“Valutazione dell’effetto protettivo nei confronti di
processi infiammatori e/o proossidanti dell’acqua
sulfurea “Aquaria Thermae” mediante tests in vitro
su linee cellulari di cheratinociti”
Clin. Term. 62 (1-2):20-24, 2015
“Valutazione dell’effetto protettivo nei confronti di processi infiammatori e/o proossidanti dell’acqua sulfurea
“Aquaria Thermae” mediante tests in vitro su linee cellulari di cheratinociti”
Evaluation of protective effect on inflammatory and/or prooxidant
processes of sulphureous thermal water “Aquaria Thermae” by means of in vitro tests on keratinocytes lines
D. Montesano1, P. Stiuso2, R. Caporaso, G.C. Tenore4
Clin. Term. 62 (1-2):20-24, 2015
Riassunto – I benefici effetti delle acque termali sono conosciuti da secoli ed il trattamento con acque
termali sulfuree sono raccomandate per una varietà di patologie croniche come anche per affezioni
acute ricorrenti. Molto spesso, però, gli effetti positivi della terapia sono valutati in senso soggettivo
mediante la registrazione dei miglioramenti della sintomatologia clinica. In questo lavoro vengono presi
in considerazione dei parametri oggettivi per comprendere le potenzialità curative dell’acqua sulfurea
denominata “Aquaria Thermae” attraverso la valutazione del potere antiossidante ed antinfiammatorio su linee cellulari epiteliali tramite la determinazione del rilascio di ROS ed RNS oltre a quello di
specifiche citochine.
Abstract – Tha salutary effects of thermal waters are known from centuries and the treatment with
sulphureous thermal waterare recommended for various chronic pathologies and for acute recurring
affective disorders. However, frequently, the positive effects of therapy are evaluated subjectively by the
registration of improvements of clinical symptoms. In this paper are considered objective parameters
to appreciate the curative potentialities of sulphureous water called “Aquaria Thermae” by means of
the evaluation of antioxidative and antiinflammatory power on epithelial cellular lines using the determination of the ROS and RNS release besides that specific cytokines.
PAROLE CHIAVE – Acque minerali sulfuree, infiammazione, ROS, RNS, cheratinociti
Key words – Thermal water, inflammation, ROS, RNS, keratinocytes
Montesano D., Dipartimento di Farmacia, Univ. “Federico II”di Napoli, via Domenico Montesano, 49.
80131 Napoli. E-mail: [email protected]; 2
Stiuso P., Dipartimento di Biochimica Biofisica e Patologia Generale, SUN,Via Luigi De Crecchio, 7.
80138 Napoli. E-mail: [email protected];
3
Caporaso R., Relax Aquaria Thermae, via Bagni, 2, San Salvatore Telesino (BN)
E-mail: [email protected] 4
Tenore G. C., Dipartimento di Farmacia, Univ. “Federico II” di Napoli, via Domenico Montesano, 49.
80131 Napoli. E-mail: [email protected]
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processi infiammatori e/o proossidanti dell’acqua
sulfurea “Aquaria Thermae” mediante tests in vitro
su linee cellulari di cheratinociti”
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I benefici delle cure termali su alcune affezioni della pelle era già noto ai Romani, ne
sono testimonianza oltre ai numerosi templi
termali che sorsero durante l’ impero, la trattazione sulle malattie desquamative del medico
greco Ippocrate di Kos (460-379 a.C.).
Tra le varie tipologie di acque termali,
quelle sulfuree sono state oggetto di svariati
studi a carattere scientifico per determinarne
le basi terapeutiche della loro azione curativa.
Le acque sulfuree mostrano diverse proprietà,
infatti oltre a detergere la pelle eliminando gli
strati superficiali costituiti da cellule morte,
stimolando così la crescita degli strati più
profondi, sono state registrate diverse proprietà
curative a livello dermatologico: esse svolgono
un effetto importante nella cura delle malattie
della pelle quali psoriasi, eczemi, ustioni, forme allergiche da contatto, ecc.
In particolare le acque termali vengono
sempre più utilizzate per il trattamento della
psoriasi. Tale uso, comunque, non va certo
inteso come sostitutivo dei farmaci tradizionalmente usati per curare tale patologia, ma
si colloca come alternativa terapeutica o si
integra ad essa, con il vantaggio di una riduzione della posologia farmacologica e maggiore
contenimento di eventuali effetti collaterali
indesiderati (1-4).
Le acque solfuree hanno capacità cheratinolitica e antidolorifica ed agiscono sulla
risposta immune ed infiammatoria, inibendo
le citochine responsabili della patogenesi della
malattia (5-7).
