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RISOLUZIONE ENO 10/2006
DETERMINAZIONE DELLA SOMMA DI GLUCOSIO E DI FRUTTOSIO NEI VINI TRAMITE pHMETRIA DIFFERENZIALE
L’Assemblea generale
Visto l’articolo 2 paragrafo 2 iv dell’accordo del
l’Organizzazione internazionale della vite e del vino
3
aprile
2001
che
istituisce
Su proposta della Sotto-Commissione dei metodi di analisi e di valutazione dei vini,
DECIDE di completare l’Allegato A della Raccolta dei metodi internazionali di analisi dei
vini e dei mosti con il seguente metodo e di adottarlo come metodo di tipo II:
Titolo
DETERMINAZIONE DELLA SOMMA DI GLUCOSIO E DI
FRUTTOSIO NEI VINI
TRAMITE pH-METRIA DIFFERENZIALE
1.
Tipo de Metodo
III
PORTATA E CAMPO D’APPLICAZIONE
Questo metodo è applicabile all’analisi del glucosio e del fruttosio nei vini tra 0 e 60 g/L
(livello medio) o tra 50 e 270 g/L (livello elevato).
2.
PRINCIPIO
La determinazione della somma di glucosio e di fruttosio tramite ph-metria differenziale
consiste in fosforilazione del glucosio e del fruttosio tramite esochinasi. Vengono in
seguito quantificati gli ioni H+ generati in modo stechiometrico in rapporto alle quantità di
glucosio e di fruttosio.
3.
REAZIONI
Il glucosio ed il fruttosio presenti sono fosforilati tramite l’adenosin-trifosfato (ATP)
durante una reazione enzimatica catalizzata con l’esochinasi (HK) (EC 2.7.1.1)
glucosio + ATP
fruttosio + ATP
HK
HK
glucosio-6-fosfato + ADP + H+
fruttosio-6-fosfato + ADP+ H+
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Federico CASTELLUCCI
1
4.
REAGENTI
4.1
Acqua demineralizzata (18 MΩ) o bidistillata
4.2
4.3
2-Amino-2-(idrossimetil)propano-1,3-diolo (TRIS) purezza ≥ 99%
Adenosina trifosfato disodica (ATP, 2Na) purezza ≥ 99%
4.4
Fosfato
purezza ≥ 99%
trisodico
con
dodici
molecole
d’acqua
(Na3PO4.12H2O)
4.5
Idrossido di Sodio (NaOH) purezza ≥ 98%
4.6
Cloruro di magnesio con sei molecole d’acqua (MgCl2.6H2O) purezza ≥ 99%
4.7
Triton X 100
4.8
Cloruro di potassio (KCl) purezza ≥ 99%
4.9
2-Bromo-2-nitropropano-1,3-diolo (Bronopol) (C3H6BrNO4)
4.10 Esochinasi (EC 2.7.1.1) 1 mg ≅ 145 U (da Hofmann La Roche, Mannheim,
Germania rif. HEXO-70-1351)
4.11
Glicerolo purezza ≥ 98%
4.12
Glucosio purezza ≥ 99%
4.13 Tampone di reazione pH 8,0 commerciale o preparato secondo il seguente
metodo: in un matraccio graduato da 100 mL (5.2) versare approssimativamente 70 mL
(5.3) d’acqua (4.1), agitare continuamente (5.5). Aggiungere 0,242 g ± 0,001 g (5.4) di
TRIS (4.2), 0,787 g ± 0,001 g (5.4) di ATP (4.3), 0,494 g ± 0,001 g (5.4) di fosfato di
sodio (4.4), 0,009 mg ± 0,001 g (5.4) d’idrossido di sodio (4.5), 0,203 g ± 0,001 g (5.4)
di cloruro di magnesio(4.6), 2,000 ± 0,001 g (5.4) di Triton X 100 (4.7), 0,820 g ± 0,001
g (5.4) di cloruro di potassio (4.8) e 0,010 ± 0,001 g (4.9) di Bronopol. Portare a livello
con acqua (4.1). Il pH finale deve essere di 8,0 ± 0,1 (5.6), altrimenti aggiustare con
idrossido di sodio o acido cloridrico. Il tampone così preparato è stabile per 2 mesi a 4°C.
