Diagnosi di SCA4

ATASSIE DOMINANTI
Introduzione
Le atassie dominanti sono un gruppo di malattie neurodegenerative caratterizzate, a livello
genotipico, da un’espansione da tripletta che si trasmette da una generazione all’altra come
carattere autosomico dominante. L’alterazione genica può interessare parti diverse del gene
(introni, esoni, 3’ non tradotto, 5’ non tradotto) e provocare perdita o acquisto di funzione. Le
diverse atassie spinocerebellari interessano aree cerebrali differenti ma coinvolgono in
particolare il cervelletto e fibre che con esso interagiscono; malgrado mostrino alcuni segni
clinici caratteristici si manifestano con ipotonia e deficit motori dovuti perlopiù ad un
allungamento dei tempi di risposta ad un determinato stimolo ed ad una difficoltà nel valutare
la velocità e la consequenzialità dei movimenti. L’età di insorgenza della malattia è
strettamente correlata con il grado di espansione della tripletta e per alcune di queste è
influenzata anche dal sesso del genitore “responsabile” della trasmissione della patologia. Nel
genoma di un individuo non affetto sono presenti normalmente un certo numero di ripetizioni
di triplette, comprese in un range polimorfico compatibile con l’usual size; il superamento della
soglia comporta l'insorgenza della patologia e questa risulta tanto più precoce quanto più è
espansa la ripetizione. È da notare però che un paziente atassico può presentare la patologia
prima rispetto all’età di insorgenza nel genitore “responsabile” della trasmissione
(anticipazione) in quanto le triplette mostrano una certa instabilità sia meiotica che mitotica con
tendenza all’espansione.
Classificazione
La distinzione delle atassie è soprattutto su base genetica, in quanto ognuna è dovuta ad
alterazione di geni differenti (di cui spesso non si conosce il prodotto genico); ma la
classificazione delle ADCA maggiormente valutata è quella da attribuirsi ad Anita Harding che
prende in considerazione i sintomi clinici caratteristici di un certo numero di atassie:
- ADCA I
sindrome cerebellare + oftalmoplegia, alterazioni piramidali ed extrapiramidali, demenza
- ADCA II
sindrome cerebellare + maculopatia pigmentaria
- ADCA III
sindrome cerebellare + lievi segni di alterazioni piramidali
Gli studi in corso sono volti per lo più alla comprensione dei meccanismi molecolari che
collegano il fenomeno dell’espansione alla degenerazione neuronale.
Patogenesi
Le sequenze CAG, CTG responsabili di alcune delle forme atassiche dominanti mostrano un
moderato livello di instabilità e una moderata lunghezza di espansione; interessano
prevalentemente la porzione codificante del gene e, a livello della proteina, determinano
l’inserzione di uno stretch di amminoacidi (glutammina per il CAG e alanina per il CTG)
provocando un’alterazione che risulta dannosa per la cellula. L’esatto meccanismo patogenetico
non è conosciuto, ma la proteina mutata è maggiormente soggetta al taglio proteolitico e
probabilmente tale forma risulta avere una maggiore potenzialità self-aggregante: nei neuroni
dei pazienti atassici sono stati ritrovati degli aggregati ubiquitinati il cui numero aumentava al
crescere del grado di espansione. Le cellule con un numero maggiore di aggregati sono più
suscettibili alla morte anche se non si conosce esattamente il ruolo che essi ricoprano nel
fenomeno della neurodegenerazione; un certo numero di studi inoltre concorda nel ritenere
l’apoptosi uno dei fattori determinanti nella morte precoce delle cellule neuronali.
Le alterazioni che interessano invece la regione 3’ non tradotta potrebbero influire sulla stabilità
o sul processamento dell’mRNA e la proteina alterata potrebbe legare larghe ripetizioni
trinueleotidiche.
