Malattie Genetiche
Classificazione
????????????
•
GCGGCGGCGGGCGGGTACTGGCTTCTGGGGCCAGGGGCCAGGGGCGGTGGGCGCCGGGACCGCGGAGCTGAGGA
GCGGGGCCCGGCCAGGGCTGGAGACTTTGCGCCCGGGGGCACCGGGGCTGCGCGCGGTCGCACACATCCACCGGC
GCGGCTTCCCTCGGCGGCCCGGGCTCCGCTCATCCTGCGGCGGGCGGCGCCGCTCAGGGGCGGGAAGAGGAGGCG
ATGTCGGGCCAAACGCTCACGGATCGGATCGCCGCCGCTCAGTACAGCGTTACAGGCT
GTAGACGCGACCACAGAAGATG
ATG
CTGCTGTAGCAAGAGCGGTCTGCAAAGCCACTACTCATGAAGTAATGGGCCCCAAGAAAAAGCACCTGGACTATTTGAT
CCAGGCTACCAACGAGACCAATGTTAATATTCCTCAGATGGCCGACACTCTCTTTGAGCGGGCAACAAACAGTAGCTGG
GTGGTTGTGTTTAAGGCTTTAGTGACAACACATCATCTCATGGTGCATGGAAATGAGAGATTTATTCAATATTTGGCTTC
TAGAAATACACTATTCAATCTCAGCAATTTTTTGGACAAAAGTGGATCCCATGGTTATGATATGTCTACCTTCATAAGGCG
CTATAGTAGATATTTGAATGAAAAGGCTTTTTCTTACAGACAGATGGCCTTTGATTTTGCCAGGGTGAAGAAAGGGGCC
GATGGTGTAATGAGGACAATGGCTCCCGAAAAGCTGCTAAAGAGTATGCCAATACTACAGGGACAAATTGATGCACTGC
TTGAATTTGATGTGCATCCAAATGAACTAACAAATGGTGTCATAAATGCAGCATTTATGCTTCTTTTCAAAGATCTTATCA
AACTTTTTGCTTGCTACAATGATGGTGTTATTAACTTACTCGAAAAGTTTTTTGAAATGAAGAAAGGACAATGTAAAGATG
CTCTAGAAATTTACAAACGATTTCTAACTAGAATGACACGAGTGTCTGAATTTCTCAAGGTTGCAGAGCAAGTTGGTATT
GATAAAGGTGACATTCCTGACCTCACACAGGCTCCCAGCAGTCTTATGGAGACGCTTGAACAGCATCTAAATACATTAG
AAGGAAAGAAACCTGGAAACAATGAAGGATCTGGTGCTCCCTCTCCATTAAGTAAGTCTTCTCCAGCCACAACTGTTAC
GTCTCCTAATTCTACACCAGCTAAAACTATTGACACATCCCCACCGGTTGATTTATTTGCAACTGCATCTGCGGCTGTCC
CAGTCAGCACTTCTAAACCATCTAGTGATCTCCTGGACCTCCAGCCAGACTTTTCCTCTGGAGGGGCAGCAGCAGCCG
CAGCACCAGCACCACCACCACCTGCTGGAGGAGCCACTGCATGGGGAGACCTTTTGGGAGAGGATTCTTTGGCTGCA
CTTTCCTCTGTTCCCTCTGAAGCACAGATTTCAGATCCATTTGCACCAGAACCTACCCCTCCTACTACAACTGCTGAAAT
TGCAACCACTACTGCTGCCACCGCCGCTGCCACCACCACTACCATTCATCTCTTGCCAGCTTAGTAGGCAATCTTGGAA
TTTCTGGTACCACAACAAAAAAGGGAGATCTTCAGTGGAATGCTGGAGAGAAAAAGTTGACTGGTGGAGCCAACTGGC
9
AGCCTAAAGTAGCTCCAGCAACCTGGTCAGCAGGCGTTCCACCAAGTGCACCTTTGCAAGGAGCTGTACCTCCAACCA
GTTCAGTTCCTCCTGTTGCCGGGGCCCCATCGGTTGGACAACCTGGAGCAGGATTTGGAATGCCTCCTGCTGGGACAG
GCATGCCCATGATGCCTCAGCAGCCGGTCATGTTTGCACAGCCCATGATGAGGCCCCCCTTTGGAGCTGCCGCTGTAC
CTGGCACGCAGCTTTCTCCAAGCCCTACACCTGCCAGTCAGAGTCCCAAGAAACCTCCAGCAAAGGACCCATTAGCGG
ATCTTAACATCAAGGATTTCTTGTAAACAATTTAAGCTGCAATATTTGTGACTGAATAGGAAAATAAATGAGTTTGGAGAC
TTCAAATAA
TAAGATTGATGCTGAGTTTCAAAGGGAGCCACCAGTACCAAACCCAATACTTACTCATAACTTCTCTTCCAAAAT
TAA
GTGTAACACAGCCGTGAAAGTGAACATTAGGAATATGTACTACCTTAGCTGTTATCCCTACTCTTGAAATTGTAGTGTAT
