Dr.ssa M. Michela D’Aloia
Laboratorio di Regolazione dei Segnali Cellulari
Ingegnerizzazione di FcR-CAR in grado di conferire ex novo ai linfociti T un meccanismo di
attivazione IgG mediato.
I CAR (Chimeric Antigen Receptor) disegnati per terapie adottive immunitarie permettono la
riprogrammazione genetica dei linfociti T che acquisiscono in tal modo una duplice funzione: a)
riconoscimento immune dell'antigene; b) capacità di innescare segnali trasduzionali che generano
una reazione immunitaria indipendente dal proprio TCR e al di fuori della restrizione operata dal
riconoscimento del complesso MHC.
Il riconoscimento immune di antigeni target è normalmente affidato alla presenza nella porzione
extra-cellulare del CAR di sequenze codificanti per un scFv ricombinante mentre, forza, intensità e
durata del signaling dipendono dalla presenza della ζ-chain del TCR o della γ-chain del FcγRIII, da
sole, o variabilmente connesse a strutture co-stimolatorie del CD28, del 4-1BB, del CD27 o del
OX40.
Il mio progetto riguarda l’ingegnerizzazione, l’espressione e la valutazione funzionale di una nuova
serie di CAR diversi da quelli fino ad ora descritti, perché dotati nella porzione extracellulare dei
moduli di legame per i frammenti cristallizzabili (Fc) delle IgG del CD16 (FcγRIIIA) o del CD64
(FcγRI). In questi tipi di CAR (FcγR-CAR), la specificità del riconoscimento immune è offerta dalle
IgG che opsonizzano le cellule target e che contemporaneamente si legano tramite il frammento Fc
ai moduli CD16 o CD64 dei CAR. Gli FcγR-CAR espressi sui linfociti T riconoscono le cellule
target opsonizzate e innescano un signaling specifico dato dal coinvolgimento dei moduli
trasduzionali in esso presenti. La strategia di utilizzo degli FcγR-CAR nella ingegnerizzazione dei
linfociti T permette loro di acquisire ex novo un meccanismo di attivazione IgG-mediato con il
risultato di implementare l’efficacia di tutti gli anticorpi monoclonali che oggi sono utilizzati nella
pratica clinica grazie al reclutamento di quella quota di linfociti T geneticamente modificati e in
grado di fare attività ADCC-like (CD3+/CD8+) o di espletare funzioni di tipo “helper” (CD3+/CD4+)
a livello dei siti tumorali.
Noi abbiamo progettato e realizzato tre CAR dotati di FcγR. Due di questi, il CD16-CAR e il
CD64-CAR sono dotati di una regione transmembrana derivante dal CD8 mentre una variante del
CD64-CAR possiede il dominio TM della molecola CD28. Tutti e tre gli FcγR-CAR affidano le
capacità di signaling ai moduli trasduzionali del CD28 e della ζ-chain del CD3 espressi in tandem.
La scelta di utilizzare il CD16 deriva dalla sua capacità di legare le IgG a bassa affinità consentendo
a cellule NK, macrofagi e neutrofili che lo esprimono, di mediare ADCC. Il CD64 è espresso su
macrofagi, neutrofili e cellule dendritiche ed è l’unico recettore ad avere la capacità di legare ad alta
affinità le IgG monomeriche.
I nostri sforzi si sono concentrati nel produrre risultati sul costrutto CD16/CD8/CD28/ζ-CAR per
validare la fattibilità strategica e funzionale del progetto. Il CD16-CAR è stato clonato in diversi
vettori ed utilizzato in studi di espressione su cellule Jurkat, su MD.45 (una linea murina di linfociti
T citotossici) e su linfociti umani isolati da donatori.
Gli studi di espressione al FACS (Fluorescent Activated Cell Sorter) di cloni stabili di MD.45,
ottenuti per trasfezione o per infezione, evidenziano un’espressione del CAR in membrana pari al
10-15 %, sia nel caso della trasfezione per elettroporazione, sia per infezione retrovirale, ma che
diventa del 100% dopo selezione farmacologica in puromicina o dopo sorting con biglie
magnetiche (MACS). Abbiamo testato due sistemi di produzione di particelle retrovirali utilizzando
packaging cell lines diverse. I nostri risultati hanno fatto preferire le HEK-293GP che richiedono
pseudo-tipizzazione con VSV-G rispetto a quello delle Phoenix Ampho che invece esprimono
stabilmente i geni gag, pol ed env, sono di più difficile manipolazione e consentono la produzione
di particelle virali a titolazione inferiori.
L’integrità del CD16-CAR nei cloni MD.45 è stata confermata in studi di Western Blot nei quali la
presenza del recettore chimerico è stata evidenziata con un anticorpo diretto contro la catena ζ.
Gli studi di attivazione biochimica hanno dimostrato che il CD16-CAR espresso su MD.45 può
essere attivato dall’engagement del recettore con un anticorpo anti CD16 (B73.1). L’efficacia e
l’entità della risposta allo stimolo sono state monitorate con la valutazione della fosforilazione di
Erk e di Akt in esperimenti di time course.
Inoltre, la valutazione della fosforilazione della catena ζ in immunoblot analisi con anticorpi
specifici (anti fosfo-ζ) hanno evidenziato che il CD16-CAR espresso in Jurkat è costitutivamente
fosforilato.
Gli studi funzionali includono i test di ADCC e di reverse ADCC con il Cr51 e la produzione in
vitro di IL-2. Il test di ADCC ha dimostrato la capacità dei cloni MD.45 esprimenti il CD16-CAR di
lisare le cellule Raji in presenza dell’anticorpo monoclonale Rituximab. Il test di reverse ADCC
con cellule P815 in grado di complessare il frammento Fc dell’anticorpo B73.1 (anti CD16) ha
confermato in vivo la capacità del CD16-CAR di mediare l’attivazione del macchinario litico che
culmina con la lisi delle stesse P815.
Gli studi sulla produzione in vitro di IL-2 hanno dimostrato che la stimolazione del costrutto
chimerico tramite B73.1 presentato dalle U937 via FcR genera un signaling in cellule MD.45
esprimenti il CD16-CAR che culmina con la produzione ed il rilascio di IL-2. Altri dati meno
convincenti hanno invece evidenziato una scarsa produzione di IL-2 in presenza del cetuximab,
anticorpo diretto contro l’EGFR espresso dalle cellule tumorali di colon HCT116. Questi risultati
sono spiegabili dal fatto che il modulo del CD16 presente nella porzione extracellulare del CAR ha
una bassa affinità nel legare le IgG (allotipo Y158 – allotipo F176).
Alla luce di questi risultati, ci proponiamo di correggere per mutagenesi l’identità di questi
aminoacidi (Y158>V158 e F176>V176) per potenziare la capacità di binding del nostro CAR alle
IgG1.
Possiamo concludere che il CD16-CAR: a) si esprime stabilmente in membrana, b) che è capace di
attivare un signaling competente all’interno della cellula se stimolato dal B73.1, c) che è in grado di
complessare le IgG, se pur a bassa affinità, d) che questo legame attiva un signaling specifico in
grado di stimolare la produzione di IL-2, e) che il signaling è funzionalmente competente a
stimolare l’attività citotossica dei cloni MD.45 su cellule target opsonizzate.
Prof. Maurizio Alimandi
Dr.ssa M. Michela D’Aloia
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