È stata registrata, inoltre, una importante
capacità antiossidante e di protezione del tessuto epidermico dopo trattamento idropinico
dei pazienti presi in esame (8). In questo lavoro
vengono valutati dei parametri oggettivi per
comprendere le potenzialità curative dell’ac-
qua sulfurea denominata “Aquaria Thermae”
mediante la determinazione del potere antiossidante ed antinfiammatorio su linee cellulari
epiteliali stimando il rilascio di ROS ed RNS
oltre a quello di specifiche citochine.
Materiali e metodi
Colture cellulari e trattamenti in vitro
Le linee cellulare umane di cheratinociti
immortalizzati (HaCaT) sono state coltivate in
Medium 154 (Cascade Biologicals, Portland,
OR) con l’aggiunta di 1% Human Melanocytes Growth Supplement (HMGS; Cascade
Biologicals, Portland, OR). Le cellule HaCaT
sono state coltivate in DMEM contenente siero
bovino fetale al 10%. Lo stress ossidativo è
stato indotto mediante trattamento con H2O2
a concentrazioni comprese tra 15 e 100µM
a 37°C per 30min. L’effetto differenziante è
stato indotto mediante trattamento con C-3-G
alle concentrazioni di 10 e 20µM per 48h.
Acido retinico alle stesse concentrazioni è
stato utilizzato come controllo positivo di
differenziamento.
Microscopia ottica e microscopia confocale (CLSM )
L’osservazione al microscopio ottico è
stata effettuata su campioni di cellule HaCaT
opportunamente fissati e colorati con May
Grunwalds-Giemsa. L’evidenziazione al microscopio confocale dell’espressione di Melan-A/MART1 e di E-caderina è stata effettuata
su campioni fissati in paraformaldeide ed in
seguito immunomarcati (marcatura indiretta)
utilizzando anticorpi diretti verso le proteine
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in esame. L’osservazione è stata effettuata
mediante microscopio confocale LEICA TCS
4D dotato di laser argon/kripton.
Risultati e conclusioni
Sono stati valutati gli effetti dei campioni
di acqua sulla linea cellulare umana di cheratinociti immortalizzati (HaCaT) in condizioni
fisiologiche. I dati sperimentali dimostrano che
il contenuto di idrogeno solforato è funzionale
ad una protezione della linea cellulare dallo
stress ossidativo fisiologico (Fig. 1-3). Infatti,
è possibile evidenziare una stimolazione alla
proliferazione che dimostra un’aumentata vitalità cellulare (Fig. 1). Una possibile spiegazione di tale effetto deriverebbe dai dati illustrati
nelle Figure 2 e 3. È possibile evidenziare
una capacità di riduzione della proliferazione
Fig. 1
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Fig. 2
radicalica cellulare da parte del campione solforato (Fig. 2), ed una stimolazione al rilascio
di ossido nitrico nel mezzo cellulare (Fig. 3).
Fig. 3
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Quest’ultimo dato confermerebbe una capacità di protezione antiossidante delle cellule.
Infatti, è risaputo che l’ossido nitrico viene
impiegato dalle cellule per contrastare il loro
stato di stress ossidativo, tale che la quantità
di ossido nitrico rilasciata nel mezzo cellulare
sarebbe inversamente proporzionale allo stato
di stress ossidativo cellulare.
Successivamente, sono stati valutati gli effetti dei campioni di acqua sulla linea HaCaT
stressata con H2O2. I dati riportati in Tabella 1
dimostrano una significativa capacità di protezione antiradicalica. Il campione solforato è
ancora una volta il più attivo, come evidenziato
non solo dalla superiore riduzione di proliferazione radicalica (TBARS) ma anche dalla
invariata attività enzimatica (MnSOD) rispetto
al controllo, indice di una non esigenza della
cellula di ricorrere ad armi proprie (enzimi
antiossidanti) per la difesa dallo stress ossidativo indotto.
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Tabella 1. Effetti su stress ossidativo indotto*.
Controllo
H2O2 50 μM
Non H2S
H2S
NO2- nmol/μg protein
0.0100 ± 0.009
0.0265 ± 0.008
0.0252 ± 0.006
0.0048 ± 0.0007
MnSOD U/μg protein
0.0100 ± 0.0010
0.0280 ± 0.0050
0.0220 ± 0.0070
0.0100 ± 0.0035
* Valori espresso come media ± SD di almeno tre esperimenti (P < 0.001 rispetto al controllo)
MnSOD: manganese superossido dismutasi
Controllo: cellule non trattate
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Questo lavoro è stato eseguito con il contributo della Fondazione Giovanni Caporaso (la Fondazione ha sede
attuale momentanea in Benevento,
Via del Pomerio, 35.
La sede definitiva sarà presso il costituendo centro di
ricerca e cura sito in Benevento Contrada Piano Cappelle).
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