TTGGATTATTTGTGTATTGTACGATGTAAACAATGAATGGATGTTACTGATGCCGTTAGTGCTTTTTTGGACTTCACCTGA
GGACAGATGATGCAGCTGTTGTGTGGCGAGCTATTTGGAAAGACGTCTGTGTTTTTGAAGGTTTCAATGTACATATAAC
TTTTGAACAAACCCCAAACTCTTCCCATAAATTATCTTTTCTTCTGTATCTCTGTTACAAGCGTAGTGTGATAATACCAGA
6
6
TAATAAGGAAAACACTCATAAATATACAAAACTTTTTCAGTGTGGAGTACATTTTTCCAATCACAGGAACTTCAACTGTTG
TGAGAAATGTTTATTTTTGTGGCACTGTATATGTTAAGAAATTTTATTTTAAAAAATATAAAGGTTAACGTCCATAATAAAT
ACTTCTCTTTGAAGCTACCTTATCAAGAACGAAAAATCGTATGGGAAGAATCCCCTATTTATCACTGCTATATTAAAATAT
ATATATTTTAATTATATTTGACAGGTTTTGCATCTAAATTGACCTATTTATTCATTCTTGATTAAATGCACTGAAAAGTAAAA
TTTAAAAGTGGTTGTATCTGAATTTACTGTGGGGATAACATACACTGTAATGGGGAAAAATTACCTAAAACCAATTTCAAA
ATGGCTTTCTTTGTATTTCAGTTTAAAAACCCAGTGCATGTACGCCCTCTGAGATGCAATAAACACCTTGAACAAAG
3*10 bp
150*10 bp
1-5*10 bp
• Tipo cellulare
• Numero di geni
• Funzione del gene interessato
Mutazioni somatiche e germinali
Mutazioni germinali
•Mutazioni geniche
•Alterazioni complesse del genoma
(mutazioni cromosomiche)
Fenotipi Complessi
•Cancro
•Malattie degenerative
Mutazioni somatiche – mutazioni germinali – molti geni coinvolti
Presenti nello zigote
Alterazioni di un singolo gene
Malattie ad eredità Mendeliana
This database is a catalog of human genes and genetic disorders authored and
edited by Dr. Victor A. McKusick and his colleagues at Johns Hopkins and
elsewhere,
and developed for the World Wide Web by NCBI, the National Center for
Biotechnology Information.
The database contains textual information and references.
It also contains copious links to MEDLINE and sequence records in the Entrez
system, and links to additional related resources at NCBI and elsewhere.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=OMIM
Il cancro è una malattia genetica.
Differentemente da altre malattie genetiche, a trasmissione
mendeliana oppure ad eziologia multifattoriale,
esso è principalmente causato da mutazioni de novo che avvengono
nel genoma di cellule somatiche.
11
12
13
Figure 20-11 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
14
15
Figure 20-20b Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
16
Figure 20-2 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Quali sono i geni le cui mutazioni possono
contribuire all’insorgenza del
fenotipo neoplastico ?
