TECNICHE
CENTRIFUGATIVE
Le tecniche di separazione mediante
centrifugazione sfruttano il comportamento
delle particelle all’interno di un campo
centrifugo applicato
Lo scopo di tali metodiche e’ quello di
esercitare sulle particelle una forza maggiore
rispetto a quella esercitata dal campo
gravitazionale terrestre, in modo tale da
aumentare la loro velocita’di sedimentazione
Grazie a tali metodiche, le particelle che
differiscono per densita’, forma o dimensione
possono essere separate tra di loro, poiche’
sedimentano a velocita’ diverse. Ogni velocità
risulta direttamente proporzionale al campo
centrifugo applicato
PRINCIPI DI BASE DELLA
SEDIMENTAZIONE
La velocita’ di sedimentazione dipende dal
campo centrifugo (G) applicato, che e’
diretto radialmente verso l’esterno; esso
e’ funzione della velocita’ angolare del
rotore (, in radianti/sec) e della
distanza della particella dall’asse di
rotazione (r, in cm), in base all’equazione:
G= 2 r
Essendo una rivoluzione del rotore pari a
2 radianti, la velocita’ angolare del rotore,
in radianti al secondo, puo’ facilmente essere
espressa in termini di rivoluzioni al minuto
(rpm), ovvero:
= 2rpm/60
Il campo centrifugo (G) espresso in rpm
diventa:
G= 2r
42(rpm)2r/3600
ed e’ generalmente espresso in multipli del
campo gravitazionale terrestre, cioe’ come
rapporto tra il peso della particella sottoposta
al campo centrifugo ed il peso della stessa in
presenza della sola forza di gravita’
Quindi, “ G ” e’ definito in termini di
campo centrifugo relativo (RCF)
o, piu’ comunemente, come “ numero di g”
(dove g è il campo gravitazionale terrestre,
pari a 980 cm·s-2):
RCF= G/980
RCF= (1,1·10 –5 ) rpm2 ·r
N.B. : La velocita’ di sedimentazione di una
particella dipende non solo dal campo
centrifugo applicato, ma anche dalla sua
massa, densita’ e forma, oltre che dalla
densità e viscosita’ del solvente in cui
avviene la sedimentazione
Nel corso della sedimentazione, inoltre, la particella
e’ sottoposta ad una forza netta verso l’esterno (F),
che e’ data dall’espressione:
3
2
F=4/3 rp (p - m ) r
• 4/3
3
rp =volume
della sfera di raggio rp
• p =densita’ della particella
• m =densita’ del mezzo
• r= distanza della particella dal centro
di rotazione
Tuttavia, le particelle generano attrito quando
migrano attraverso la soluzione; se si assume che
la particella sia sferica e che si muova con velocita’
nota, allora la forza d’attrito che si oppone al moto
della particella e’ data dalla legge di Stokes:
ƒ0 = 6rp
• ƒ0= coefficiente d’attrito per una particella
sferica
• = coefficiente di viscosita’ del mezzo
• = velocita’di sedimentazione della particella
Una particella di volume e densita’ noti, in un
mezzo a densita’ costante, sara’ percio’
accelerata in un campo centrifugo fino a
quando la forza applicata sulla particella
stessa sara’ uguale alla forza d’attito,
cioe’ quando:
F = ƒ0
4/3
3
rp (p-
2
m) r= 6rp
In pratica, le due forze si eguagliano
abbastanza rapidamente, con il risultato che la
particella sedimenta a velocita’ costante;
quindi, la velocita’ e’ data da:
= dr/dt = 2/9 ·
2
2
rp (p- m) r/
Integrando tale equazione, e’ possibile
ricavare il tempo di sedimetazione di una
particella sferica sottoposta ad un campo
centrifugo, in funzione delle variabili
implicate e della lunghezza del percorso
compiuto dalla particella nella provetta da
centrifuga:
2
2
t = 9/2 rp (p- m) · ln rb/rt
• t =tempo di sedimentazione in secondi
• rt =distanza radiale dall’asse di rotazione al
menisco del liquido
• rb = distanza radiale dall’asse di rotazione al
fondo della provetta
La velocita’ di sedimentazione puo’ anche
essere espressa in termini di velocita’ di
sedimentazione per unita’ di campo
centrifugo applicato, comunemente detta
“coefficiente di sedimentazione” (s). Se il
mezzo ha una composizione definita, la
