Diapositiva 1

Seconda Università degli Studi di Napoli
DiSTABiF
Anno Accademico 2015-16
Corso di Laurea Magistrale in
SCIENZE DEGLI ALIMENTI E DELLA NUTRIZIONE UMANA
Insegnamento di
BIOCHIMICA e BIOTECNOLOGIE
degli ALIMENTI
Prof. Augusto Parente
Lezione 21
LIPASI
Le LIPASI (EC 3.1.1.x) comprendono un numeroso gruppo di enzimi idrolitici che
catalizzano la rottura di legami esterei di biomolecole quali:
-Trigliceridi
- Fosfolipidi
- Esteri del colesterolo e di vitamine
In base alla natura del substrato su cui agiscono possiamo quindi avere:
- Triacilglicerolo lipasi (vere lipasi)
- Fosfolipasi
- Sterolesterasi
- Retinil-palmitato lipasi
Le triacilglicerolo lipasi (EC 3.1.1.3) agiscono sul legame estereo dei
trigliceridi (acilgliceroli ), i lipidi alimentari più abbondanti:
Estere carbossilico + H2O
Alcool + un carbossilato
Esistono diverse categorie di specificità delle lipasi:
- Preferenza per specifici acidi grassi o classi di acidi grassi (a catena corta, media,
polinsaturi, ecc.);
- Regiospecifiche o stereoselettive (in genere sono specifiche per il C1 o C3, formando
così 2- monoacilgliceroli, con successiva parziale migrazione (“riallocazione posizionale”)
degli acidi grassi nelle posizioni 1 o 3.
Le lipasi catalizzano tre tipi di reazioni di reazione:
1- IDROLISI, quando la reazione avviene in largo eccesso di H2O
2- ESTERIFICAZIONE (SINTESI) in condizioni limitanti di H2O, in solventi quasi anidri;
3- TRANSESTERIFICAZIONE, in cui la l’acido viene scambiato con un altro
Sono enzimi ubiquitari, presenti in tutti gli organismi viventi.
Negli eucarioti, si ritrovano nei lisosomi o nello spazio extracellulare. Esse
intervengono nel metabolismo, nell’assorbimento e nel trasporto dei lipidi.
Negli eucarioti inferiori e nei batteri, le lipasi possono essere intracellulari o
essere secrete per degradare substrati lipidici presenti nell’ambiente.
In alcuni organismi patogeni le lipasi rappresentano addirittura dei fattori di
virulenza (es in Candida albicans (fungo), Helicobacter pylori (batterio gram
negativo), responsabili della patogenicità.
Le lipasi batteriche e fungine sono le più utilizzate a livello industriale come
biocatalizzatori in quanto sono molto resistenti, facili da produrre attraverso
processi di fermentazione e facili da estrarre dal brodo di coltura.
Lipasi da fonte vegetale (es. papaya, ananas, Euphorbia ed in particolare quelle
presenti nei semi in germinazione come ricino, olio di palma, colza) sono enzimi
biotecnologicamente molto interessanti perché agiscono enzimaticamente su
acidi grassi inusuali.
Alcune proprietà generali delle lipasi:
PM  da 20 a 60 kDa
Temperatura di esercizio  da 30°C a 60°C (> di 70°C negli
organismi estremofili)
pH ottimale  intorno a 9,0 (meno comuni sono le lipasi con pH
ottimale acido; es. lipasi pancreatica pH optimum 5,5 a 37 °C)
SUBSTRATI delle LIPASI
I substrati naturali delle lipasi sono i composti lipidici insolubili, che tendono
facilmente ad aggregare in soluzione acquosa.
Infatti, l’attività delle lipasi aumenta notevolmente quando la concentrazione del
substrato è superiore a quella limite di solubilità, con conseguente aggregazione.
Questa proprietà, nota fin dal 1958 (Sarda e Desnuelle),
differenza fondamentale tra le “lipasi” e le esterasi.
rappresenta la
Le ESTERASI idrolizzano il legame estereo di molecole solubili e seguono una
classica cinetica di Michaelis-Menten.
Le LIPASI catalizzano l'idrolisi dei trigliceridi all'interfaccia tra i substrati lipidici
“aggregati” e la fase acquosa.
PER QUESTO MOTIVO LE LIPASI SONO NOTE COME “ENZIMI INTERFACCIALI”.
Questo comportamento, conosciuto come attivazione interfacciale,
ha trovato una spiegazione quando, anni dopo, è stata determinata
la prima struttura tridimensionale di una lipasi.
In assenza dell’interfaccia lipide-fase acquosa infatti il sito attivo delle lipasi è
coperto da una struttura secondaria che lo rende inaccessibile al substrato.
Tale struttura “mobile” si composta come un coperchio e viene definita appunto
“LID” o “FLAP”,
In presenza di un’interfaccia idrofobica invece le lipasi subiscono un importante
riarrangiamento conformazionale:
il LID viene spostato ed il sito attivo passa ad una conformazione attiva,
accessibile al substrato.