17
18
Fattori di crescita
Recettori per i fattori di
crescita
Proteine coinvolte
trasduzione del segnale
Fattori di trascrizione
Proteine pro- apoptotiche
19
oppure anti-apoptotiche
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Figure 20-14 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Geni coinvolti nell’insorgenza e nella progressione della neoplasia
Protooncogeni
Oncosoppressori
Geni codificanti proteine coinvolte nella
riparazione del DNA
21
What are the genes responsible for tumorigenic cell growth?
Normal
Proto-oncogenes
+
Cell growth and proliferation
Tumor suppressor genes
-
Cancer
Mutated or “activated”
oncogenes
++
Malignant transformation
Loss or mutation of
Tumor suppressor genes
22
23
Le mutazioni dei protooncogèni (che diventano oncogèni) alterano la
struttura e le funzioni del gene, e della proteina codificata,
in modo tale da determinare un cambiamento del fenotipo anche in
condizione di eterozigosi (gain of function mutations):
si comportano, quindi, in maniera dominante.
24
D’altra parte, le mutazioni dei geni oncosoppressori (cioè, geni che
modulano negativamente la proliferazione cellulare),
causano perdita della funzione del gene e della proteina codificata,
si comportano in modo recessivo (loss of function mutations).
25
La Predisposizione familiare
In alcuni tipi di tumori, gli individui affetti ereditano dai genitori
alcune delle mutazioni,
che possono contribuire all’insorgenza di un determinato fenotipo
neoplastico.
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Sporadic and familial (Mendelian) forms of cancer
Knudson’s two-hit hypothesis
Sporadic
Normal
tumor
suppressor
gene
Somatic
mutation
in one allele
Somatic
mutation
in other allele
Single tumors,
unilateral,
later-onset
• two mutations (two hits) are required for loss of tumor suppressor function
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Sporadic and familial (Mendelian) forms of cancer
Knudson’s two-hit hypothesis
Familial
Tumor suppressor gene
containing a germline
mutation in one allele heterozygous for the
mutation
Somatic
mutation
in other allele
Multiple tumors,
bilateral,
early-onset
• two mutations (two hits) are required for loss of tumor suppressor function
28
• the first “hit” is inherited and the second “hit” is somatic
29
30
31
Oncogenes in human tumors
Mechanisms of activation of proto-oncogenes
• point mutations
• chromosomal rearrangements or translocations
• gene amplifications
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1. Point mutations in a proto-oncogene that result in a
constitutively acting protein product
2. Localized reduplication (gene amplification) of a DNA
segment that includes a proto-oncogene, leading to
overexpression of the encoded protein
3. Chromosomal translocation that brings a growthregulatory gene under the control of a different promoter
and that causes inappropriate expression of the gene
33
An oncogene formed by the first mechanism encodes an oncoprotein
that differs slightly from the normal protein encoded by the
corresponding proto-oncogene.
In contrast, the latter two mechanisms, usually, generate oncogenes
whose protein products are identical with the normal proteins;
their oncogenic effect is due to their being expressed at higher-thannormal levels or in cells where they normally are not expressed.
34
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36
Cell-cycle dependent phosphorylation of Rb
Phosphorylation of Rb
allows cells to transit
the restriction point
and enter S phase
Hyperphosphorylated Rb
p
p
Rb
p
p
p
p
Restriction point
Rb
p
S
p
Rb
p
phase
p
G1
phase
G2
G0
M
Quiescent cells
p
Hypophosphorylated Rb
p
Rb
phase
phase
p
p
p
p
p
Rb
p
Rb
p
37
p
Il passaggio attraverso il punto di restrizione G0 richiede l’attività
del fattore E2F, il quale promuove la trascrizione di geni codificanti
le proteine necessarie per la duplicazione del DNA cellulare.
Questo fattore è attivato da Cdk2, Ciclina E e Ciclina A.
L’attività di E2F è inibita dal legame con la proteina Rb
ipofosforilata, presente durante la fase M. Le Cdk 4/6, la Ciclina D, e
successivamente la Cdk2 e la ciclina E, fosforilano Rb provocando
il rilascio e la conseguente attivazione di E2F
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39
40
41
Figure 20-40 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
42
I danni subiti dal DNA nucleare sono identificati da un sistema di
controllo, attivo durante G1 e G2, che si basa sulla attivazione di
p53, un fattore di trascrizione che stimola l’espressione di p21CIP.
