Biol. Mar. Medit. (2005), 12 (1): 198-200 M. Mancuso, G. Caruso, M.G. Denaro*, M.T. Costanzo, G. Maricchiolo, F. De Pasquale CNR - Istituto per l’Ambiente Marino Costiero (IAMC) - Sezione di Messina, Spianata S. Raineri, 86 – 98122 Messina, Italia. *Dipartimento di Fisiologia Generale e Farmacologia, Università di Messina, Italia. PATTERNS ENZIMATICI DEL TRATTO DIGESTIVO DI ANGUILLA ANGUILLA A DIGIUNO E DOPO ALIMENTAZIONE ENZYMATIC PATTERNS OF THE DIGESTIVE TRACT OF EUROPEAN EEL (ANGUILLA ANGUILLA) AT STARVATION AND AFTER FEEDING Abstract A study of the digestive enzymes of European eel was carried out in order to achieve information on the digestive physiology of this species; total proteases, pepsin, trypsin, chymotrypsin, carboxypeptidases A and B, amylase and lipase were measured. After feeding, all enzyme patterns increased, particularly carboxypeptidase A and lipase in the intestine and stomach, respectively. The low levels of amylase activity measured in A. anguilla indicated the scarce hydrolytic activity over carbohydrates. Key-words: Anguilla anguilla, digestion, enzymes, physiology. Introduzione L’anguilla europea (Anguilla anguilla Linneo, 1758) è un teleosteo eurialino appartenente alla famiglia Anguillidae. Allevata in estensivo da moltissimi anni, è una specie molto apprezzata, soprattutto nel Nord Italia. Al fine di migliorare i protocolli alimentari finora esistenti ed acquisire informazioni sulla fisiologia digestiva relativamente alle potenzialità metaboliche, è stato condotto uno studio sul pattern enzimatico di Anguilla anguilla (European eel) in condizioni di digiuno e dopo assunzione di cibo per esaminare le eventuali variazioni legate ai processi digestivi. Materiali e metodi Nel dicembre 2002, esemplari (n = 10) di Anguilla anguilla allevati da 48 mesi (peso medio 133 ± 2.3 g, lunghezza totale media 26 ± 1.2 cm), sono stati stabulati in una vasca circolare in PVC (capacità 300 l) a flusso continuo, con fotoperiodo naturale e temperatura di circa 20 °C. Essi sono stati alimentati “ad libitum” con una dieta fresca a base di sarde e sacrificati a digiuno al mattino e dopo 4 ore dall’assunzione di cibo, previa anestesia con MS 222 alla concentrazione di 0.1 ppm. La scelta di un unico intervallo temporale di 4 ore è stata dettata dal ridotto numero di esemplari disponibili e dalla necessità di analizzare un numero di individui statisticamente significativo (5 per ciascuna fase digestiva). Campioni di stomaco ed intestino sono stati omogeneizzati in Potter Ultraturrax e diluiti 1:20 in tampone Tris HCl 50 mM pH 7. Tutte le operazioni sono state effettuate a freddo (4 °C), al fine di evitare la denaturazione enzimatica. Dopo la centrifugazione a 3000 rpm per 20’ a 5 °C, il supernatante ottenuto è stato utiliz- Enzimi digestivi in Anguilla anguilla 199 zato come estratto enzimatico per valutare le seguenti attività: attività proteolitica totale, pepsina, tripsina, chimotripsina, carbossipeptidasi A e B, amilasi e lipasi (Caruso et al., 2001). Tutti i valori sono stati infine riportati come attività specifiche (U/mg proteina), normalizzandoli rispetto al contenuto in proteine. I dati sono stati sottoposti ad analisi della varianza (ANOVA) per valutare la significatività statistica delle differenze fra i valori ottenuti nelle due fasi digestive. Risultati La Tab. 1 riporta le misure di attività enzimatica ottenute sugli esemplari esaminati. I valori di attività proteolitica totale ottenuti hanno presentato un picco nello stomaco a pH 2 sia a digiuno che dopo ingestione; nell’intestino il picco di attività è stato osservato sia a pH 9 a digiuno che a pH 6, quattro ore dopo il consumo di cibo. Tab. - Enzimi digestivi di Anguilla anguilla (n=5). Sono riportati i valori medi misurati ± deviazione standard, ed i valori (F) di analisi della varianza calcolati fra le due condizioni sperimentali. Tab.1- Enzimi digestivi di Anguilla (n=5).in U/mg di proteina per le proteasi e in U/ml per amilasi e lipasi; I dati sonoanguilla espressi Sono riportati i valori*P<0.05; medi misurati**P<0.01 ± deviazione n.d.=non standard, ed i valori (F) di analisi della varianza calcolati fra le due determinato. condizioni sperimentali. I dati sono espressi ininU/mg di proteina per le proteasi e in U/ml per amilasi e lipasi; *P<0.05; **P<0.01 Digestive enzymes Anguilla anguilla (n=5). n.d.=non determinatoThe mean values ± standard deviation, and F values of analysis of variance calculated between two are reported. Data are expressed in U/mg protein for proteases in two U/ml for amylase andare lipase; The mean values ± standard deviation, and F values of analysis of variance calculated and between experimental conditions reported. **P<0.01 n.d.= Data are expressed in*P<0.05; U/mg protein for proteases and innot U/mldeterminated for amylase and lipase; *P<0.05; **P<0.01 Digestive enzymes inexperimental Anguilla anguillaconditions (n=5). n.d.