Il ruolo del genetista nei
programmi di diagnosi prenatale
Dr.ssa Eva Pompilii
GynePro Medical Group
Bologna
U.O. Ostetricia e Ginecologia Policlinico S. Orsola
Malpighi Bologna
www.gynepro.it
Consulenza genetica.......
“ il ruolo del genetista clinico è quello di stabilire
(o verificare) una diagnosi accurata su cui basare
la consulenza e definire prognosi e follow-up,
identificare il rischio di trasmettere la malattia
ed le modalità con le quali questa può essere
prevenuta o controllata. Questo processo è di
tipo comunicativo e deve essere in grado di
fornire adeguato supporto nella comprensione del
significato della malattia genetica e sulle
conseguenti decisioni da affrontare” (mod. da
Kingston, 1994)
.........è un vero e proprio atto medico
CONSULENZA GENETICA PRENATALE
Positività/alterazione
combinato
test
Presenza di anomalie
all’esame cromosomico eseguito
su villi coriali/liquido amniotico
Presenza di malformazioni
all’ecografia
Rischio teratogeno in seguito
ad assunzione di
farmaci/esposizione a
radiazioni ionizzanti
Diagnosi prenatale
- Il riscontro di una condizione genetica (o
non genetica) nel feto non permette
generalmente alcuna terapia in utero
- Può, in alcuni casi, essere utile per una
migliore gestione del caso in epoca
neonatale
- Nella maggioranza dei casi, quindi, pone
la questione dell’interruzione (volontaria /
“terapeutica”) della gravidanza (L. 194/78)
Predizione ed incertezza
Non in tutti i casi la
diagnosi prenatale
genetica fornisce un
dato “incontestabile”
Predizione ed incertezza
Non in tutti i casi la diagnosi
prenatale genetica
“incontestabile” comporta una
prognosi “prevedibile”
(malattia/non malattia)
Mosaico cromosomico
Donna di 39 anni, si sottopone a villocentesi per
rischio età materna
Esito del cariotipo fetale: cariotipo maschile a
mosaico costituito da linea cellulare normale e da
linea cellulare primaria (16%)
Esegue Amniocentesi: 47,XY,+21[4]/46,XY[29]
(12%)
Esegue Funicolocentesi: 47,XY,+21[6]/46,XY[94]
(6%)
Counselling genetico: rischio Down 6% circa …?
Predizione ed incertezza
Non in tutti i casi la
certezza di malattia è
percepibile come una
disabilità “insopportabile”
Espressività variabile
Donna di 25 anni, si sottopone a CVS per
rischio di ricorrenza di neurofibromatosi di tipo
1 (50%). Il coniuge è affetto: presenta chiazze
caffè-latte multiple, un numero moderato di
neurofibromi (8), amartomi iridei.
La diagnosi prenatale conferma la presenza
della mutazione paterna.
Prognosi: ?
(50% disturbi di apprendimento; 10% tumori
maligni dei nervi periferici; 2% displasia tibiale;
2% glioma ottico sintomatico)
Anni‘60
MICROSCOPIA OTTICA:
osservazione diretta dei cromosomi
bandeggiati
con
colorazione
Giemsa. Limite di risoluzione di 510Mb (550 bande).
Anni‘80
FISH (Fluorescence In Situ Hybridization):
sonde
sito-specifiche,
marcate
con
fluorescenza. Necessarie informazioni a
priori
sulla
localizzazione
del
riarrangiamento. Risoluzione fino ad 1Mb
Anni‘90
CGH (Comparative Genomic Hybridization):
ibridazione competitiva di DNA genomico di
un paziente e di un controllo, frammentati e
marcati con un fluorocromo diverso, su
metafasi di un soggetto sano. Risoluzione di
qualche Kb.
Anni 2000
Cariotipo → FISH → CGH-array
analisi di sequenza
Singolo gene
Tutti gli esoni codificanti/ Intero genoma
CARIOTIPO STANDARD
→ Identifica anomalie strutturali bilanciate
e sbilanciate
(traslocazioni, inversioni, cromosomi ad anello,
isocromosomi, delezioni, duplicazioni)
e anomalie numeriche
ma
→ risoluzione di circa 5-8Mb
E’ POSSIBILE UNA
RISOLUZIONE CITOGENETICA
MAGGIORE?