Conformazione
chiusa
Conformazione
aperta
Il LID è una struttura anfipatica:
1. nella conformazione chiusa dell’enzima, la sua faccia idrofilica (in blu
nella Figura) è rivolta verso il solvente, mentre quella idrofobica (in
rosso) è diretta verso il core dell’enzima.
2. Quando l’enzima passa alla conformazione aperta, il LID si sposta e
prende contatto con una parte idrofilica dell’enzima, mentre la parte
idrofobica del LID viene esposta e lega il substrato.
Amminoacido
catalitico
A livello tridimensionale, le lipasi mostrano una struttura canonica comune nota
come ripiegamento a/b delle idrolasi
8 foglietti b centrali, tutti paralleli tranne il b2 che è antiparallelo;
i foglietti dal b3 al b8 sono collegati a 6 a-eliche.
Differenze da questo schema
riguardano il numero di
foglietti b, la presenza di
inserzioni e l’architettura dei
subdomi di binding del
substrato.
Conformazione
chiusa
Conformazione
aperta
Il database SCOP (http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop)
classifica le lipasi in 7 famiglie, sulla base della struttura
3D:
1. Acetilcolinesterasi-simili
2. Lipasi gastriche
3. Lipasi
4. Lipasi fungine
5. Lipasi batteriche
6. Dominio N-terminale delle lipasi pancreatiche
7. Cutinasi-simili
Acetilcolinesterasi
Lipasi gastrica umana
Lipasi pancreatica equina
legata alla colipasi
Lipasi da
Bacillus subtilis
Cutinasi
Il sito attivo è formato da una triade catalitica che comprende un nucleofilo (Ser),
un residuo acido (Asp/Glu) ed un’istidina (come nelle serin-proteasi, ma con un
diverso ordine dei residui nella struttura primaria):
Ser – His- Asp/Glu
Lipasi
Serin-proteasi
Ser - His – Asp
S209 H449 E341
S192
D102 H57
Altamente conservata è la presenza di un “gomito”, costituito da un ripiegamento
g (definito da un legame idrogeno tra il gruppo carbonilico di un amminoacido e il
gruppo ammidico dell‘amminoacido due residui più avanti nella sequenza), che
contiene il residuo di serina posizionato tra un foglietto b e un’a-elica.
Come già detto, gli enzimi lipolitici esplicano la loro azione catalitica
all’interfaccia tra la fase acquosa, in cui l’enzima è solubile, e la fase lipidica del
substrato.
Questo tipo di catalisi è un esempio di catalisi eterogenea.
Verger e Rietsh (1973 e 1977) hanno proposto un meccanismo catalitico per
questi enzimi formato da tre stadi.
Nel primo si ha l’adsorbimento dell’enzima, solubile in acqua, all’interfaccia.
E→Ea(dsorbito)
Il secondo è lo stadio catalitico vero e proprio, con formazione del complesso di
Michaelis-Menten.
Ea+S→EaS (complesso)
Infine, nel terzo stadio si forma il prodotto e si ha la rigenerazione dell’enzima
adsorbito.
EaS→Ea+P
IL MECCANISMO DI IDROLISI
1. Le caratteristiche nucleofile del residuo di Ser sono rafforzate dal trasferimento di un
protone all’His del sito catalitico, con la formazione di un ossianione che attacca il
gruppo carbonilico del legame estereo da idrolizzare. Si forma un intermedio
tetraedrico con una carica negativa sull’atomo di ossigeno carbonilico del legame
estereo, che è stabilizzata attraverso legami idrogeno con i gruppi NH (di Gly 124 e
Ala210 della catena principale dell’enzima. Il protone dell’His viene poi trasferito
all’ossigeno del legame estereo che viene tagliato e si forma un acil-enzima intermedio
(residuo di Ser dell’enzima esterificato con l’acido grasso del substrato).
2. La deacilazione dell’enzima avviene ad opera di una molecola d’acqua che idrolizza
l’intermedio covalente.
Alcune lipasi eucariotiche sono caratterizzate da caratteristiche addizionali,
dovute alla necessità di svolgere attività quali:
1. interazione con lipidi in condizioni sfavorevoli
2. interazione con le membrane
3. interazione con altre molecole
4. più raramente, regolazione
La lipasi pancreatica è uno di questi esempi meglio caratterizzato.
Essa è costituita da due domini collegati da una cerniera flessibile, un largo
dominio catalitico N-terminale e un dominio C-terminale b-sandwich, collegato al
caratteristico ambiente fisiologico in cui è attivo l’enzima.
L’azione della lipasi pancreatica è mediata dal legame con una proteina – la colipasi –
secreta dal pancreas.
