NEGLI EUCARIOTI VARI LIVELLI DI CONTROLLO DELLA ESPRESSIONE GENICA NEI PROCARIOTI: soprattutto a livello TRASCRIZIONALE IN BATTERI: UNA SOLA POLIMERASI IN EUCARIOTI: 3 TIPI DIVERSI (I, II e III) POL II MEDIA LA TRASCRIZIONE DEGLI mRNA Intervento di numerosi fattori che regolano l’inizio della trascrizione General Transcription Factors Complesso del MEDIATORE INIZIO DELLA TRASCRIZIONE Fattori di rimodellamento della cromatina PROMOTORE EUCARIOTICO per RNA-Pol II FATTORI GENERALI DI TRASCRIZIONE Mediano l’attacco della RNA-Pol II alla regione di inizio della trascrizione - 28 +1 necessari (ma non sufficienti) per attivare la trascrizione FATTORI DI TRASCRIZIONE DI BASE Simile a fattore sigma TF II …. dei procarioti TATA BOX BINDING PROTEIN ELICASI COMPLESSO DI PRE-INIZIO COMPLESSO APERTO ULTIMO EVENTO fosforilazione della coda della pol II CTD Fosforilato da TFIIH 52 ripetizioni del peptide Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser fattore TBP 80° TATA BOX FOSFORILAZIONE DI CDT DELLA RNA pol II legame a fattori che portano avanti l’allungamento dell’ mRNA e che regolano la formazione del Cap, la poli-adenilazione e lo splicing CDT RNA COME SI DETERMINA IL SITO DI INIZIO DELLA TRASCRIZIONE ? Gene della Interleuchina 1 umana DETERMINAZIONE DEL SITO DI INIZIO DELLA TRASCRIZIONE ESPERIMENTI DI - PRIMER EXTENTION - “RUN-OFF” - S1 MAPPING PRIMER EXTENTION SAGGIO DI TRASCRIZIONE “IN VITRO” RUN - OFF S1 - MAPPING n 100-200 basi upstream Core promoter 1000-20000 (?) basi upstream (anche downstream) FATTORI TRASCRIZIONALI in “TRANS” (proteine ) ELEMENTI “IN CIS” ( Sequenze del promotore) 25-35 bp upstream Bind TBP Lega il fattore Sp1 in molti geni housekeeping Elementi che legano il fattore AP1 ( Jun, Fos) CORE Cis element per fattore trascrizionale Elementi “cis” Sp1 prossimali 5' GGGCGG 3‘ ----------------Ap1 (dimeri Fos/Jun o Jun/Jun) Ripiegatura del DNA Inoltre: (proteine HMG) COMPLESSO DI RIMODELLAMENTO DELLA CROMATINA ENZIMI DI MODIFICAZIONE DEGLI ISTONI REGOLAZIONE COMBINATORIA GENE PER IL L’ INTERFERONE BETA Attivazione in seguito ad infezione Legame coopeativo degli attivatori Fattori sintetizzati in risposta all’infezione Richiamano p300 che richiama - fattori di rimodellamento e - apparato trascrizionale di base T cell receptor chains All insulators discovered so far in vertebrates work only when bound by a protein designated CTCF ("CCCTC binding factor"; named for a nucleotide sequence found in all insulators). CTCF has 11 zinc fingers. I TF reclutano l’apparato di trascrizione di base Formazione del complesso di inizio i modificatori dei nucleosomi 1) aggiunta di gruppi chimici (HAT) 2) rimodellamento della cromatina (SWI/SFN ATP-dipendente) DISAGGREGAZIONE DEI NUCLEOSOMI SWI, SFN Dipendenti da ATP HAT / HDAC Metilasi Chinasi “CODICE ISTONICO” CROMODOMINI / BROMODOMINI Domini di legame presenti in proteine che modificano ulteriormente gli istoni. Oppure in proteine regolatrici (TFIID) FATTORI TRASCRIZIONALI Come interagiscono con specifiche sequenze del DNA ? Hanno caratteristiche comuni ? ELICA DI RICONOSCIMENTO ZINC - FINGERS EXON SHAFFLING Dimerizzazione MOTIVO HELIX-LOOP-ELIX HLH Legame al DNA MOTIVO LEUCINE ZIPPER AMINOACIDI IDROFOBICI A DISTANZA DI 7 aa (1 GIRO DI ELICA = 3.6 aa) LEUCINE ZIPPER LEUCINE ZIPPER MOTIVO HELIX-TURN-HELIX Tipico di molti omeodomini COME SI STUDIA L’ INTERAZIONE TRA FATTORI TRASCRIZIONALI E SPECIFICI ELEMENTI DEL DNA ? LUCIFERASI GFP CROMATOGRAFIA DI AFFINITA’ Per identificare fattori che legano specifiche sequenze CHROMATIN IMMUNOPRECIPITATION CHIP Per identificare sequenze che legano specifici fattori SEQUENZIAMENTO O IBRIDAZIONE A