La Citogenetica Molecolare
FISH
Permette un’analisi
mirata di una regione
cromosomica
consentendo di
mettere in evidenza
riarrangiamenti di
alcune centinaia di
chilobasi.
Tale identificazione avviene mediante sonde marcate impiegando fluorocromi che
emettono a diverse lunghezze d’onda.
Principali applicazioni diagnostiche della FISH
1. Diagnosi delle sindromi da microdelezione o da
microduplicazione
2. Studio delle delezioni subtelomeriche
3. Caratterizzazione di marker cromosomici
4. Caratterizzazione di riarrangiamenti cromosomici, sia
bilanciati che sbilanciati
5. Determinazione della percentuale di mosaicismi
cromosomici
L’ array CGH e’ una nuova tecnologia che consente
di evidenziare variazioni del numero di copie
nell’intero genoma
Cariotipo
-
Array CGH
risoluzione
+
CNV = Copy Number Variants = Copy Number Variation
Segmenti di DNA >1kb presenti nel genoma con un
numero variabile di copie (delezioni/duplicazioni)
La risoluzione elevata dell’ array CGH ha determinato una
maggiore identificazione di varianti complicando talvolta
l’interpretazione dei risultati
Il 5-10% del genoma umano e’variabile nel numero di copie
in individui NORMALI
http://projects.tcag.ca/variation/
La complessità del genoma rende difficile stabilire la natura delle CNVs:
differenze fenotipiche tra gli individui
ruolo evolutivo
patogenesi di malattie, sia mendeliane che
multigeniche
predisposizione ad alcune malattie
BENIGNE
PREDISPONENTI
PATOLOGICHE
CNV
Found in healthy individuals?*
BENIGN
PATHOGENIC
YES
NO
YES
YES
Region associated with a known
syndrome?
Parents tested?
AND/OR
NO
Disrupts gene(s) with a clear
functional link to phenotype?
UNCLEAR
CLINICAL
SIGNIFICANCE
(likely pathogenic)
YES
NO
YES
BENIGN
NO
Inherited from an
healthy parent?
* http://projects.tcag.ca/variation/
UNCLEAR
CLINICAL
SIGNIFICANC
E
Novel microdeletion/duplication syndromes:
Rearrangement
1
del / dup 1q21.1
Size
Phenotype
1.35 Mb
ASSOCIATED with variable pediatric
phenotype (MR, congenital anomalies,
autism)
2
del 1q21.1
500 kb
ASSOCIATED with TAR
(Thrombocytopenia Absent Radius)
syndrome
3
del 15q13.1-13.3
1.5-3.9 Mb
MR, dysmorphisms, epilepsy
4
del 15q24.1-q24.3
1.5-3.9 Mb
MR, multiple congenital anomalies
1.65Mb
MR, autism, dysmorphisms, behavioral
problems
(Rubinstein-Taybi region)
5
del / dup 16p13.3
6
del/dup 16p11.2
593 kb
ASSOCIATED with ASD, severe early-onset
obesity (incomplete penetrance and
variable phenotype
7
del / dup 17q12
1.45 Mb
Diabetes, renal disease, epilepsy
8
del 17q21.31
500 kb
MR, congenital anomalies, epilepsy
Quali possono essere le cause della presenza
di un quadro clinico in un individuo portatore di
un riarrangiamento de novo bilanciato?
-I punti di rottura del riarrangiamento
interrompono un gene che determina una malattia a
trasmissione autosomica dominante.
-Effetto di posizione.
-Problemi legati alla presenza di UPD.
-Il riarrangiamento è solo apparentemente bilanciato
ma nasconde una perdita o una acquisizione di
materiale genomico non visibile al cariotipo standard.
Limiti della consulenza in caso di
riarrangiamenti bilanciati de novo
Si può dare solo un rischio empirico
Non è possibile definire un fenotipo e
conseguentemente una prognosi
Tempi stretti… sono possibili caratterizzazioni
ulteriori a livello molecolare dei punti di rottura?
