Biol. Mar. Medit. (2003), 10 (2): 1129-1132 A. Quaglia, D. Minelli, A. Giuliani, L. Dipietrangelo, L. Villani Dipartimento di Biologia Evoluzionistica Sperimentale, Università degli Studi di Bologna, Via Selmi, 3 - 40126 Bologna, Italia. CONNESSIONI OLFATTORIE SECONDARIE NELL’ENCEFALO DI ANGUILLA ANGUILLA (OSTEICHTHYES, ACTINOPTERYGII) SECONDARY OLFACTORY CONNECTIONS IN THE BRAIN OF ANGUILLA ANGUILLA (OSTEICHTHYES, ACTINOPTERYGII) Abstract The fluorescent carbocyanine dye DiI has ben used to retrogradely label the neuronal connections between forebrain and midbrain in the Anguilla anguilla. The present results basically confirm previous observations in other actinopterygian fishes, cartilaginous fishes and land vertebrates, thus demonstrating a highly conserved anatomical pattern of the telencephalo-mesencephalic connections in the evolution of the vertebrate brain. Key-words: Anguilla anguilla, telencephalon, habenular nuclei, tracing secondary olfactory connections. Introduzione Le proiezioni che collegano il telencefalo olfattivo (rinencefalo) al mesencefalo permettono, nei Vertebrati acquatici, il trasferimento degli impulsi olfattivi ai centri preposti allo svolgimento delle attività riflesse legate alla vita istintiva per la conservazione dell’individuo e della specie. Una delle più importanti vie di collegamento tra queste aree nervose è rappresentata dalle connessioni tra il rinencefalo, i nuclei delle abenule ed il nucleo interpeduncolare mesencefalico (Nieuwenhuys et al., 1998). Questo sistema si presenta nell’evoluzione dei Vertebrati come una delle strutture più conservate dell’encefalo sia per quanto concerne i collegamenti anatomici sia per il pattern dei neurotrasmettitori utilizzati nelle diverse vie nervose. Sono però state osservate differenze nelle linee evolutive pesci ossei-pesci cartilaginei (Giuliani et al., 2002) ed una complessità maggiore nel passaggio dalla vita acquatica alla vita terrestre. Nella presente ricerca abbiamo voluto studiare questo sistema di connessioni nella linea evolutiva dei pesci ossei, utilizzando esemplari dell’Anguillide Anguilla anguilla, che vive parzialmente in acqua marina e che è evolutivamente più primitivo del Ciprinide Carassius auratus (Villani et al., 1996) e del Salmonide Oncorhyncus mykiss (Yanez e Anadon, 1996). Materiali e metodi Sono stati utilizzati esemplari adulti di Anguilla anguilla (40 cm) che dopo anestesia (tricainemethanesulphonate MS 222- Sigma, 200 mg/l) sono stati perfusi con paraformaldeide 4% in tampone fosfato. Alcuni encefali prelevati sono stati poi inclusi in paraffina e le sezioni colorate con Giemsa. Per lo studio delle proiezioni nervose è stato utilizzato il colorante fluorescente indocarbocianina (DiI, Molecular Probe) che diffondendo lungo il doppio strato fosfolipidico delle membrane delle cellule nervose, permette la marcatura anterograda e retrograda dei neuroni interessati. Piccoli cristalli di DiI sono stati inseriti nei nuclei delle abenule e nel nucleo interpeduncolare degli encefali fissati in paraformaldeide. 1130 A. Quaglia, D. Minelli, A. Giuliani, L. Dipietrangelo, L. Villani Dopo 30-40 giorni gli encefali sono stati sezionati e le sezioni sono state osservate con microscopio Zeiss equipaggiato con filtri per la rodammina e fotografate. Risultati e conclusioni I risultati ottenuti dopo l’applicazione di DiI hanno permesso di identificare i seguenti sistemi di proiezione: -una connessione diretta telencefalo-interpeduncolare proveniente da neuroni del nucleo del setto dell’area ventrale del telencefalo (Fig. 1); Fig. 1 - Sezione di telencefalo (A); la freccia indica l’area centrale (omologa al nucleo del setto) dove compaiono i neuroni fluorescenti (B-C) dopo inserzione di Dil nelnucleo interpeduncolare. Telencephalon (A); arrow points at the area ventralis (omologous of mammalian septum). B and C: fluorescent neurons observed in the area ventralis after Dil insertion in the IPN. Bars: A=150 μm, B-C=20 μm -connessioni telencefalo-abenulari provenienti da neuroni della parte dorsale dell’area ventrale