Questo cyclin-kinase inhibitor (CKI) si lega ai complessi Cdk-Ciclina
e li inibisce, causando l’arresto del ciclo in G1 oppure in G2 finchè
il danno non sia stato riparato
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p53 is the “guardian of the genome”
• germline p53 mutations are found in Li-Fraumeni syndrome
• p53 is frequently found mutated in human tumors
• the p53 protein functions as a transcription factor that
regulates cell-cycle and DNA repair genes
• UV irradiation causes cell-cycle arrest in G1 that is dependent
on p53; cells that contain a mutated p53 cannot arrest
and go into S phase and replicate damaged DNA
• p53 loss-of-function mutations result in the replication of
cells with damaged DNA and to the further accumulation
of other mutations affecting oncogenes and tumor
suppressor genes, and to an increased
likelihood of cancer
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Functions of selected proto-oncogenes
Proto-oncogene
Biochemical property
1. Secreted growth factors
c-sis
Platelet derived growth factor
2. Growth factor receptors
c-erbB
Epidermal growth factor receptor
3. Signal transduction proteins
c-abl
c-src
H-ras
K-ras
Protein kinase
Protein kinase
Small G-protein
Small G-protein
4. Nuclear proteins
c-myc
c-fos
Transcription factor
Transcription factor
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Guadagno di funzione
Le mutazioni a carico delle proteine Ras costituiscono un tipico
esempio: infatti, una mutazione puntiforme nel gene, che codifica
per questa proteina, riduce la sua attività GTPasica rendendola
costitutivamente attiva.
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Ras family proteins
• the c-ras family contains three genes: H-ras, K-ras, and N-ras
• the Ras proteins encoded by these genes are small G-proteins
• the proteins transmit growth signals from cell surface receptors
• the Ras proteins are activated by binding GTP
• the proteins are inactivated by GTP to GDP hydrolysis
• mutations in the c-ras genes inactivate the Ras GTPase
• mutated Ras proteins are constitutively active
• constitutively active Ras proteins result in uncontrolled cell growth
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Amino acid substitutions in Ras family proteins
Ras gene
amino acid position
12
59
61
c-ras (H, K, N)
Gly
Ala
Gln
normal cells
H-ras
Gly
Val
Cys
Arg
Val
Gly
Gly
Ala
Ala
Ala
Ala
Ala
Ala
Ala
Leu
Gln
Gln
Gln
Gln
Lys
Arg
lung carcinoma
bladder carcinoma
lung carcinoma
lung carcinoma
colon carcinoma
neuroblastoma
lung carcinoma
K-ras
N-ras
Tumor
Murine sarcoma virus
H-ras
K-ras
Arg
Ser
Thr
Thr
Gln
Gln
Harvey strain
Kirsten strain
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Le ricerche sono state condotte sul cetuximab, un anticorpo monoclonale utilizzato
per il trattamento del cancro del colon-retto metastatico ed è stato individuato un
gene (KRAS) che predice l'efficacia di questa molecola sul paziente.
I risultati mostrano che il cetuximab funziona meglio nei pazienti che non
presentano mutazioni in questo marcatore.
Questa scoperta è un altro decisivo passo avanti verso la messa a punto di terapie
sempre più mirate e su misura per il paziente.
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50
Una mutazione puntiforme nel gene, che codifica per la
proteina Ras, riduce la sua attività GTPasica rendendola
costitutivamente attiva.
51
Cetuximab è un anticorpo
monoclonale che blocca il
recettore dell’EGF.