Se necessario offrire la ricerca della Disomia
Uniparentale
Caso clinico
Banda
cromosomica
Oligo non
deleto (Mb)
Inizio
delezione
(Mb)
Fine
delezione
(Mb)
Oligo non
deleto (Mb)
Dimensione
(Mb)
3q13.11q13.31
106,447
106,569
116,763
116,826
10,2
Feto con cariotipo
46,XX,t(3;10)(q27;q22)
(liquido amniotico)
Donna di 37 anni , PARA 2012
1° grav. Esegue tri test: pos
AF: dup 8 confermata con FISH
46,XY,?dup(8)(p23.2)ish(8)( wcp8+,D8S504+)
Eseguito cariotipo nei coniugi : signora portatrice medesima
duplicazione
Bimbo riferito in buona salute
2° grav. AF: dup 8 materna
Bimba riferita in buona salute
3° grav. Aborto spontaneo
4° grav. CVS in altro lab pertanto eseguita conferma cariotipo
sulla mamma
No duplicazione cr. 8
Eseguito Array-CGH: delezione interstiziale del braccio lungo
del cromosoma 7 a livello della banda
7q11.22
Eseguito Array su CVS: confermata delezione
gene AUTS2, variazioni nucleotidiche in tale gene, alcune delle
quali riguardanti solo regioni non codificanti, sono associate a
disordini dello spettro autistico (ASDs) e disordini neurologici,
quali deficit di attenzione, iperattività, epilessia, dislessia,
disturbi motori, ritardo del linguaggio, microcefalia e il consumo
di alcol.
Caso clinico
Donna di 33 anni, in buona salute, primigravida
Non consanguineità con il partner; storia
familiare negativa per ritardo mentale,
malformazioni congenite, poliabortività.
Villocentesi presso un centro privato senza
specifica indicazione:
Riscontro di traslocazione apparentemente
bilanciata tra cromosoma 1 e 8, con formula
46,XY,t(1;8)(p36.3;q24.1)
Cariotipo dei genitori nella norma (traslocazione
de novo)
Effettuato array-CGH con risoluzione
media di 250 Kb su DNA fetale estratto
dai villi:
Riscontro di una delezione di circa 390Kb
nella regione 8q23.3q24.11 (a livello di uno
dei breakpoint), contenente un singolo gene
(EIF3H)
Quali implicazioni???
• EIF3H codifica per la subunità H del fattore di inizio traduzione EIF3.
• Ruolo cruciale nel processo di traduzione dell'mRNA in proteina ed è
infatti altamente conservato nel corso dell'evoluzione.
• Database: la delezione in questione non è descritta né come
polimorfismo né come associata a quadri patologici.
• Pubmed: attribuito un ruolo patogenetico all'over-espressione del gene,
ma solamente in associazione ad alcune forme tumorali (cancro colonrettale).
• Nessuna segnalazione riguardo la delezione/inattivazione del gene
nell'uomo...
• Un solo articolo associa l'inattivazione del gene a problemi nello
sviluppo embrionale su un modello animale (zebrafish), ma si tratta di
una loss of function completa, mentre la delezione nel caso in esame è in
eterozigosi...
Donna di 43 anni, in buona salute, quartigravida
Non consanguineità con il partner; storia familiare negativa per ritardo
mentale, malformazioni congenite, poliabortività.
I grav: nasce una bimba che muore a 6 mesi di vita con
diagnosi di RENE POLICISTICO RECESSIVO (25% rischio per
ogni gravidanza)
Test genetico nella bimba: conferma la diagnosi
Confermato stato di portatori nei genitori
II grav: CVS per cariotipo e diagnosi molecolare per Rene Policstico
Bimbo affetto da Rene Policistico Infantile e riscontro di Trisomia 21
III grav: aborto spontaneo
IV grav: in occasione del villo coriale riscontro ecografico di
Oloprosencefalia lobare; cvs mostra Trisomia 18 e l’analisi molecolare
mostra un feto affetto da Rene Policistico
Quale potrà essere la percezione del rischio per i signori???
Conclusioni
La diagnosi genetica prenatale:
a.
è un percorso individuale (= di coppia)
b.
non ammette generalizzazioni
c.
necessita di un’appropriata informazione
(counselling) pre- e post-test
d.
ha implicazioni differenti secondo la categoria di
malattie per cui viene richiesta
e.
avrà certamente importanti cambiamenti negli anni
futuri (più dati da gestire!)
Mente genetica
in un’era genomica
GRAZIE!!!
