Reggio Emilia, 24 gennaio 2011 IMMUNITA` ED ESAMI DI

SCUOLAREGIONALE
REGIONALEDI
DIFORMAZIONE
FORMAZIONESPECIFICA
SPECIFICAIN
INMEDICINA
MEDICINA
SCUOLA
GENERALE--CORSO
CORSO2008-2011
2008-2011
GENERALE
IMMUNITA’ED
EDESAMI
ESAMIDI
DI
IMMUNITA’
LABORATORIO
LABORATORIO
Dott.ssaLaura
LauraAlbertazzi
Albertazzi
Dott.ssa
Dott.ssaMaria
MariaBrini
Brini
Dott.ssa
Reggio Emilia, 24 gennaio 2011
PROGRAMMA DI
DI OGGI
OGGI
PROGRAMMA
Il sistema immunitario
Immunità innata
Immunità specifica
Immunità cellulare (i linfociti T, B, NK)
Immunità umorale (gli Anticorpi)
La caratterizzazione dei linfociti e delle cellule
nelle infezioni e nei processi immunitari
nella patologia neoplastica
Gli anticorpi
come indicatori di malattia e di stato immunitario
come mezzi diagnostici nei test di laboratorio
IL SISTEMA
SISTEMA IMMUNITARIO
IMMUNITARIO
IL
•
Garantisce l’immunità innata Æ risposta precoce , ma aspecifica
Barriere naturali
Cellule ad attività fagocitica : polinucleati, macrofagi e NK
Proteine del sangue: C, mediatori dell’infiammazione, citochine
•
Garantisce l’immunità acquisita Æ risposta specifica ma più tardiva,
la memoria , il self e non self
Meccanismi cellulari dei linfociti T e B
Modula la produzione degli anticorpi
•
Terminata la reazione immunitaria di risposta i meccanismi immunitari
attivati vengono spenti
COOPERAZIONENEL
NELSISTEMA
SISTEMAIMMUNITARIO
IMMUNITARIO
COOPERAZIONE
•
Il sistema immunitario è costituito da una rete di componenti cellulari
solubili interagenti tra loro. La sua funzione è quella di distinguere le
entità presenti all’interno dell’organismo come ”self” o come “non-self”
e di eliminare quelle che appartengono al non-self (es: microrganismi,
neoplasie, trapianti, sostanze estranee, ecc.).
Per svolgere questo compito il sistema immunitario ha evoluto due
meccanismi: le difese naturali aspecifiche e l’immunità vera e propria,
le quali sono legate una all’altra e si influenzano reciprocamente.
Da Abbas – Lichtman – Pober, Immunologia
cellulare e molecolare
PRINCIPALIORGANI
ORGANILINFATICI
LINFATICIPRIMARI
PRIMARIEESECONDARI
SECONDARI
PRINCIPALI
Da Abbas – Lichtman – Pober, Immunologia
cellulare e molecolare
Da Abbas – Lichtman – Pober, Immunologia cellulare e molecolare
Da Abbas – Lichtman – Pober, Immunologia cellulare
e molecolare
• Le cellule coinvolte nelle risposte immunitarie specifiche
sono i linfociti, cellule accessorie specializzate che
partecipano alla attivazione linfocitaria e le cellule
effettrici che svolgono la funzione di eliminare l’Antigene
• I linfociti sono le uniche cellule in grado di riconoscere
specificatemente l’Ag e sono responsabili delle due
caratteristiche che definiscono le risposte immunitarie
specifiche :
- la SPECIFICITÀ e
- la MEMORIA
• Le cellule accessorie non esprimono recettori per l’Ag
clonalmente distribuiti,ma partecipano attivamente
all’avvio delle risposte immunitarie specifiche.
• Comprendono :
– Fagociti mononucleati
– Cellule dendritiche
– Cellule follicolari dendritiche
Da Abbas – Lichtman – Pober,
Immunologia cellulare e molecolare
Da Abbas – Lichtman – Pober,
Immunologia cellulare e molecolare
• I linfociti T riconoscono Ag estranei solo quando i peptidi da
essi derivati siano legati a molecole MHC autologhe
• I linfociti CD4+ riconoscono peptidi legati a molecole MHC di
classe II (peptidi derivati da proteine extracellulari
internalizzati nelle vescicole endocitiche delle APC)
• I linfociti CD8+ riconoscono peptidi legati a molecole MHC di
classe I, (peptidi derivati da molecole citosoliche in genere di
derivazione endogena- cioè sintetizzate dalla stessa APC)
• Nel timo a partire da precursori CD4+ CD8+, si sviluppano
cellule ristrette per classe II che esprimono solo CD4 , e di
cellule ristrette per classe I che esprimono solo CD8
• I CD 4 sono linfociti T helper la cui funzione principale è la
secrezione di citochine e la difesa dell’ospite da microbi
extracellulari
• I CD8 sono CTL deputati a eradicare le infezioni dovute a
microbi intracellulari e ad uccidere delle cellule bersaglio
infettate e le cellule tumorali
• I linfociti B sintetizzano e secernono anticorpi , alcuni sono
riconoscibili come plasmacellule
COMPLESSO MAGGIORE DI
ISTOCOMPATIBILITA’ (MHC)
• Il riconoscimento del self dal non-self è in larga parte
determinata dai prodotti del MHC, i cui geni si trovano
sul cromosoma 6, appartengono alla superfamiglia dei
geni delle Ig e sono soggetti a ricombinazione genica.
