Nome insegnamento: Biotecnologie cellulari CFU 5+1
Frequenza obbligatoria del laboratorio
Obiettivi formativi del corso: Il corso si propone di illustrare le caratteristiche e le utilizzazioni
generali delle colture di cellule eucariotiche, nonché le tecnologie che consentono di studiare le
cellule e i suoi componenti.
Syllabus (sintesi del programma in non più di 4 o 5 righe)
Tecniche di analisi microscopica delle cellule eucariotiche. Allestimento, mantenimento e
differenziamento di colture cellulari. Loro utilizzo come modelli differenziativi e per la produzione
di composti di rilievo biologico. Trasformazione di cellule in coltura. Cellule staminali (generalità,
caratteristiche biologiche e potenziali utilizzazioni). Anticorpi, ibridomi. Microarrays. Sistemi di
espressione di proteine eucariotiche. Tecnica del doppio ibrido.
Programma dettagliato del corso (ordine di grandezza: una pagina)
Introduzione. Generalità sulle tecniche di microscopia. Il microscopio ottico. Principi generali del
funzionamento. Microtomo e criostato.
Fissazione, inclusione e colorazione dei tessuti: principi generali. Molecole fluorescenti.
Microscopio a fluorescenza.
Microscopia a fluorescenza. Principi ed applicazioni. Microscopia confocale.
Microscopia a contrasto di fase. Microscopia elettronica. Principi ed appplicazioni.
Il microscopio elettronico a scansione. Tecniche autoradiografiche in biologia cellulare.
Introduzione alle colture cellulari eucariotiche. Colture primarie e linee cellulari. Caratteristiche
generali dei mezzi di coltura.
Un modello di differenziamento di cellule in coltura: trattamento di fibroblasti in coltura con 5'
azacitidina e differenziamento muscolare.
Un modello di differenziamento di cellule in coltura: uso di cDNA di banche sottrattive e
l'isolamento di MyoD.
Trasfezione di fibroblasti con MyoD ed analisi dell'effetto sul differenziamento.
MyoD lega il DNA: saggi di DNasi footprint e "band shift" sul promoter di MCK
Regolazione reciproca di MyoD e miogenina in saggi di trasfezione su cellule in coltura. Effetti del
knock out genico di MyoD, Myf-5 (semplice e combinato) e miogenina sullo sviluppo del muscolo
scheletrico.
Modelli di differenziamento in vivo. La retinogenesi ed il ruolo dei geni Xotx2 e Xotx5 nella
specificazione dei tipi cellulari.
Studio dei domini proteici di Xotx2 e Xotx5 coinvolti nella specificazione retinica.
Cellule staminali. Caratteristiche generali delle cellule staminali e sui potenziali usi applicativi.
Cellule staminali embrionali. Esempi di differenziamento indotto nelle cellule ES e loro impianto in
vivo. Generazione di cellule che producono mielina in ratti affetti da sindrome Md. Generazione di
cellule pancreatiche beta da cellule ES di topo.
Ruolo di Oct4 nel mantenimento delle potenzialità differenziative delle cellule staminali.
La via dei segnale di LIF-STAT3-JAK e il mantenimento delle caratteristiche staminali delle cellule
ES.
La via di segnale di LIF-STAT3-JAK e l'uso di recettori chimerici gp130 per la definizione della
sua importanza nel mantenere le cellule in coltura.
Il fattore di trascrizione Nanog e il suo ruolo nelle cellule della massa cellulare interna e nella
regolazione delle potenzialità delle cellule ES. Generazione di precursori ematopoietici da cellule
staminali neurali.
Il sistema immunitario e gli anticorpi. Generalità.
Ruolo, struttura molecolare e classificazione delle immunoglobuline.
Meccanismi molecolari della variabilità degli anticorpi.
Anticorpi policlonali e monoclonali. Ibridomi. Linfociti T: generalità. Recettori dei linfociti T e
cellule che presentano l'antigene. Le proteine MHC.
Tecnologia ed uso dei DNA microarrays.
Espressione e caratterizzazione di proteine in cellule eucariotiche.
Tecnologia dello "screening" del doppio ibrido.
Prove di verifica dell’apprendimento
(modalità di svolgimento dell’esame e di eventuali valutazioni in itinere; indicare la modalità di
svolgimento dell’esame; nel caso di corsi che non prevedono esami specificare il modo con cui
avviene la valutazione: ad esempio attraverso tesine, progetti etc.)
Esame orale
Argomenti da conoscere per poter frequentare efficacemente il corso
Citologia, Biochimica, Biologia molecolare
Bibliografia
Alberts et al., Biuologia Molecolare della Cellula, Zanichelli
Durante il corso verranno anche utilizzati articoli scientifici forniti dal docente.
Dati del docente
Nome: Prof. Robert Vignali
Dipartimento Fisiologia e Biochimica
Telefono: 050 878356
E- mail: [email protected]
Pagina web: www.dfb.unipi.it
Orario di ricevimento: venerdì ore 11-13
Luogo di ricevimento: Lab. Biol. Cellulare, Loc. La Fontina