4.14 Soluzione enzimatica commerciale o preparata secondo il seguente metodo:
con l’aiuto di una pipetta graduata (5.7) mettere 5 mL di glicerolo (4.11) in un matraccio
graduato da 10 mL, portare a livello con acqua (4.1) e omogeneizzare. Sciogliere 20 mg
± 1 mg (5.4) di esochinasi (4.10) e 5 mg di Bronopol (4.9) in 10 mL della soluzione di
glicerolo. L’attività della soluzione enzimatica deve essere di 300 U ± 50 U al mL per
l’esochinasi. La soluzione enzimatica è stabile per 6 mesi a 4°C.
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4.15 Preparazione della soluzione di verifica (livello medio) se il tenore
presupposto è inferiore a 50 g/L di glucosio + fruttosio)
Mettere 3,60 g ± 0,01 g (5.4) di glucosio (4.12) (preventivamente essiccato per 12 ore a
40°C fino al peso costante), 0,745 g ± 0,001 g (5.4) di cloruro di potassio (4.8) e 0,010 g
± 0,001 g (4.9) di Bronopol in un matraccio graduato da 100 mL (5.2). Aggiungere acqua
(4.1). Omogeneizzare bene (5.5). Portare a livello con acqua (4.1) dopo aver tolto la
barretta magnetica. La concentrazione finale è di 36 g/L di glucosio. La soluzione è
stabile per 6 mesi a 4°C.
4.16 Preparazione della soluzione di verifica (livello elevato) se il tenore
presupposto è superiore a 50 g/L di glucosio + fruttosio)
Mettere 18,0 g ± 0,01 g (5.4) di glucosio (4.12) (preventivamente essiccato per 12 ore a
40°C fino al peso costante), 0,745 g ± 0,001 g (5.4) di cloruro di potassio (4.8) e 0,010 g
± 0,001 g (4.9) di Bronopol in un matraccio graduato da 100 mL (5.2). Aggiungere acqua
(4.1). Omogeneizzare bene (5.5). Portare a livello con acqua (4.1) dopo aver tolto la
barretta magnetica. La concentrazione finale è di 180 g/L di glucosio. La soluzione è
stabile per 6 mesi a 4°C.
5.
APPARECCHIATURE
5.1
Apparecchio di pH-metria differenziale (EUROCHEM CL 10 plus, Microlab EFA
o equivalente) vedi allegato A
5.2
Matraccio graduato da 100 mL classe A
5.3
Provetta graduata a piede da 100 mL
5.4
Bilancia di precisione con divisione minima di 1 mg.
5.5
Agitatore magnetico e barretta magnetica in teflon
5.6
pH-metro
5.7
Pipette graduate da 3mL, 5 mL classe A
5.8
Matraccio graduato da 10 mL classe A
5.9
Pipette automatiche a pistone da 25 e 50 µL
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6.
PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
I campioni non devono essere troppo ricchi di materie in sospensione. In caso contrario,
centrifugarli o filtrarli. I vini frizzanti devono essere sgasati.
7.
MODO OPERATIVO
L’operatore deve rispettare le istruzioni di utilizzo dell’apparecchio (5.1). Prima dell’uso,
lo strumento deve essere stabilizzato in temperatura. I circuiti devono essere risciacquati
con la soluzione tampone (4.13) dopo l’eventuale pulitura.
7.1 Determinazione del bianco (determinazione del segnale dell’enzima)
Riempire i compartimenti elettrodi (EL1 e EL2) del pH-metro differenziale (5.1) con il
tampone (4.13), la differenza di potenziale tra i due elettrodi (D1) deve essere compresa
tra ± 150 mpH;
aggiungere 24 µL di soluzione enzimatica (4.14) nella camera di reazione (con la
micropipetta 5.9 o tramite il preparatore) e riempire l’elettrodo EL2;
misurare la differenza di potenziale (D2) tra i due elettrodi;
calcolare la differenza di pH, ∆pHo per il bianco, secondo il seguente calcolo:
∆pHo = D2 – D1
dove
∆pHo = la differenza di pH tra le due misure per il bianco;
D1 = valore della differenza di pH tra i due elettrodi riempiti con il tampone;
D2 = valore della differenza di pH tra i due elettrodi di cui uno è riempito con tampone e
l’altro con tampone ed enzima.