• I prodotti del MHC di classe I (HLA-A,-B, e –C) sono
ampiamente distribuiti nell’organismo e sono presenti
sulla superficie di tutte le cellule nucleate e sulle
piastrine.
• I prodotti del MHC di classe II (HLA-D,-DR,-DP, DQ) hanno una distribuzione più limitata sulle cellule
B, sui macrofagi, sulle cellule dendritiche, sulle cellule
di Langerhans e sulle cellule T attivate (ma non su
quelle quiescenti).
.
Maturazione linfocitaria
• Processo che porta i linfociti progenitori ad
esprimere recettori per l’antigene altamente
diversificati, in grado di riconoscere e rispondere ad
una vastissima gamma di molecole estranee e non
rispondere agli antigeni self.
• Le fasi precoci della maturazione delle cellule T e B
sono caratterizzare da una elevata attività mitotica
con marcata espressione numerica della progenie dei
relativi precursori in modo da ottenere un numero
di cellule abbastanza ampio da permettere la
creazione di un repertorio altamente diversificato di
linfociti antigene-specifici
• Ogni clone di linfociti T e B produce un recettore per
l’antigene assolutamente unico
• La generazione del gran numero di recettori antigenici
diversi espressi sulla membrana dei linfociti T e B avviene
tramite un processo di ricombinazione somatica dei geni
mediante il quale un piccolo numero di sequenze di DNA
presenti nella linea germinativa, inizialmente separate tra
loro, vengono variamente ricongiunte in una serie pressochè
infinita di combinazioni, grazie all’eliminazione, da parte di
speciali enzimi, dei segmenti tra loro interposti
(ricombinazione VDJ )
• Tale ricombinazione non dipende e non è influenzata dalla
presenza dell’antigene e quindi i recettori antigenici vengono
espressi prima dell’incontro con l’antigene
• Nel corso di maturazione linfocitaria viene espresso prima un
recettore immaturo, che poi matura nel linfocia maturo; se il
processo di ricombinazione somatica dei geni dei recettori
antigenici non riesce a generare un gene funzionante per le Ig
o TCR le cellule muoiono per apoptosi
• Dopo che i linfociti immaturi hanno espresso il
recettore per l’Ag, le cellule “utili” vengono
salvaguardate mentre quelle inutili o
potenzialmente dannose, perché in grado di
riconoscere antigeni autologhi, vengono eliminate
(selezione“ positiva” o “ negativa”)
• Selezione positiva : salvaguardia i linfociti dotati
di specificità utili
• Selezione negativa: elimina i linfociti in via di
maturazione reattivi verso costituenti antigenici
autologhi presenti negli organi linfoidi primari
• Il riconoscimento specifico dell’Ag è
determinante per l’attivazione linfocitaria.