Lipasi pancreatica equina
legata alla colipasi
La colipasi, con PM 10.000, che può essere considerato un cofattore, è una
proteina anfipatica capace di collegare la lipasi all’interfaccia lipidica e
stabilizzarla nella conformazione aperta attiva  il cofattore (colipasi) prende
contatto con la forma lid aperta (attiva) dell’enzima e con essa forma un larga
superficie idrofobica capace di interagire fortemente con l’interfaccia
acqua/lipide.
La colipasi inoltre impedisce ai sali biliari di legare l’enzima con effetto inibitorio.
Flap
Flap
APPLICAZIONI
1- ESTERIFICAZIONE
Le lipasi vengono utilizzate per la PRODUZIONE di un gran numero di esteri
importanti dal punto di vista commerciale, utilizzando la loro attività
ESTERASICA. Si riportano di seguito alcuni esempi.
Nome del composto
Uso
Lipasi
Acetato di isoamile
Aroma di banana
Candida antartica
Lipolase 100T
Butirrato di isoamile
Aroma di banana
A-Esteri aromatici
Isovalerato di isoamile (3-metil
butirrato)
Sapori di mela
Isobutil isobutirrato
Sapore di ananas
Metil benzoato
Sapore di frutti
esotici e di bacche
B- Fragranze
a-terpenil acetato
Flagranza di lavanda Thizomucor miehei
e bergamotto
Le lipasi sono inoltre utilizzate nell’industria lattiero-casearia per idrolizzare i
lipidi del latte, per:
- Favorire la formazione degli aromi nei formaggi
- Accelerare i processi di maturazione del formaggio
- La produzione di prodotti a base di formaggio
- Idrolizzare i grassi del burro e delle creme.
Gli acidi grassi prodotti dall’azione delle lipasi sui grassi del latte conferisce ai
formaggi, in particolar modo a quelli molli, il caratteristico aroma.
Lipasi che idrolizzano catene corte (C4, C6) : sapore tagliente, piccante
Lipasi che idrolizzano catene medie (C12, C14) : sapore saponoso, untuoso
Inoltre, gli acidi grassi rappresentano un substrato per la popolazione microbica
presente nel formaggio (si formano acetoacetati, b-chetoacidi, metilchetoni (es.
Penicillum glaucum, responsabile del sapore piccante dei formaggi erborinati) ,
esteri e lattoni).
2- INTERESTERIFICAZIONE
“Interesterificazione” è la tecnica utilizzata nell’industria per ridistribuire gli
acidi grassi nelle molecole dei trigliceridi.
In questo termine sono compresi:
1. Acidolisi  reazione tra un acido grasso e un gliceride, che introduce l’acido
nella molecola del gliceride al posto di quelli già presenti;
2. Alcolisi  reazione tra un alcool e un trigliceride che produce esteri diversi dai
gliceridi di partenza;
3. Transesterificazione  trasposizione degli acidi grassi o all’interno dei singoli
gliceridi di una sostanza grassa (intraesterificazione) o tra tutti i gliceridi
presenti in una miscela (interesterificazione).
Questo caso interessa l’industria degli oli e dei grassi, dal momento che le
trasposizioni possono determinare modificazioni che migliorano le
caratteristiche di un olio o di una miscela di oli e grassi.
La reazione di interesterificazione può essere effettuata utilizzando le lipasi,
che possono agire in maniera:
1. Aspecifica
2. Specifica per le posizioni 1 e 3 del trigliceride
3. Specifica per gli acidi grassi.
L’interesterificazione ha due settori di impiego:
1. Cambiamento o stabilizzazione della struttura
cristallina dei grassi 
i grassi alimentari sono caratterizzati da diverse
forme cristalline. Quelle più importanti nella
produzione dei grassi idrogenati, ad es. delle
margarine, sono le a, b’ e b (riportate in ordine
crescente di stabilità) e delle quali la b’ è
quella che conferisce le caratteristiche più
desiderate.
I cristalli b’ sono piccoli e riescono
ad incorporare anche la parte che
rimane liquida dell’olio dando alla
margarina un'apparenza lucida ed
una consistenza vellutata.
ES.
- Lo strutto cristallizza nella forma b a causa dell’elevato tenore di acido palmitico nella
posizione 2 dei trigliceridi insaturi, ma nella “randomizzazione” questa proporzione di
acido palmitico si riduce dal 64 al 24% e, di conseguenza, il prodotto interesterificato
cristallizza nella forma b’, con miglioramento delle sue caratteristiche;
- Le strutture cristalline delle margarine preparate con olio di girasole vengono stabilizzate
nella forma b’ per effetto dell’interesterificazione.
2. Cambiamento delle caratteristiche di fusione e di cristallizzazione di
singoli oli o miscele di oli 
il fatto che l’interesterificazione modifichi il punto di fusione dei grassi è
stato sfruttato per produrre margarine dietetiche:
-
con elevato contenuto di acidi grassi polinsaturi
prive o con un contenuto trascurabile di isomeri trans, oppure
per produrre grassi per pasticceria con caratteristiche di fusione idonee
al consumo degli alimenti ai quali sono destinati.