SCA1
Caratteristiche cliniche
Le principali caratteristiche cliniche della Sca1 sono atassia, disartria e disfunzioni bulbari
[Greenfield et al]. La malattia compare solitamente tra i 30 ed i 40 anni ma spesso si presenta
anche nei bambini [Schut et al]. La durata della malattia, dalla comparsa alla morte del
soggetto, varia da 10 a 30 anni, ma pazienti in cui la comparsa è precoce (prima dei 13 anni)
mostrano una progressione più rapida e muoiono prima dei 16 anni [Zoghbi et al]. La maggior
parte dei pazienti, inizialmente, presenta difficoltà nella deambulazione o più frequentemente
disturbi relativi all’articolazione delle parole. I pazienti possono mostrare riflessi tendinei
improvvisi, saccadi ipermetriche e nistagmi negli stadi precoci della malattia. Possono essere
presenti episodi di disfagia moderata evidenziati da tosse in seguito all’assunzione di cibo. Con
il progredire della malattia si può arrivare anche a paralisi. Si possono riscontrare aumenti dei
riflessi, controsenso dell’atassia, ed altri segni cerebellari come dismetria, disdiadocochinesia
ed ipotonia. Inoltre si riscontra un declino nell’intelligenza e nella memoria: il grado di queste
alterazioni è correlato alla gravità della malattia. Nelle fasi finali sono evidenti difficoltà bulbari
(atrofia facciale e dei muscoli della masticazione, fascicolazioni periorali e grave disfagia che
porta frequentemente ad aspirazione); alcuni pazienti sviluppano difficoltà respiratorie che li
portano spesso alla morte.
Genetica molecolare
SCA1 è dovuta all’espansione di una tripletta CAG che, nei soggetti sani va da 6 a 44
ripetizioni, mentre nei pazienti affetti spazia tra 39 e 81 repeats [Goldfarb et al]; è importante
ricordare che nei soggetti sani le ripetizioni sono interrotte da 1-3 trinucleotidi di tipo CAT
negli alleli con 21 o più triplette ripetute, mentre la malattia è portata da sequenze ininterrotte
[Chung et al 1993]: questo dato porta all’ipotesi che la perdita di interruzioni CAT rende il gene
SCA1 (6p22-p23: atassina1) instabile.
SCA2
Caratteristiche cliniche
La manifestazione avviene verso i 40 anni e la durata è di 10-15 anni; la sua progressività può
portare alla comparsa entro i primi 20 anni di vita. I sintomi precoci includono atassia
dell’andatura accompagnata da crampi agli arti inferiori [Orozoco et al]; la maggior parte dei
pazienti presenta tremori, diminuzione del tono muscolare e dei riflessi tendinei nonché
anormali movimenti oculari con diminuzione della progressione delle saccadi fino
all’oftalmoplegia sovranucleare. Sono segnalati anche casi di fascicolazioni (23%) [Belal et al]
e demenza (33%).
Genetica molecolare
Anche questa ADCA è dovuta ad un’anormale espansione della tripletta CAG nel gene SCA2
(12q24: atassia 2) che si ritrova in un numero di 14-34 copie negli alleli sani e 36-64 in quelli
responsabili della patologia.
La frequenza di SCA1 è 1-2:100.000
SCA2 è presente nel 14% mentre SCA1 nel 6% dei casi di ADCA.