• E’ affidato a due glicoproteine,
strutturalmente simili, ed espresse dai
linfociti:
9 gli Ab espressi sulla membrana per i
Linfociti B
BCR
9 il Recettore per l’Ag per i Linfociti T
TCR
Linfociti Gamma-Delta
•
•
•
•
•
TCR γ/δ è un recettore associato alle catene del CD3 espresso in una
sottopopolazione di cellule T scarsamente rappresentata. Questi
linfociti in genere non esprimono né CD4 né CD8, mostrano molte
delle attività dei linfociti CD3 α/ß ( secrezione di citochine e lisi cellule
bersaglio). Espressi nel 5% circa dei linfociti T ma variabili a seconda
dei tessuti
Non riconoscono peptidi in associazione con molecole MHC e quindi
non sono soggetti alla restrizione MHC
I linfociti con TCR α/ß e quelli con TCR γ/δ appartengono a due
diverse e separate linee differenziative, derivate da un unico
precursore midollare e anch’essi maturano a livello timico. Le cellule
che esprimono un recettore non esprimono l’altro
Il numero dei linfociti γ/δ è molto limitato ( anche se in teoria
dovrebbe essere maggiore) perchè nella cellula matura viene usata
sono un numero molto limitato dei segmenti genici V,D e J disponibili
per locus ( da qui l’ipotesi che tali cellule funzionino come primo
argine di difesa per un numero molto limitato di microbi a larga
diffusione comunemente incontrati lungo le barriere epiteliali)
Neoplasie a linfociti γ/δ
IMMUNITA’UMORALE
UMORALE
IMMUNITA’
ANTICORPIEEIMMUNOGLOBULINE
IMMUNOGLOBULINE
ANTICORPI
Metodi di studio di routine :
• Elettroforesi
• Immunoelettroforesi e immunofissazione
• Tecniche immunometriche di dosaggio
Mc Pherson – Pincus, Henry’s Diagnosi clinica e
metodi di laboratorio
Mc Pherson – Pincus, Henry’s Diagnosi clinica e
metodi di laboratorio
Mc Pherson – Pincus, Henry’s Diagnosi clinica e
metodi di laboratorio
Mc Pherson – Pincus, Henry’s Diagnosi clinica e
metodi di laboratorio
Iper-gamma policlonali
policlonali
Iper-gamma
•Patologie da immunoodeficienza
•Infezioni congenite (sifilide,toxo,rubeo,citomegalovirus)
•Mononucleosi infettiva
• Tripanosomiasi
•Parassitismo intestinale
•Numerose elmintiasi
•Larva migrans viscerale
•Infezioni croniche in generale
•Mal.granulomatosa cronica dei bambini
•Patologie epatiche
•Patologie autoimmuni
•Miscellanea(s.di Down,amiloidosi,dipendenza narcotici ecc)
Da Abbas – Lichtman – Pober, Immunologia
cellulare e molecolare
RICONOSCIMENTO
CELLULE
CELLULE INFIAMMATORIEREATTIVE
CELLULE NEOPLASTICHE
TECNOLOGIA
• UTILIZZO DI ANTICORPI MONOCLONALI
• CITOFLUORIMETRIA
• ANTICORPO: Proteina (Ig) sintetizzata da un linfocita
B che riconosce un sito specifico sull’antigene.
• ANTICORPO POLICLONALE: Ig che riconosce e si
lega a determinanti antigenici differenti di uno stesso
antigene.
• ANTICORPO MONOCLONALE: Ig diretta contro un
epitopo specifico (determinante antigenico) di un
antigene.
Le applicazioni dell’uso degli MoAb :
– Identificazione di marcatori fenotipici distintivi
di un articolare tipo cellulare (classificazione
CD)
– Immunodiagnosi : utilizzo di test immunologici
per svelare Ag o Ab in circolo
– Terapia e diagnosi dei tumori: identificazione
e/o immunoterapia
– Analisi delle funzioni delle molecole solubili o
espresse sulla membrana cellulare
Anticorpi Monoclonali in
Citofluorimetria
•
•
•
•
•
•
•
Un marcatore è un segno di identità che consente di distinguere una specifica
cellula nell’ambito di una popolazione. Sono molecole che possono essere espresse a
livello di nucleo, citoplasma o, più spesso, nella membrana citoplasmatica
Utilizzati per:
– indicare l’appartenenza di una cellula ad una data popolazione;
– definire il livello maturativo e lo stato di attivazione della cellula.
Elencati utilizzando la nomenclatura CD
La nomenclatura CD (cluster of differentiation) fu proposta e stabilita nella prima
International Workshop and Conference of Human Leucocyte Differentiation
Antigens (HLDA) che ebbe sede a Parigi nel 1982. Lo scopo di questo congresso fu
classificare i molti anticorpi monoclonali, generati dai diversi laboratori di tutto il
mondo, che identificavano la medesima molecola
Queste molecole o markers sono designate con la sigla CD seguita da un
numero.Per indicare se una cellula esprime o manca di un determinato marker a
seguito del numero possono essere posti i simboli “ + ” o “ – ”
Ogni fase del processo di differenziazione delle cellule ematiche è caratterizzato
