DISS. ETH NO. 23419
FUNCTIONS OF HUMAN CACTIN IN PRE-mRNA
SPLICING AND CHROMOSOME STABILITY
A thesis submitted to attain the degree of
DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH
(Dr. sc. ETH Zurich)
presented by
ISABELLA MARTINA YVONNE ZANINI
MS sc. in Biology, University of Zurich, Switzerland
born on 09.02.1985
citizen of Bellinzona, Ticino, Switzerland
accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Claus M. Azzalin, examiner
Prof. Dr. Massimo Lopes, co-examiner
Prof. Dr. Vikram Panse, co-examiner
2016
SUMMARY
Cactin proteins are evolutionarily conserved, essential nuclear proteins
implicated in different molecular pathways apparently unrelated to each other,
including control of gene expression, inflammatory response, cell cycle
progression, development and embryogenesis, and pre-mRNA splicing. A
screen of a S. pombe deletion library performed in our laboratory identified
fission yeast Cactin (Cay1) as a regulator of telomeric chromatin. Further
analyses showed that Cay1 regulates telomere length and telomeric
transcription via stabilisation of the telomeric protein Rap1, principally by
promoting Rap1 pre-mRNA splicing. The C-terminal domain, which has been
shown to mediate protein-protein interactions in different organisms, is 46%
identical in Cay1 and human Cactin (hCactin), suggesting that Cay1 and
hCactin are orthologs. We show that hCactin is an essential nuclear protein
necessary for preserving genome stability, chromosome integrity and
promoting cell proliferation in human cells. Differently from its fission yeast
ortholog Cay1, hCactin does not participate in maintaining telomere
homeostasis in human cells. We provide evidence that hCactin sustains premRNA splicing and it physically interacts with the ATPase/RNA helicase
DHX8 and with the SR protein SRRM2. Importantly, these factors function
with hCactin in promoting pre-mRNA splicing of the cohesin regulatory factor
Sororin. Deregulated Sororin pre-mRNA splicing in hCactin-depleted cells
leads to cohesion loss and premature sister chromatid separation, as Sororin
overexpression in the same cells reverses these phenotypes. hCactin
depletion also leads to accumulation of DNA damage and impaired cell
proliferation independently of Sororin splicing defects. In addition, hCactin
physically interacts with the cullin protein CUL7 and enhances its stability.
hCactin interaction with a multitude of proteins involved in independent
cellular pathways is likely to explain the pleiotropic phenotypes observed upon
its depletion in human cells.
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RIASSUNTO
Le proteine della famiglia Cactin sono proteine essenziali conservate durante
l'evoluzione. Diversi studi hanno dimostrato il coinvolgimento di queste
proteine in processi molecolari apparentemente indipendenti tra loro, quali il
controllo dell'espressione genica, la risposta infiammatoria, la promozione del
ciclo cellulare, lo sviluppo e l'embriogenesi ed il processo di trasformazione
dell'acido ribonucleico precursore (pre-mRNA) nell'acido ribonucleico
messaggero (mRNA) mediante uno specifico meccanismo chiamato splicing
del pre-mRNA. Il nostro laboratorio, tramite lo screening di un'intera biblioteca
di soppressioni geniche nel lievito S. pombe, ha individuato la proteina Cactin
Cay1 quale regolatore della cromatina telomerica. Ulteriori analisi hanno
dimostrato che Cay1 regola lunghezza e trascrizione dei telomeri
stabilizzando la proteina telomerica Rap1, principalmente promuovendo il
processo di splicing. Alcuni studi hanno suggerito che la porzione terminale
della proteina Cactin possa promuovere l'interazione tra proteine in diversi
organismi. Questa regione è identica al 46% in Cay1 e nella proteina umana
Cactin (hCactin), suggerendo che Cay1 e hCactin siano ortologhi. In questa
tesi documentiamo che hCactin è una proteina nucleare necessaria alla
proliferazione cellulare e alla salvaguardia dell'integrità chromosomica e della
stabilità genomica nelle cellule umane. A differenza di Cay1, hCactin non
partecipa direttamente alla conservazione dell'omeostasi telomerica nelle
cellule umane. Forniamo invece prova della partecipazione di hCactin nella
promozione dello splicing del mRNA tramite l'interazione fisica con
l'ATPasi/RNA elicasi DHX8 e la proteina SRRM2. Nello specifico, queste
proteine sembrerebbero funzionare con hCactin nel promuovere lo splicing di
Sororin, una proteina che regola la coesione tra i cromatidi fratelli. Nelle
cellule umane con indotta insufficienza della proteina hCactin si osserva una
deregolamentazione del processo di splicing di Sororin e una conseguente
prematura separazione dei cromatidi fratelli. Per quanto l'overespressione di
Sororin compensi per la perdita di coesione, l'accumulazione di danni all'acido
deoxiribonucleico (DNA) e la compromissione della proliferazione cellulare
non sono compensati dal ripristino dei livelli di Sororin nelle cellule carenti di
hCactin. Dimostriamo inoltre che hCactin interagisce fisicamente con la
proteina Cullin7 promuovendone la stabilità. Proponiamo quindi che simili
interazioni tra hCactin e proteine coinvolte in diversi processi cellulari
spieghino i fenotipi pleiotripici associati all'insufficienza di hCactin nelle cellule
uman
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