SCA3
SCA3, conosciuta anche come sindrome di Machado-Joseph, appare a livello fenotipico simile
a SCA1 e SCA2 con: diplopia, sindrome spastica e polineuropatia sia sensoriale che motoria,
distonia, fascicolazioni facciali e linguali, oftalmoplegia e parkinsonismo. È dovuta
all’espansione della tripletta CAG sul cromosoma 14q32. Il range normale della ripetizione è
compreso tra 12 e 38, mentre quello patologico è tra 56 e 86. L’alterazione genica provoca
un’alterazione a livello della proteina atassina 3 con l’inserzione di uno strech di
poliglutammine che ne altera la conformazione: ciò provoca l'esposizione del dominio di
poliglutammine e determina la formazione di aggregati rilevabili anche a livello della matrice
nucleare [Perez et al]. A livello citologico l’alterazione colpisce prevalentemente le cellule
dello striato che presentano caratteristici aggregati (soprattutto a livello nucleare), indentature
dell’involucro nucleare e vacuolizzazione del citoplasma [Evert et al]. Studi condotti su tessuti
provenienti da pazienti atassici dimostravano la colocalizzazione del complesso 26S
proteasoma negli aggregati di poliglutammina e la proteina in essa compresa mostra forme
differenti dovute a taglio proteolitico: il numero degli aggregati tende ad aumentare in seguito
ad inibizione del proteasoma suggerendo un suo possibile ruolo nella protezione della cellula
dalla formazione degli stessi [Chai et al]. In colture cellulari esprimenti la porzione alterata del
gene MID è stata dimostrata induzione dell’apoptosi e, perciò, una possibile implicazione di
questo fenomeno nella degenerazione neuronale. SCA3 appare distribuita preferenzialmente in
Germania tra i discendenti di William Machado, nativo delle isole delle Azzorre, immigrati in
New England e in numerosi altri stati. La trasmissione della patologia è dominante, presenta
anticipazione soprattutto se avviene per via paterna; secondo alcuni studi mostra “linkage
disequilibrium” con il locus AFM343vf1 [Steanin et al] ed un’interazione interallelica
nell’instabilità intergenerazionale [Igarashi et al]. Può essere interessante notare che la
patologia appare più grave e più precoce in omozigosi, avvalorando l’idea di una perdita o
acquisto di funzione.
Frequenza: 23-36% delle comuni atassie dominanti
SCA6
Malattia progressiva ad esordio tardivo che porta alla degenerazione dei neuroni nel SNC
caratterizzata, da un punto di vista clinico, da atassia cerebellare, degli arti e dell’andatura,
disartria, nistagmo e perdita della propiocezione e della sensazione di vibrazione. La malattia di
solito progredisce dai 20-30 anni portando ad una menomazione degli arti e ad una dipendenza
da sedia a rotelle. La risonanza magnetica del cervello evidenzia atrofia cerebellare; l’esame
microscopico rivela una perdita severa di cellule del Purkinje, moderata di cellule granulose e
dei neuroni del nucleo dentato. Si tratta di una malattia genetica a trasmissione autosomica
dominante provocata da un’espansione della tripletta CAG nel gene CANL1A4, sul cromosoma
19p13, che codifica per la subunità 1A del canale per il Ca++ P/Q (voltaggio dipendente). Gli
individui non affetti da SCA6 mostrano un certo polimorfismo di questo gene con un numero di
triplette CAG da 4 a 16 ed un’eterozigosità del 71%; negli individui colpiti dalla malattia il
numero dei repeat va da 21 a 30. Le ripetizioni sono, comunque, anche in funzione della
popolazione di appartenenza. È interessante notare come altri tipi di mutazioni nello stesso gene
CANL1A4 provochino patologie diverse: HPCA (hereditary paroxysmal cerebellar ataxia), EA
(episodic ataxia) e FHM (familiar haemiplegic migraine). I pazienti affetti da queste forme di
atassia presentano periodi di coordinazione opportunamente normale tra gli attacchi. La
HPCA/EA è provocata da mutazioni frameshift mentre la FHM da diverse mutazioni missenso:
in entrambi i casi si ha perdita di funzione. Gli alleli espansi della CAG determinano, invece,
una alterazione della funzione del canale che porta ad una progressiva perdita neuronale, o a
