tecniche centrifugative - Progetto e
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TECNICHE CENTRIFUGATIVE Le tecniche di separazione mediante centrifugazione sfruttano il comportamento delle particelle all’interno di un campo centrifugo applicato Lo scopo di tali metodiche e’ quello di esercitare sulle particelle una forza maggiore rispetto a quella esercitata dal campo gravitazionale terrestre, in modo tale da aumentare la loro velocita’di sedimentazione Grazie a tali metodiche, le particelle che differiscono per densita’, forma o dimensione possono essere separate tra di loro, poiche’ sedimentano a velocita’ diverse. Ogni velocità risulta direttamente proporzionale al campo centrifugo applicato PRINCIPI DI BASE DELLA SEDIMENTAZIONE La velocita’ di sedimentazione dipende dal campo centrifugo (G) applicato, che e’ diretto radialmente verso l’esterno; esso e’ funzione della velocita’ angolare del rotore (, in radianti/sec) e della distanza della particella dall’asse di rotazione (r, in cm), in base all’equazione: G= 2 r Essendo una rivoluzione del rotore pari a 2 radianti, la velocita’ angolare del rotore, in radianti al secondo, puo’ facilmente essere espressa in termini di rivoluzioni al minuto (rpm), ovvero: = 2rpm/60 Il campo centrifugo (G) espresso in rpm diventa: G= 2r 42(rpm)2r/3600 ed e’ generalmente espresso in multipli del campo gravitazionale terrestre, cioe’ come rapporto tra il peso della particella sottoposta al campo centrifugo ed il peso della stessa in presenza della sola forza di gravita’ Quindi, “ G ” e’ definito in termini di campo centrifugo relativo (RCF) o, piu’ comunemente, come “ numero di g” (dove g è il campo gravitazionale terrestre, pari a 980 cm·s-2): RCF= G/980 RCF= (1,1·10 –5 ) rpm2 ·r N.B. : La velocita’ di sedimentazione di una particella dipende non solo dal campo centrifugo applicato, ma anche dalla sua massa, densita’ e forma, oltre che dalla densità e viscosita’ del solvente in cui avviene la sedimentazione Nel corso della sedimentazione, inoltre, la particella e’ sottoposta ad una forza netta verso l’esterno (F), che e’ data dall’espressione: 3 2 F=4/3 rp (p - m ) r • 4/3 3 rp =volume della sfera di raggio rp • p =densita’ della particella • m =densita’ del mezzo • r= distanza della particella dal centro di rotazione Tuttavia, le particelle generano attrito quando migrano attraverso la soluzione; se si assume che la particella sia sferica e che si muova con velocita’ nota, allora la forza d’attrito che si oppone al moto della particella e’ data dalla legge di Stokes: ƒ0 = 6rp • ƒ0= coefficiente d’attrito per una particella sferica • = coefficiente di viscosita’ del mezzo • = velocita’di sedimentazione della particella Una particella di volume e densita’ noti, in un mezzo a densita’ costante, sara’ percio’ accelerata in un campo centrifugo fino a quando la forza applicata sulla particella stessa sara’ uguale alla forza d’attito, cioe’ quando: F = ƒ0 4/3 3 rp (p- 2 m) r= 6rp In pratica, le due forze si eguagliano abbastanza rapidamente, con il risultato che la particella sedimenta a velocita’ costante; quindi, la velocita’ e’ data da: = dr/dt = 2/9 · 2 2 rp (p- m) r/ Integrando tale equazione, e’ possibile ricavare il tempo di sedimetazione di una particella sferica sottoposta ad un campo centrifugo, in funzione delle variabili implicate e della lunghezza del percorso compiuto dalla particella nella provetta da centrifuga: 2 2 t = 9/2 rp (p- m) · ln rb/rt • t =tempo di sedimentazione in secondi • rt =distanza radiale dall’asse di rotazione al menisco del liquido • rb = distanza radiale dall’asse di rotazione al fondo della provetta La velocita’ di sedimentazione puo’ anche essere espressa in termini di velocita’ di sedimentazione per unita’ di campo centrifugo applicato, comunemente detta “coefficiente di