MICROARRAY GENOMICO 32P DETERMINAZIONE DEI SITI DI ATTACCO DI FATTORI TRASCRIZIONALI (footprinting) TAGLIO CON ENDONUCLEASI SEPARAZIONE ELETTROFORETICA SU GEL DI POLIACRILAMMIDE HIF1 HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR oxygen-dependent degradation domain Regolato da O2 transactivation domains costitutivo Structure of the HIF-1 Complex. The hypoxia inducible factor 1 complex (HIF-1) is a dimer composed of two proteins involved in hypoxic gene transactivation, HIF-1α and HIF-1β (ARNT). Dimerization between these two factors is mediated by the helix-loop-helix (HLH) and Per-ARNT-SIM domains, and DNA binding involves the basic (b-) region of the b-HLH domains. HIF-1 modulates transcription through its transactivation domains (TAD). Between amino acids 401 and 603, HIF-1α contains an oxygen-dependent degradation domain (ODD) which controls its degradation under normoxia [24]. Fig. 1 Duffy et al. Molecular Cancer 2003 2:12 doi:10.1186/1476-4598-2-12 Richiama p300 Subunità della ubiquitina-ligasi E3 Hypoxia Response elements Richiama p300 che richiama -fattori di rimodellamento - app. trascriz. di base Molecular mechanisms of hypoxia-induced angiogenesis. Under normoxic conditions (panel A), HIF-1α is hydroxylated by the active prolyl-4-hydroxylase enzyme, which facilitates the binding of VHL protein and leads to rapid HIF-1α degradation by the ubiquitin proteasome system. In the face of hypoxia (panel B), the hydroxylase enzyme is inactive and HIF-1α is stabilized in its de-hydroxylated state. The stable HIF-1α translocates to the nucleus, where it accumulates and dimerizes with the constitutively expressed HIF-1β, forming the intact HIF-1 complex. This complex binds hypoxia response elements (HREs) in selective genes to alter transcriptional activity. A notable hypoxia-induced gene is that coding for vascular endothelial growth factor (VEGF), a cytokine which potently stimulates neoangiogenesis [24]. IF-1 In normossia La subunità alfa viene idrossilata su una prolina che viene così legata all’ubiquitina Viene idrossilata anche una Asn: ciò impedisce l’interazione con p300 In ipossia: La subunità alfa non viene degradata e attiva la trascrizione dimerizzando con la subunità beta EMT Ephitelil-mesenchymal transition Comune nell’embrione. EMT Reversibile Transizione e migrazione cellulare per la formazione di nuovi organi Coinvolta nelle metastasi. Cellule che diventano capaci di migrare, con contatti ridotti e produzione di proteasi Coinvolta nella rigenerazione tissutale e nella fibrosi REGOLAZIONE GUIDATA DA FATTORI TRASCRIZIONALI CHE REPRIMONO LA E-CADERINA ? ? EMT PrincipalI fattori trascrizionali: Snail, Slug, Twist, ZEB Regolano negativamente la E-caderina. Possono essere anche attivatori di altri geni SNAI SUPERFAMILY zinc-finger TFs Ubiquitinazione Regolata da Ser/Pro-chinasi e da modificazioni di Lys Nuclear Export Signal Dominio di repressione 7-9 AA Regolato da Ser/Pro-chinasi e da modificazioni di Lys Snail Legano E2-boxes C/A(CAGGTG) Slug ? bHLH TF superfamily Omo- o etero-dimeri Twist: HLH o bHLH bHLH Sempre eterodimero Co-repressori Legame a E-box CANNTG Importante •nello sviluppo embrionale •nei tumori ZEB TF superfamily importanti nello sviluppo embrionale inducono de-differenziamento epiteliale nella tumorigenesi Zinc-fingers Co-repressori Legame a E-box CANNTG Promotore per RNA Polimerasi I Trascrive ad alti livelli il gene per gli rRNA MATURAZIONE DEGLI RNA RIBOSIMIALI TRIGGERING Promotore per RNA Polimerasi III RNAsi P INTRONE MRFs - Miogenic Related Factors • • • • MyoD Myf-5 Myogenin MRF-4 (Myf-3) (Myf-1) (Myf-6, Herculin) Fattori trascrizionali Nel 1987 