a goccia, fino a
che la soluzione, testata con cartina al tornasole, non è nettamente basica. Si osserverà un aumento
dell’intensità del giallo fino a diventare quasi arancione (albume e tirosina).
O
O 2N
O
OH
O2N
NaOH
-
O
+
HO
NH3
-
O
NH2
-
O
O
+
-
O
N
O
-
O
NH2
Strutture di risonanza con
delocalizzazione della carica
negativa del fenato
Reazione Chimica
A + B
C + D
 Le reazioni chimiche richiedono una certa quantità di energia affinché la reazione possa realmente
avvenire. L’energia necessaria per far partire la reazione chimica è detta Energia di Attivazione (Ea).
Eattivazione
Qualsiasi composto in grado di abbassare l’altezza della collina è un catalizzatore in quanto permette
alla reazione di raggiungere più rapidamente la posizione dell’equilibrio.
Catalizzatori
Un catalizzatore è una sostanza in grado di influenzare la velocità di una reazione chimica fornendo
alla reazione una via alternativa, a più bassa energia, per passare dai reagenti ai prodotti di reazione.
Esistono due tipi di catalisi in funzione della natura del catalizzatore: catalisi omogenea ed
eterogenea. Nella catalisi omogenea il catalizzatore si trova nella stessa fase del sistema che catalizza.
In quella eterogenea la specie catalitica è presente in una fase diversa.
stato di transizione
Reazione non
catalizzata
Reazione
catalizzata
Energia
Reagenti
Variazione
Energia libera G0
Energie di attivazione dei
due processi
Prodotti
Coordinata di reazione
Esistono a loro volta differenti categorie di catalisi in funzione dell’azione del catalizzatore, si
possono ricordare ad esempio: la catalisi acido-base, la catalisi micellare, la catalisi enzimatica, la
catalisi nucleofila, la catalisi elettrofila ed altre ancora. Tutte queste possono manifestarsi in fase
omogenea o eterogenea.
Enzimi
Gli enzimi sono catalizzatori biologici altamente efficienti e selettivi. Tutti gli enzimi presentano una
struttura proteica (eccetto alcuni DNA catalitici).
Tutte le reazioni chimiche che avvengono negli organismi viventi sono
catalizzate dagli enzimi. La catalisi procede attraverso la formazione di
complessi tra l'enzima e i reagenti.
La più semplice reazione catalizzata da un enzima può essere così
rappresenta da:
E + S <====>ES <====>EP <====> E + P
Chiave-serratura
Adattamento indotto
Dimostrazione
Alcuni cibi contengono l’enzima catalasi la cui funzione è quella di decomporre l’acqua ossigenata che
si può formare all’interno delle cellule. Tale enzima trova diverse applicazioni in tutti quei settori
tecnologici dove c’è il bisogno di rimuovere anche piccole tracce di H2O2 dai prodotti. Ad esempio la
si impiega nell’industria tessile, in quella casearia, nel settore cosmetico, nella pulizia delle lenti a
contatto, ecc.)
Introdurre in un beaker basso o in una piastra di Petri dell’acqua
ossigenata (va bene anche quella che abbiamo in casa) quindi
introdurre una fettina di patata fresca; sulla superficie della fetta
incomincerà immediatamente a svilupparsi bollicine di O2. Tanto
più è concentrata la soluzione di H2O2 tanto più vistoso sarà lo
sviluppo di O2.
A questo punto si può evidenziare l’azione
denaturante della temperatura sulla catalasi.
Se si prende una fettina di una patata lessa, si può
osservare che in questo caso non si manifesta
nessun sviluppo di O2 sulla superficie della fettina: la
temperatura ha denaturato la catalasi.
Fettina di patata
Dimostrazione
Un altro materiale ricchissimo dell’enzima catalasi è il fegato. Se si dispone di un pezzetto di fegato
crudo di manzo o di pollo, si può ripetere la stessa procedura.
Su una piastra di Petri o su un piattino porre alcuni piccoli pezzi di fegato, quindi tramite un
contagocce depositarvi sopra alcune gocce di acqua ossigenata.
In questo caso lo sviluppo di ossigeno sarà molto più forte, tutto il pezzettino di fegato si coprirà
immediatamente di una spessa schiuma dovuta allo sviluppo di O2. Il maggior sviluppo di ossigeno è
dovuto alla maggiore quantità dell’enzima catalasi contenuto nel fegato.
Pezzetto di fegato
Anche in questo caso si può mettere in evidenza il processo di denaturazione. Se si prende una un
pezzettino di fegato cotto (lessato in acqua bollente), si può osservare che in questo caso non si
manifesta nessun sviluppo di O2 sulla superficie del pezzetto di fegato: la temperatura ha denaturato
la catalasi.
Concetti ed Aspetti Correlati
 α-AMINOACIDI
 LEGAME AMMIDICO (PEPTIDICO)
 PROTEINE
 STRUTTURE DELLE PROTEINE
 FUNZIONE DELLE PROTEINE
 GLI ENZIMI
 LA CATALISI ENZIMATICA
 LA DENATURAZIONE DELLE PROTEINE
 CHIMICA DEGLI ALIMENTI