sedimentazione” (s). Se il mezzo ha una composizione definita, la velocita’ di sedimentazione e’ proporzionale 2 a r, quindi l’equazione si semplifica in: 2 =s r 2 s= / r Gli studi di velocita’ di sedimentazione possono essere eseguiti impiegando svariati sistemi soluto-solvente; il valore misurato del coefficiente di sedimentazione, influenzato dalla temperatura, dalla densita’ e dalla viscosita’ della soluzione, viene spesso corretto nel valore che si otterrebbe in un mezzo la cui viscosita’ e densita’ fossero pari a quelle dell’ acqua a 20ºC, espresso come “coefficiente di sedimentazione standard” (S20,w) N.B.:I coefficienti di sedimentazione della maggior parte delle strutture biologiche sono molto piccoli e, per comodita’, viene presa -13 come unita’ di misura il valore di 10 secondi, che viene definito come “unita’ di Svedberg” (S) CENTRIFUGHE E LORO UTILIZZO Le centrifughe possono essere classificate in quattro categorie principali: piccole centrifughe da banco; centrifughe refrigerate a grande capacita’; centrifughe refrigerate ad alta velocita’; ultracentrifughe PICCOLE CENTRIFUGHE DA BANCO • Sono le piu’ semplici e le meno costose • Impiegate solitamente per raccogliere piccole quantita’ di materiale che sedimenta rapidamente • Velocita’ max compresa tra 4000-6000 rpm • Operano generalmente a temperatura ambiente CENTRIFUGHE REFRIGERATE A GRANDE CAPACITA’ • Hanno una velocita’ max di 600 rpm • Sono dotate di camere del rotore refrigerate • Possono impiegare una varieta’ di rotori intercambiabili CENTRIFUGHE REFRIGERATE AD ALTA VELOCITA’ • Velocita’ max di 25.000 rpm • Rotori intercambiabili • Impiegate soprattutto nella raccolta di microrganismi,frammenti cellulari e organuli cellulari ULTRACENTRIFUGHE • Preparative: • Velocita’ max di 80.000 rpm; • Camera del rotore refrigerata, blindata e sottovuoto; • Sofisticato sistema di controllo della temperatura • Analitiche: • Velocita’ max di 70.000 rpm; • Camera del rotore refrigerata, blindata e sottovuoto; • Dotate di un sistema ottico per l’osservazione del materiale SISTEMA DI ULTRACENTRIFUGA ANALITICA CON SISTEMA OTTICO DI SCHLIEREN PRINCIPALI TIPI DI ROTORI • Rotori a bracci oscillanti; • Rotori ad angolo fisso; • Rotori per tubi ad alloggiamento verticale ROTORE A BRACCI OSCILLANTI • Possiede bracci che durante l’accelerazione del rotore si portano in posizione orizzontale, in modo tale che la provetta sia perpendicolare all’asse di rotazione e parallela al campo centrifugo applicato ROTORI AD ANGOLO FISSO • Le provette sono poste in cavita’ scavate nel corpo del rotore e formano un angolo fisso tra 14° e 40º rispetto alla verticale ROTORI PER TUBI AD ALLOGGIAMENTO VERTICALE • Rotore ad angolo fisso nullo, in cui le provette sono sempre allineate verticalmente al corpo del rotore Metodi di separazione nell’ultracentrifugazione preparativa CENTRIFUGAZIONE DIFFERENZIALE • Il materiale che dev’essere diviso nelle sue componenti viene separato in un certo numero di frazioni per centrifugazioni successive, aumentando gradualmente il campo centrifugo applicato • N.B. :Alla fine di ogni centrifugazione solo il pellet viene lavato, risospeso e ricentrifugato • La centrifugazione differenziale e’ la tecnica piu’ usata per l’isolamento degli organuli cellulari da omogenati di tessuto CENTRIFUGAZIONE IN GRADIENTE DI DENSITA’ Metodo che viene usato quando e’ richiesta una separazione quantitativa di tutti i componenti di una miscela di particelle Separazione isopicnica su gradiente di densita’ • Centrifugazione isopicnica: dipende unicamente dalla densita’ idrostatica della particella SEPARAZIONE ISOPICNICA SENZA GRADIENTE PREFORMATO • Il campione viene mescolato con il mezzo che costituisce il gradiente, anziche’ stratificarlo in un gradiente preformato MATERIALI PER GRADIENTI DI USO COMUNE E LORO APPLICAZIONI