velocita’ di sedimentazione e’ proporzionale
2
a r, quindi l’equazione si semplifica in:
2
=s r
2
s= / r
Gli studi di velocita’ di sedimentazione possono
essere eseguiti impiegando svariati sistemi
soluto-solvente; il valore misurato del
coefficiente di sedimentazione, influenzato dalla
temperatura, dalla densita’ e dalla viscosita’ della
soluzione, viene spesso corretto nel valore che si
otterrebbe in un mezzo la cui viscosita’ e densita’
fossero pari a quelle dell’ acqua a 20ºC, espresso
come “coefficiente di sedimentazione standard”
(S20,w)
N.B.:I coefficienti di sedimentazione della
maggior parte delle strutture biologiche sono
molto piccoli e, per comodita’, viene presa
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come unita’ di misura il valore di 10 secondi,
che viene definito come “unita’ di Svedberg”
(S)
CENTRIFUGHE E LORO
UTILIZZO
Le centrifughe possono essere classificate
in quattro categorie principali:
piccole centrifughe da banco;
centrifughe refrigerate a grande
capacita’;
centrifughe refrigerate ad alta velocita’;
ultracentrifughe
PICCOLE CENTRIFUGHE DA BANCO
• Sono le piu’ semplici e le meno costose
• Impiegate solitamente per raccogliere
piccole quantita’ di materiale che sedimenta
rapidamente
• Velocita’ max compresa tra 4000-6000 rpm
• Operano generalmente a temperatura
ambiente
CENTRIFUGHE REFRIGERATE A GRANDE
CAPACITA’
• Hanno una velocita’ max di 600 rpm
• Sono dotate di camere del rotore
refrigerate
• Possono impiegare una varieta’ di rotori
intercambiabili
CENTRIFUGHE REFRIGERATE AD ALTA
VELOCITA’
• Velocita’ max di 25.000 rpm
• Rotori intercambiabili
• Impiegate soprattutto nella raccolta di
microrganismi,frammenti cellulari e
organuli cellulari
ULTRACENTRIFUGHE
• Preparative:
• Velocita’ max di 80.000 rpm;
• Camera del rotore refrigerata, blindata e
sottovuoto;
• Sofisticato sistema di controllo della temperatura
• Analitiche:
• Velocita’ max di 70.000 rpm;
• Camera del rotore refrigerata, blindata e
sottovuoto;
• Dotate di un sistema ottico per l’osservazione del
materiale
SISTEMA DI ULTRACENTRIFUGA
ANALITICA CON SISTEMA OTTICO
DI SCHLIEREN
PRINCIPALI TIPI DI ROTORI
• Rotori a bracci oscillanti;
• Rotori ad angolo fisso;
• Rotori per tubi ad alloggiamento verticale
ROTORE A BRACCI OSCILLANTI
• Possiede bracci che
durante
l’accelerazione del
rotore si portano in
posizione orizzontale,
in modo tale che la
provetta sia
perpendicolare
all’asse di rotazione e
parallela al campo
centrifugo applicato
ROTORI AD ANGOLO FISSO
• Le provette sono
poste in cavita’
scavate nel corpo
del rotore e
formano un angolo
fisso tra 14° e 40º
rispetto alla
verticale
ROTORI PER TUBI AD
ALLOGGIAMENTO VERTICALE
• Rotore ad angolo
fisso nullo, in cui le
provette sono
sempre allineate
verticalmente al
corpo del rotore
Metodi di separazione
nell’ultracentrifugazione
preparativa
CENTRIFUGAZIONE
DIFFERENZIALE
• Il materiale che dev’essere
diviso nelle sue componenti
viene separato in un certo
numero di frazioni per
centrifugazioni successive,
aumentando gradualmente il
campo centrifugo applicato
• N.B. :Alla fine di ogni
centrifugazione solo il
pellet viene lavato,
risospeso e ricentrifugato
• La centrifugazione
differenziale e’ la
tecnica piu’ usata per
l’isolamento degli
organuli cellulari da
omogenati di tessuto
CENTRIFUGAZIONE IN
GRADIENTE DI DENSITA’
Metodo che viene usato quando e’
richiesta una separazione
quantitativa di tutti i componenti di
una miscela di particelle
Separazione isopicnica su
gradiente di densita’
• Centrifugazione
isopicnica: dipende
unicamente dalla
densita’ idrostatica
della particella
SEPARAZIONE ISOPICNICA
SENZA GRADIENTE PREFORMATO
• Il campione viene
mescolato con il mezzo
che costituisce il
gradiente, anziche’
stratificarlo in un
gradiente preformato
MATERIALI PER GRADIENTI DI USO
COMUNE E LORO APPLICAZIONI