scoperto MyoD Con la strategia delle library di cDNA sottrattive DNA micro chips Principle of 22-D Electrophoresis 1. First dimension: denaturing isoelectric focusing separation according to the pI 2. Second dimension: SDS electrophoresis separation according to the MW HEPG2 SWISS2DPAGE map Valori di pH MRFs - Miogenic Related Factors • • • • MyoD (Myf-3) Myf-5 Myogenin (Myf-1) MRF-4 (Myf-6, Herculin) Fattori trascrizionali Fattori capaci di indurre differenziamento muscolare in fibroblasti. I promotori dei loro geni si attivano in maniera sequenziale Basic helix-loop-helix (bHLH) transcription factor Formano eterodimeri con le proteine E, ubiquitarie Legano le E-boxes (CANNTG) a monte di promotori di geni muscolo-specifici ETERODIMERO ATTIVO Elica basica ESPERIMENTI CON TOPI KNOCK-OUT COMMISSIONAMENTO MIOGENICO • -/- per myoD: pressochè normali (aumenta Myf-5) • -/- per myf-5: hanno muscolatura quasi normale, ma con difetti a livello dei muscoli intercostali, recuperati con over-espressione di Myogenina • -/- per myoD e per myf-5: totale assenza di cellule muscolari DIFFERENZIAMENTO FINALE • -/- per Myogenina: assenza di miofibre • -/- per MRF4: quasi normali, over-espresione di Myogenina http://www.bio.davidson.edu/Courses/genomics/method/homolrecomb.html TRASFEZIONE BLASTOCISTI Creazione del costrutto per la ricombinazione omologa Cellule ES Staminali embrionali: manipolazione “in vitro” (trasfezione) Inserimento nella blastocisti Topi chimerici 1° incrocio per genotipo -/+ 2°incrocio per genotipo -/- RICOMBINAZIONE OMOLOGA Distruzione (interruzione) del gene bersaglio TRASCRIZIONE Inattiva attiva Resistenza al G418 Nei somiti di embrioni murini Proteine Id Inibitori del Differenziamento (simili a proteina E, ma senza elica basica) Myf-5 MyoD “dominanti negativi” naturali di MRFs. DIFFERENZIAMENTO IN SEGUITO A DOWN-REGOLAZIONE DI PROTEINE Id Myogenin MRF-4 Elemento “in cis” a - 20 Kb Elemento “in cis” a - 5 Kb TATA BOX di MyoD o Myf-5 INDUZIONE DEI GENI MyoD e Myf-5 NEI SOMITI Pax3, Pax7 Homeodomain TF MyoD attiva anche il proprio gene COATTIVATORI Trascrizione MEF-2 miR-1 TFIID MyoD P300/CBP Acetilazione degli istoni MEF2 myocyte enhancer factor MAPK Trasforma MEF2 in repressore + ATP cofactors Non necessario nel differenziamento embrionale ma importante nella maturazione post-natale del muscolo Pax 7 Fase proliferativa Fase differenziativa Bone marrow stem cells ATTIVI NELLO SVILUPPO MUSCOLARE dsRNA Trascritti dal genoma Esogeni (p.e. virus) Pre-miRNA pri-miRNA siRNA e miRNA dsRNA pre-miRNA DICER mi-RNA siRNA piccolissimi RNA associati a proteine con capacità idrolitica su mRNA cellulari su RNA virali Controllo posttrascrizionale Difesa dall’infezione DROSHA Cap ACCORCIAMENTO (“MIETITURA”) pri-miRNA dsRNA (esogeno) pre-miRNA TAGLIO (“TRITARE”) DICER RNA-Induced Silencing Complex DROSHA Cap ACCORCIAMENTO (“MIETITURA”) pri-miRNA dsRNA (esogeno) pre-miRNA TAGLIO (“TRITARE”) DICER PERCORSO COMUNE RNA-Induced Silencing Complex pri-miRNA pre-miRNA Trascritto da RNA pol II Nel nucleo, poi esportazione nel citoplasma 65-70 nucleotidi totali AL CITOPLASMA Tagli successivi per la produzione di miRNA maturo ? miRNA pre-miRNA circa 22 basi circa 66 basi 16 mer = 4 x 109 combinazioni INF pri-miRNA (anche migliaia di basi) Esempi di pre-miRNA Dopo taglio con DICER in alcuni casi entrambi i filamenti diventeranno miRNA attivi MIOSTATINA • • • • • • • Inibisce il differenziamento muscolare. Piccola proteina (25kDa, TGF-beta superfamily) secreta dal muscolo si lega ad un recettore muscolare Mutazione rara nell’uomo Razza Belgian blue ha una mutazione sul gene FOLLISTATINA antagonista della miostatina