del telencefalo, dal nucleo entopeduncolare e dai neuroni dell’area preottica (Fig. 2); -una proiezione talamo-abenulare proveniente dalla zona del tubercolo posteriore; -una connessione abenulo-interpeduncolare (Fig. 3). I risultati da noi ottenuti dimostrano che nell’Anguillide Anguilla anguilla sono presenti alcune proiezioni tra nuclei telencefalici, nuclei abenulari diencefalici e nuclei mesencefalici (Fig. 4). La fluorescenza dei neuroni della porzione dorsale dell’area ventrale telencefalica dopo marcatura dei nuclei abenulari conferma che questa area può essere omologata al nucleo del setto dei Vertebrati terrestri (Northcutt e Braford, 1987). Questi risultati concordano sostanzialmente con quanto precedentemente osservato nei più evoluti Euteleostei: nel Ciprinide Carassius auratus (Villani et al., 1996) e nel Salmonide Oncorhynchus mykiss (Yanez e Anadon, 1996). Anche nei pesci Connessioni olfattorie in Anguilla anguilla 1131 Fig. 2 - Sezione del telencefalo (A). La freccia indica il nucleo entopeduncolare. Dopo marcatura delle abenule appaiono fluorescenti neuroni nel nucleo entopeduncolare (B), del nucleo preottico(C) e fibre del tratto telencefalo-abenulare (D). Telencephalon at the level of entopeduncolarnucleus (arrow) (A). Retrograde labeling shows fluorescent cell bodies in the entropeduncolar nucleus (B), preoptic area (C) and fibers of the telencephalo-habenular tract. Bars: A= 350 μm, B-C = 50 μm, D= 20 μm Fig. 3 - Sezione del nucleo interpeduncolare (A) che mostra la fluorescenza delle fibre provenienti dalle abenule (B). Mesencephalon at the level of IPN (A). After insertion of DiI, fluorescent terminals are seen in the IPN. Bars: A= 350 μm, B= 100 μm 1132 A. Quaglia, D. Minelli, A. Giuliani, L. Dipietrangelo, L. Villani cartilaginei, nonostante una rilevante asimmetria dei nuclei abenulari, si osservano cospique proiezioni telencefaliche dall’area del setto, dall’area preottica e dal nucleo entopeduncolare, mentre un’ altra importante proiezione alle abenule proviene dalla parte dorsale del pallio (Giuliani et al., 2002). E’ confermata nell’anguilla la massiccia proiezione abenule-nucleo interpeduncolare ed anche la proiezione diretta telencefalonucleo interpeduncolare già osservata nel carassio (Villani et al., 1996) e presente nei Mammiferi (Villani, 1996). Questi dati confermano che questo sistema di connessioni risulta particolarmente conservato nell’evoluzione dei pesci ossei e non subisce modificazioni apprezzabili nei pesci d’acqua dolce ed in quelli marini. Fig. 4 - Schema riassuntivo delle proiezioni olfattorie telencefalo-abenulo-interpeduncolari nell’anguilla. Ab: abenule; NE: nucleo entopeduncolare; NIP nucleo interpeduncolare; NS: nucleo del setto; Tel: telencefalo; TO: tetto ottico. Schematic driving that sumarizes the projections between telencephalo-habenulae and IPN. Ab: habenulae; NE: nucleus entopeduncularis; NIP: nucleus interpeduncularis; NS: nucleus septi; Tel: telencephalon, TO: tectum opticum. Bibliografia GIULIANI A., MINELLI D., QUAGLIA A., VILLANI L. (2002) – Telencephalo-habenulo-interpeduncolar connections in the brain of the shark Chiloscyllium arabicum. Brain Res., 926: 186-190. YANEZ J., ANADON R. (1996) – Afferent and efferent connections of the habenula in the rainbow trout (Oncorhynchus mykiss): an indocarbocyanine dye (DiI) study. J. Comp. Neurol., 372: 529543. NIEUWENHUYS R., TEN DONKELAAR H.J., NICHOLSON C. (1998) – The central nervous system of Vertebrates. Springer- Verlag Berlin, Heidelberg, 2: 760-1524. NORTHCUTT R.G., BRAFORD M.R. (1987) – New observations on the organization and evolution of the telencephalon of actinopterygian fisches. In: Ebbenson S.O.E (ed), Comparative Neurology of the telencephalon. Plenum Press, New York: 41-98. VILLANI L. (1996) – The septointerpeduncolar projection in the rat: tracing with the carbocyanine dye DiI. Brain Res. Bull., 40: 279-282. VILLANI L., ZIRONI I., GUARNIERI T. (1996) – Telencephalo-habenulo- interpeduncolar connections in the goldfish: a DiI study. Brain Behav. Evol., 48: 205-212.