Il valore di ∆pHo permette di verificare lo stato degli elettrodi in fase di dosaggio e il loro
eventuale scostamento con il tempo; lo stesso deve essere compreso tra –30 e 0 mpH e
≤ 1,5 mpH tra due misure consecutive. In caso contrario, verificare la qualità del
tampone pH e la pulizia del circuito idraulico e degli elettrodi; pulire, se necessario,
quindi ripetere il bianco.
7.2
Test
7.2.1
Livello medio
Riempire i compartimenti elettrodi (EL1 e EL2) con il tampone (4.13);
aggiungere 25 µL (con la micropipetta 5.9 o tramite il preparatore) di soluzione campione
di glucosio (4.15) nella camera di reazione;
riempire gli elettrodi EL1 e EL2 con la miscela tampone + soluzione campione;
misurare la differenza (D3) di potenziale tra i due elettrodi;
aggiungere 24 µL di soluzione enzimatica (4.14) e riempire l’elettrodo EL2 con la miscela
tampone + soluzione campione + enzima;
dopo il tempo necessario per la reazione enzimatica, misurare la differenza di potenziale
(D4) tra i due elettrodi;
calcolare la differenza di pH, ∆pHc per il campione testato secondo il seguente calcolo:
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∆pHc = (D4 – D3) - ∆pHo
dove
∆pHc = la differenza di pH tra le due misure D3 e D4 per il campione testato meno la
differenza ottenuta per il bianco;
D3 = valore della differenza di pH tra i due elettrodi riempiti con la miscela
tampone/soluzione di riferimento;
D4 = valore della differenza di pH tra i due elettrodi di cui uno è riempito di
tampone/soluzione di riferimento e l’altro di tampone/soluzione di riferimento/enzima.
Calcolare la pendenza della retta del test:
s = Cu/∆pHc
dove
Cu è la concentrazione di glucosio nella soluzione campione espressa in g/L.
Verificare la validità della campionatura analizzando 25 µL di soluzione campione (ML) di
glucosio (4.15) seguendo la procedura (7.3). Il risultato deve essere compreso tra ± 2%
del valore di riferimento. In caso contrario ricominciare la procedura di calibrazione.
7.2.2
Livello elevato
Riempire i compartimenti elettrodi (EL1 e EL2) con il tampone (4.13);
aggiungere 10 µL (con la micropipetta 5.9 o tramite il preparatore) di soluzione campione
di glucosio (4.16) nella camera di reazione;
riempire gli elettrodi EL1 e EL2 con la miscela tampone + soluzione campione;
misurare la differenza (D3) di potenziale tra i due elettrodi;
aggiungere 24 µL di soluzione enzimatica (4.14) e riempire l’elettrodo EL2 con la miscela
tampone + soluzione campione + enzima;
dopo il tempo necessario per la reazione enzimatica, misurare la differenza di potenziale
(D4) tra i due elettrodi;
calcolare la differenza di pH, ∆pHc per il campione testato secondo il seguente calcolo:
∆pHc = (D4 – D3) - ∆pHo
dove
∆pHc = la differenza di pH tra le due misure D3 e D4 per il campione testato meno la
differenza ottenuta per il bianco;
D3 = valore della differenza di pH tra i due elettrodi riempiti con la miscela
tampone/soluzione di riferimento;
D4 = valore della differenza di pH tra i due elettrodi di cui uno è riempito di
tampone/soluzione di riferimento e l’altro di tampone/soluzione di riferimento/enzima.
Calcolare la pendenza della retta del test:
s = Cu/∆pHc
dove
Cu è la concentrazione di glucosio nella soluzione campione espressa in g/L.