causa di un alterato rilascio di neurotrasmettitori o di un abnorme incremento di Ca++
intracellulare con successiva morte. Nella SCA6 più che di perdita di funzione perciò si parla di
un acquisto; i repeats CAG, infatti, localizzati in una regione codificante vengono tradotti in un
tratto di poliglutammina. L’età di insorgenza è solitamente tardiva e correlata con l’entità
dell’espansione (28-31 anni con numero di repeats di 27 e 40-50 anni con 22-23 repeats). Non
sono stati riscontrati casi di mosaicismo o cambiamenti intergenerazionali della taglia
dell’allele probabilmente a causa delle piccole dimensioni dell’espansione. Tuttavia essendo
riscontrata anticipazione nell’età di insorgenza tra genitore e figlio senza ulteriore espansione
CAG deve esistere qualche altro fattore che influenza l’esordio della patologia. In un caso di
omozigosità non è stato dimostrato un inequivocabile decremento nell’età di esordio (al
contrario di quanto si verifica per le altre malattie da tripletta), anche se un possibile effetto di
dosaggio genico non può essere completamente scartato. Un’importante differenza con le altre
SCA è rappresentata dalla taglia degli alleli espansi che sono notevolmente più piccoli nella
SCA6 (21-27 repeats) rispetto alle altre (36-121 repeats). Una possibile spiegazione potrebbe
essere attribuita alle sequenze fiancheggianti tradotte che potrebbero avere un effetto protettivo
contro l’acquisto di funzioni provocato dalla contrazione. La SCA6 ha una frequenza del 1030% nell’ambito delle ADCA.
SCA7
Caratteristiche cliniche.
SCA7 è caratterizzata da atassia cerebellare progressiva, con disartria e disfagia, e da distrofia
della retina con perdita progressiva della visione che porta negli adulti affetti alla cecità.
L’atassia cerebellare progressiva con la dismetria e l’incoordinazione possono precedere, ma di
solito seguono, l’insorgenza dei sintomi clinici. L’insorgenza nei neonati e nei bambini ha un
corso particolarmente rapido ed aggressivo spesso associato a perdita di peso ed a difficoltà nel
movimento. L’età varia dall'infanzia, con la progressione accellerata e la morte prematura, fino
alla quinta o più raramente alla sesta decade con una progressione più lenta.
Genetica molecolare
Sebbene l’analisi per Northem blot di SCA7 rivela un RNA dì 7.5 Kb, il gene di SCA7
(cromosoma 3p21-pl2) pubblicato in Genbank è di 3969 bp con un ORF di 2679 codificante per
una proteina di 893aa. L’ataxina-7, il normale prodotto genico di SCA7, ha un PM di circa 95
Kd; la sua funzione è, al momento, sconosciuta sebbene alcune evidenze indichino che può
avere una localizzazione nucleare e che quindi potrebbe funzionare come fattore trascrizionale.
Un tratto di CAG polimorfico si trova all’estremità 5’ tradotta del gene all’interno del primo
esone; gli alleli normali hanno tra 4-19 ripetizioni, mentre gli alleli che sono causa di malattia
hanno da 37 a 100 ripetizioni. Nelle famiglie che hanno questi alleli espansi, la lunghezza delle
ripetizioni tende ad espandersi di generazione in generazione, con espansioni più marcate nella
prole affetta di maschi affetti. Il tratto di CAG nel gene di SCA7 codifica per una serie di Gln:
negli individui non affetti questo tratto di poliGln è di 4-19aa, mentre negli individui affetti è di
37 o più aa; queste proteine anormali si trovano nelle frazioni nucleari e sembrano avere un PM
di circa 130 Kd. Sebbene proprio ultimamente ci siano stati molti studi che hanno correlato il
genotipo osservato di SCA7 al fenotipo, rimangono alcuni dubbi al riguardo. Eccetto che per un
singolo individuo considerato normale con un allele SCA7 che ha 35 ripetizioni CAG, non è
stato rilevato trovato nessun individuo non affetto con più di 19 ripetizioni, anche se sono stati
descritti individui sintomatici con meno di 37 ripetizioni; in generale possiamo dire che alleli
con meno di 20 ripetizioni possono essere considerati “normali”, quelli con più di 37
“patologici”, e quelli con 30-36 ripetizioni “intermedi”, cioè gli individui che li posseggono
possono sviluppare i sintomi o non manifestarli mai e c’è una buona probabilità che possano
avere figli malati.