=not determined A digiuno Dopo ingestione F Digiuno vs ingestione pepsina 41716.44 ± 2144 163062.29 ± 5807 19.21 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 n.d. tripsina 343.04 ± 212 352.05 ± 124 0.01 1346.36 ± 657 3312.41 ± 154 0.01 Stomaco chimotripsina Intestino A digiuno Dopo ingestione F Digiuno vs ingestione 2422.29 ± 1165 11512.58 ± 788 2.09 8177.37 ± 3144 75589.39 ± 3445 10.44* carbossipeptidasi A 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 n.d. 22.8 ± 1.7 2143.9 ± 115 68.00** carbossipeptidasi B 0.00 ± 0.00 245.92 ± 123 n.d. 669.09 ± 53.4 361.98 ± 76 5.46 amilasi 3.37 ± 1.22 10.85 ± 4.5 9.86* 0.715 ± 0.35 1.11 ± 0.41 2.68 lipasi 6.65 ± 0.67 17.76 ± 3.4 11.72** 13.68 ± 9.1 14.25 ± 6.2 0.01 Dopo ingestione la pepsina nello stomaco ha presentato livelli di attività maggiori rispetto a quelli misurati a digiuno; nessuna attività è stata, invece, riscontrata nell’intestino sia a digiuno che dopo ingestione. Il contenuto in tripsina è risultato elevato nell’intestino, a livello del quale sono stati registrati dopo assunzione di cibo valori di attività 2.46 volte maggiori rispetto ai valori registrati a digiuno. In maniera analoga alla tripsina, anche la chimotripsina ha presentato spiccati livelli di attività nell’intestino, nel quale è stato misurato dopo ingestione un incremento pari a 9.24 volte i valori a digiuno. I valori di carbossipeptidasi A misurati nell’intestino dopo ingestione hanno mostrato un aumento significativo (circa 94 volte, F1,9 = 68.0, P < 0.01) rispetto al digiuno; al contrario la carbossipeptidasi B ha presentato un decremento di attività dopo assunzione di cibo. 200 M. Mancuso, G. Caruso, M.G. Denaro, M.T. Costanzo, G. Maricchiolo, F. De Pasquale Il contenuto in amilasi dello stomaco è aumentato di circa 3 volte dopo ingestione; nell’intestino invece non sono state rilevate variazioni significative tra le due condizioni nutrizionali. Dopo ingestione, anche i valori di attività lipolitica nello stomaco sono aumentati significativamente (F1,9 = 11.72, P < 0.01) (con un incremento in confronto al valore a digiuno pari a 2.67 volte). Conclusioni Data la scarsa disponibilità di dati sul contenuto in enzimi digestivi e sull’andamento dei processi enzimatici di Anguilla anguilla (Garcia-Gallego et al., 1995; Schmidt et al., 1984), lo studio condotto contribuisce ad ampliare le conoscenze sulla fisiologia digestiva di tale specie. Livelli di attività proteolitica più elevati sono stati riscontrati a livello gastrico anziché intestinale, in accordo con Morishita et al. (1964). Il picco di attività registrato a pH 2 nello stomaco è attribuibile al contenuto in pepsina, come riportato da Hidalgo et al. (1999). Il riscontro di un’elevata attività proteasica negli esemplari analizzati è in accordo con quanto osservato in altre specie ittiche carnivore precedentemente studiate, come Pagellus bogaraveo (Caruso et al., 2003). I bassi valori di attività amilolitica misurati in A. anguilla risultano, invece, indicativi di una ridotta capacità di idrolisi dei carboidrati, come riportato da Hidalgo et al. (1999). Dopo l’assunzione del cibo, tutte le attività enzimatiche hanno presentato un incremento significativo, ad eccezione della carbossipeptidasi B, probabilmente a causa dei lunghi tempi digestivi richiesti dalla specie (Takii et al., 1985). I ridotti tempi di digestione (4 h) presi in considerazione nel nostro studio non permetterebbero infatti di rilevare il picco di attività digestive, che secondo Chiu e Pan (2002) in Anguilla japonica avrebbe luogo 11 h dopo ingestione. Future indagini condotte prolungando i tempi fra ingestione del cibo e sacrificio dell’animale, potrebbero apportare ulteriori informazioni sull’andamento dei processi digestivi in A. anguilla. Bibliografia CARUSO G., GENOVESE L., MICALE V., SPEDICATO M.T., MANCUSO M. (2001) Preliminary investigation of the digestive enzymes in Pagellus erythrinus (Linneo 1758) larvae. Mar. Fresh. Behav. Physiol., 34: 265-268. CARUSO G., GENOVESE L., MANGANARO A., MAIMONE G., MANCUSO M., PALMEGIANO G.B. (2003) - Enzimi digestivi in Pagellus bogaraveo: tre diete a confronto. Biol. Mar. Medit., 10 (2): 430-433. CHIU S.T., PAN B.S. (2002) - Digestive protease activities of juvenile and adult eel (Anguilla japonica) fed with floating feed. Aquaculture, 205: 141-156. GARCIA-GALLEGO M., BAZOCO J., SUAREZ M.D., SANZ A. (1995) - Utilization of dietary carbohydrates by fish: a comparative study in eel and trout. Animal Sciences, 61: 427-436. HIDALGO M.C., UREA E., SANZ A. (1999) - Comparative study of digestive enzymes in fish with different nutritional habitus. Proteolytic and amylase activities. Aquaculture, 170: 1393-1399. MORISHITA T., NODA H., KITAMIKADO M., TAKAHASHI T., TACHINO S. (1964) - The activity of digestive enzymes in fish. J. Fac. Fish. Pref. Univ. 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