Verificare la validità della campionatura analizzando 10 µL di soluzione campione (HL) di
glucosio (4.16) seguendo la procedura (7.3). Il risultato deve essere compreso tra ± 2%
del valore di riferimento. In caso contrario ricominciare la procedura di calibrazione.
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7.3 – Quantificazione
Riempire i compartimenti elettrodi (EL1 e EL2) con il tampone (4.13)
aggiungere 10 µL (livello elevato) o 25 µL (livello medio) (con la micropipetta 5.9 o
tramite il preparatore) di campione nella camera di reazione;
riempire gli elettrodi EL1 e EL2 con la miscela tampone + campione:
misurare la differenza (D5) di potenziale tra i due elettrodi;
aggiungere 24 µL di soluzione enzimatica (4.14) e riempire l’elettrodo EL2 con la miscela
tampone + campione + enzima:
misurare la differenza di potenziale (D6) tra i due elettrodi;
calcolare la quantità di soluto nel campione secondo il seguente calcolo:
w = s × [(D6 – D5) - ∆pHo]
dove
w =la quantità di soluto nel campione (in g/L);
S è la pendenza determinata dalla retta di calibrazione;
∆pHo = la differenza di pH tra le due misure per il bianco;
D5 = valore della differenza di pH tra i due elettrodi riempiti con il campione/soluzione di
riferimento;
D6 = valore della differenza di pH tra i due elettrodi di cui uno è riempito con
tampone/campione e l’altro con tampone/campione/enzima.
8.
ESPRESSIONE DEI RISULTATI
I risultati sono espressi in g/L di glucosio + fruttosio con una cifra significativa dopo la
virgola.
9.
PRECISIONE
I dettagli del test interlaboratorio che riguardano la precisione del metodo sono riassunti
nell’allegato B.
9.1
RIPETIBILITÀ
La differenza assoluta tra due singoli risultati ottenuti su un materiale identico sottoposto
a test da un operatore che utilizza la stessa apparecchiatura, nel più breve intervallo di
tempo possibile, non deve superare il valore di ripetibilità r nel 95% dei casi.
Il valore è: r = 0,021x + 0,289 dove x è il tenore in g/L di glucosio + fruttosio.
9.2
RIPRODUCIBILITÀ
La differenza assoluta tra due singoli risultati ottenuti su un materiale identico sottoposto
a test in due laboratori, non deve superare il valore di riproducibilità R nel 95% dei casi.
Il valore è: R = 0,033x + 0,507 dove x è il tenore in g/L di glucosio + fruttosio.
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10. ALTRE CARATTERISTICHE DELL’ANALISI
10.1 Limiti di rilevamento e di quantificazione
10.1.1 Limite di rilevamento
È determinato a partire da 10 serie di tre ripetizioni di un bianco analitico e dalla
regressione lineare realizzata con i vini del test di precisione, ed è pari a tre scarti
quadratici medi. In tal caso il metodo darà come risultato un limite di rilevamento di
0,03 g/L. Test mediante diluizioni successive hanno confermato tali valori.
10.1.2 Limite di quantificazione
È determinato a partire da 10 serie di tre ripetizioni di un bianco analitico e dalla
regressione lineare realizzata con i vini del test di precisione, ed è pari a dieci scarti
quadratici medi. In tal caso il metodo darà come risultato un limite di rilevamento di
0,10 g/L. Test mediante diluizioni successive hanno confermato tali valori. Le
quantificazioni di vini bianchi e rossi realizzate dai laboratori che hanno partecipato
all’analisi interlaboratorio confermano parimenti tali cifre.
10.2 ESATTEZZA
L’esattezza è valutata a partire dal tasso di sovrapposizione medio calcolato dei vini con
aggiunte analizzati in doppio cieco durante il test interlaboratorio (vini A, B, C, D, F e J).
Essa è del 98,9% con un intervallo di affidabilità dello 0,22%.