La proteina Ras si trova a valle
di EGFR, quindi anche bloccando
il recettore non si ottiene la
risposta desiderata (blocco della
proliferazione cellulare)
52
Ricerca delle mutazioni del gene K-Ras
nella biopsia del paziente
Codon
12
13
Mutation;
Aminoacid
change
Nucleotide substitution
GGT
TGT; G12C
G
T
GGT
GTT; G12V
G
T
GGT
GAT; G12D
G
A
GGT
GCT; G12A
G
C
GGT
AGT; G12S
G
A
GGT
CGT; G12R
G
C
GGC
GAC; G13D
G
A
53
Metodologia
Preparazione del DNA dalla biopsia
Amplificazione (PCR) della regione genomica
di interesse
Sequenziamento dei frammenti ottenuti
Saggi di discriminazione allelica mediante
Real-Time PCR
54
55
Chromosomal rearrangements or translocations
Neoplasm
Translocation
Proto-oncogene
Burkitt lymphoma
t(8;14) 80% of cases
t(8;22) 15% of cases
t(2;8)
5% of cases
c-myc1
Chronic myelogenous
leukemia
t(9;22) 90-95% of cases
bcr-abl2
Acute lymphocytic
leukemia
t(9;22) 10-15% of cases
bcr-abl2
1c-myc
is translocated to the IgG locus, which results in its activated expression
2bcr-abl fusion protein is produced, which results in a constitutively active abl kinase
56
La proteina, codificata da c-myc attiva la trascrizione di geni che
controllano la progressione del ciclo cellulare
dalla fase G1 alla fase S.
Normalmente, sia l’ mRNA trascritto dal protooncogene, che la
proteina sono molto instabili.
Le cellule il cui genoma contiene le mutazioni sono costitutivamente
indotte a proliferare.
57
sono tipiche le traslocazioni che interessano il cromosoma 8, dove è
localizzato il gene c-myc, ed uno dei tre cromosomi in cui sono
localizzati i geni che codificano per le catene pesanti e leggere delle
immunoglobuline.
La traslocazione più frequente è la [t (8:14)], che si riscontra nel
90% dei BL:
la traslocazione, spostando cMyc in prossimità dell’enhancer del
gene che codifica per una delle catene delle immunoglobuline, causa
la sua continua espressione e di conseguenza le cellule sono
costitutivamente stimolate a proliferare.
58
c-myc is translocated to the IgG locus,
which results in its activated expression
c-myc
IgG enhancer
IgG
c-myc is activated by
the IgG enhancer in
lymphocytes
bcr-abl fusion protein is produced,
which results in a constitutively active abl kinase
bcr
bcr-abl
abl
59
A chromosome translocation that forms
Bcr-Abl in a hematopoietic stem cell
forms the diagnostic “Philadelphia”
chromosome and results in the initial
chronic phase of human chronic
myelogenous leukemia (CML),
characterized by an expansion in the
number of well-differentiated
granulocytes, a type of white blood cell.
A second mutation in one such cell (e.g.,
in p53) leads to acute leukemia.
60
61
The chromosomal translocation results in fusion of a portion of the
bcr gene (whose function is unknown but whose N-terminal segment
forms a coiled-coil domain that links several bcr polypeptides
together) with part of the c-abl gene, which encodes a proteintyrosine kinase whose normal substrates are not known.
The chimeric polypeptides expressed from the resulting Bcr-Abl
oncogene form a tetramer that exhibits constitutive Abl kinase
activity.
Although Abl is normally localized to the nucleus, addition of the
Bcr segment causes the Bcr-Abl oncoprotein to be localized to the
cytosol.
Bcr-Abl binds to many intracellular signal-transduction proteins
and then phosporylates them, proteins that Abl would not normally
activate.
As a consequence, these signaling proteins become activated in
62 the
absence of growth factors.
63
microRNAs CAN FUNCTION AS TS AND OG
64
65
Affinché si sviluppi un tumore non è sufficiente la mutazione di un
singolo gene, bensì è necessario che si accumulino all’interno della
stesso genoma differenti mutazioni (il cui numero esatto varia in
dipendenza dello specifico tipo di neoplasia):
infatti, il controllo della proliferazione e del differenziamento
cellulare sono caratteristiche fenotipiche estremamente complesse e
multigeniche.
82
83
84
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86
Tumor cells differ from their normal counterparts in
many respects:
growth control, morphology, cell-to-cell interactions,
membrane properties, cytoskeletal structure,
protein secretion, and gene expression.
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How can researchers hope to identify and study all
the changes that occur in so many different
cancers?
How can they explain why some people respond to
treatment and not others?
How can they explain why some smokers get lung
cancer, and others do not?
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Figure 20-16 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
93
Figure 20-35a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