dall’espressione sequenziale di antigeni di membrana e/o citoplasmatici
Lo studio del pattern di espressione dei marcatori CD (immunofenotipo) è
rilevabile tramite tecniche citofluorimetriche
CITOFLUORIMETRIA
• La citometria a flusso è una tecnica che consente, attraverso
un’opportuna marcatura, una rapida misurazione di
molteplici proprietà biofisiche e biomolecolari degli elementi
cellulari, mentre questi sono trasportati all’interno di un
sottile flusso continuo di liquido attraversato da un raggio
laser. Questo permette di riconoscere e differenziare le
popolazioni cellulari attraverso la dimostrazione di
caratteristici corredi antigenici che ne connotano la
derivazione, il livello differenziativo e l’atteggiamento
funzionale
• Caratteristica di questa tecnica è l’impiego di anticorpi
monoclonali, coniugati con fluorocromi, che reagiscono
specificatamente solo nei confronti di un determinante
antigenico di membrana o citoplasmatico o nucleare
• La citofluorimetria riveste un ruolo fondamentale
nell’ambito dell’oncoematologia, è adattabile allo studio di
leucociti, globuli rossi e piastrine, in quanto il sangue è una
sospensione “naturale” di cellule monodisperse e c’è un
numero sempre più crescente di aspetti clinicamente
rilevanti dalla fisiopatologia di queste cellule, che possono
essere misurate con questa tecnica
• Utilizzando anticorpi monoclonali coniugati a composti
fluorescenti è possibile identificare le singole cellule
analizzate con il citofluorimetro in base ai marcatori
antigenici di superficie riconosciuti dall’anticorpo
• In una popolazione cellulare mista, i differenti fluorocromi
possono essere usati contemporaneamente per identificare
diverse popolazioni e sottopopolazioni cellulari. Il principio
di questo test sfrutta infatti la capacità di un anticorpo
monoclonale di legarsi alla superficie delle cellule che
esprimono un preciso determinante antigenico
CITOFLUORIMETRIA
• RAPIDITA’ DI ESECUZIONE E
PROFONDITA’ DELLE
INFORMAZIONI
• DIAGNOSI
• MONITORAGGIO
• MALATTIA RESIDUA
• RECIDIVE
VALORI DI RIFERIMENTO
DELL’IMUNOFENOTIPO relativi ai CD di
routine (popolazione adulta)
CD
MEDIA %
RANGE %
2
75
60-90
3
73
60-85
4
44
29-59
8
30
19-48
19
12
3-22
20
12
4-25
16
9
4-24
56
13
6-34
RAPPORTO CD4/CD8
0.8/2.8
VALUTAZIONE
PATOLOGIE
POPOLAZIONI
INFETTIVE (VIRALI)
CELLULARI
PERIFERICHE
LNH-B
LINFOMI T
CD4-CD8-CD3-CD19
RICERCA,
VALUTAZIONE
IDENTIFICAZIONE
POPOLAZIONI
e QUANTIFICAZIONE dei BLASTI
CELLULARI
MIELOIDI
MIDOLLARI
LINFOIDI
MARCATORI
PER
LEUCEMIE
ACUTE
NON-LINEAGE
LINEA
MIELOIDE
LINEA
LINFOIDE
MARCATORI
PER
LEUCEMIE
CRONICHE / LINFOMI
LINFOMI B
LINFOMI T
Referti Routine
•
•
•
•
•
•
•
•
CD3
CD3/4
CD3/8
CD56
CD 19
Immunosomma: T+B+NK ( 95/105 %)
Valori % ed assoluti
Rapporto CD4/CD8
Normale
Inversione CD4/CD8
Virosi
Gamma-Delta
TCR
HIV
LLC
HCL
ANTIGENIEEANTICORPI
ANTICORPI
ANTIGENI
Il sistema AB0 come esempio di reazione Ag-Ab
Differenze di molecole espresse sulla membrana eritrocitaria :
Stessa proteina chiamata sostanza H
Diversi enzimi che aggiungono uno zucchero diverso:
su emazie gruppo A residuo alfa-N-acetil-galattosamina
su emazie gruppo B residuo alfa-D-galattoso
LE TECNICHE IMMUNOMETRICHE
Affinità tra molecole
• Enzima-substrato
• Ormone-recettore
• Antigene-anticorpo
Reazione Ag-Ab
• Ampia utilizzazione in laboratorio
• Identificazione Ag o Ab
• Identificazione vari tipi di segnale
• Possibilità varie tecniche (fase solida)
• Ottimizzazione metodiche ->sensibilità = 0,1 pg/ml di Ag nel sangue
1959 Yalow descrive una metodica RIA (marcatore radioisotopico)
Mc Pherson – Pincus, Henry’s Diagnosi clinica e
metodi di laboratorio
Mc Pherson – Pincus, Henry’s Diagnosi clinica e
metodi di laboratorio
Mc Pherson – Pincus, Henry’s Diagnosi clinica e
metodi di laboratorio
Mc Pherson – Pincus, Henry’s Diagnosi clinica e
metodi di laboratorio
Mc Pherson – Pincus, Henry’s Diagnosi clinica e
metodi di laboratorio
Mc Pherson – Pincus, Henry’s Diagnosi clinica e
metodi di laboratorio
Metodo immnuo-cromatografico
Mc Pherson – Pincus, Henry’s Diagnosi clinica e
metodi di laboratorio
RIMeL / IJLaM 2007;3(suppl)
CORRELAZIONE LOG-LINEARE
SET- POINT DI REGOLAZIONE
RIMeL / IJLaM 2009
I MARKERS ONCOLOGICI
MoAb utilizzati in terapia e diagnosi
Mc Pherson – Pincus, Henry’s Diagnosi clinica e
metodi di laboratorio