11. CONTROLLO QUALITÀ
Possono essere compiuti controlli di qualità con materiali di riferimento certificati, vini le
cui caratteristiche hanno riscosso un consenso o vini con aggiunte inseriti regolarmente
nelle serie analitiche seguendo le relative schede di controllo.
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Allegato A
Schema dell’apparecchio di pH-metria differenziale
P
A
S
EL
D
K
EL 1
P1
EL 2
P2
C
P3
G
M
B
W
A: amplificatore differenziale; B: soluzione tampone; C: camera di miscela;
D: indicatore; EL1 ed EL 2 elettrodi capillari; EL: parte elettronica; G: messa a terra; K:
tastiera; M: agitatore magnetico; P: stampante; da P1 a P3: pompe peristaltiche; S:
siringa d’iniezione del campione e dell’enzima ; W: scarico.
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Allegato B
Dati statistici ottenuti a partire dai risultati dei test interlaboratorio
Conformemente allo standard ISO 5725-2:1994, i parametri seguenti sono stati definiti nel corso di un
test interlaboratorio. Tale test è stato condotto dal laboratorio del Comité Interprofessionnel du Vin di
Champagne a Epernay (Francia).
Anno del test interlaboratorio: 2005
Numero di laboratori: 13 in doppio cieco
Numero di campioni: 10
Vino A
Vino B
Vino C
Vino D
Vino E
Vino F
Vino G
Vino H
Vino I
Vino J
Media in g/L
8.44
13.33
18.43
23.41
28.03
44.88
86.40
93.34
133.38
226.63
Numero di laboratorio
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
numero di laboratorio dopo
eliminazione delle maggiori
dispersioni
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
scarto quadratico
di ripetibilità
0.09
0.13
0.21
0.21
0.29
0.39
0.81
0.85
1.19
1.51
limite di ripetibilità
0.27
0.38
0.61
0.62
0.86
1.14
2.38
2.51
3.52
4.45
RSDr, 100%
1.08
0.97
1.13
0.91
1.04
0.86
0.94
0.91
0.89
0.67
HORRAT r
0.26
0.25
0.31
0.26
0.30
0.27
0.32
0.32
0.33
0.47
scarto quadratico
di riproducibilità
0.17
0.27
0.37
0.59
0.55
0.45
1.27
1.43
1.74
2.69
limite di riproducibilità
0.50
0.79
1.06
1.71
1.60
1.29
3.67
4.13
5.04
7.78
RSDR, 100%
2.05
2.05
1.99
2.54
1.97
1.00
1.47
1.53
1.31
1.19
HORRAT R
0.50
0.54
0.55
0.72
0.58
0.31
0.51
0.53
0.48
0.47
Tipi di campioni:
Vino A: vino bianco contenente di per sé zucchero, con aggiunta di 2,50 g/L di glucosio e
2,50 g/L di fruttosio;
Vino B: vino bianco contenente di per sé zucchero (vino A), con aggiunta di 5,00 g/L di glucosio e 50 g/L di fruttosio;
Vino C: vino bianco contenente di per sé zucchero (vino A), con aggiunta di 7,50 g/L di glucosio e 7,50 g/L di fruttosio
Vino D: vino bianco contenente di per sé zucchero (vino A), con aggiunta di 10,0 g/L di glucosio e 10,0 g/L di fruttosio;
Vino E: vino aromatizzato;
Vino F: vino bianco contenente di per sé meno di 0,4 g/L di zucchero, con aggiunta di 22,50 g/L di glucosio e 22,50 g/L
di fruttosio;
Vino G: vino rosso naturalmente dolce;
Vino H: vino bianco dolce;
Vino I: mistelle;
Vino J: vino bianco contenente di per sé meno di 0,4 g/L di zucchero, con aggiunta di 115,00 g/L di glucosio e
115,00 g/L di fruttosio;
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BIBLIOGRAFIA
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MOSCA A., DOSSI G., LUZZANA M., ROSSI-BERNARDI L., FRIAUF W. S., BERGER R.L.,
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MOIO L., GAMBUTI A., Di MARZIO L. e PIOMBINO P. (2001): Differential pHmeter
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1199, 5 pages.
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