SCA8
A differenza delle altre atassie spino-cerebellari tale patologia è associata ad un aumentato
numero di ripetizioni del trinucleotide CTG nella regione 3’ UTR dell’mRNA. Anche nella
SCA8 c’è instabilità nella trasmissione dell’allele mutato alla progenie (tale fenomeno è più
marcato se la trasmissione avviene da parte materna). L’esordio clinico è compreso tra i 40 e i
50 anni (esiste anche una forma congenita che comporta ritardo mentale ed attacchi epilettici),
ed ha come segni clinici caratteristici alterazioni del movimento oculare, atassia e disartria. La
progressione della malattia è lenta. La frequenza è del 2-5% nelle ADCA.
SCA12
Caratteristiche cliniche
SCA 12 è caratterizzata da un fenotipo clinico abbastanza variabile: atassia, atrofia corticale e
cerebellare, tremori alle braccia e alla testa, aumentati riflessi tendinei, difficoltà nel
movimento, anormalità nei movimenti oculari e demenza nei pazienti più vecchi. L’età di
insorgenza varia tra gli 8 ed i 55 anni con una maggiore prevalenza nella quarta decade. La
frequenza di SCA12 nelle ADCA è rara.
Genetica molecolare
Il prodotto normale dei gene SCA12 codifica per la subunità regolatoria cervello-specifica della
proteina fosfatasi 2A, PP2A, che è una serin-treonina fosfatasi avente un ruolo regolatorio in
molti processi cellulari, come la crescita (progressione nel ciclo e divisione), la contrazione
muscolare, la trascrizione genica, la fosforilazione della proteina tau e l’apoptosi. Un tratto
CAG polimorfico si trova all'estremità 5’ tradotta del gene, probabilmente a monte del sito
d’inizio della trascrizione; gli alleli normali hanno meno di 29 ripetizioni, mentre quelli
patologici hanno tra 66 e 93 ripetizioni ininterrotte.
Altre SCA
Atassia
Frequenza
Cromosoma
SCA4
Famiglia
scandinava
16p22.1
SCA5
Discendenti
dei nonni
paterni di
A.Lincoln
11p12-q12
12q13
SCA10
Anticipazione
Segni clinici
Patologia
Atrofia
Esordio tra 19 cerebellare
con perdita
e 59 anni.
delle cellule
Disturbi
Non evidente dell’andatura del Purkinje.
Perdita degli
ed anormali
movimenti fini assoni delle
colonne
delle dita.
posteriori del
midollo
spinale
Probabile, se è Esordio tra 10
trasmesso
e 68 anni.
dalla madre Leggera atassia
e disartria:
Marcato,
Esordio tra 10
specialmente e 40 anni.
se di
Disfunzione
derivazione principalmente
paterna:
cerebellare.
SCA11
Famiglia
Britannica
15q14-21.3
Esordio 25 ± 8
anni. Atassia
lentamente
progressiva
con disartria ed
alterazioni
dell’andatura.
COME SONO STATE INDIVIDUATE LE MUTAZIONI
RESPONSABILI DELLE SCA
Le regioni trinucleotidiche espanse sono state individuate e caratterizzate mediante
DIRECT e RED.
 Il gene dell’atassia spinocerebrellare di tipo 2 è stato, ad esempio, identificato con la
tecnica DIRECT (Sapei K, Takano H, Igarashi S, et al. Identification of the
spinocerebrellar ataxia type 2 gene using a direct identification of repeat expansion and
cloning technique, DIRECT. Nat Genet 1996; 13: 277-84). Essa consiste in quattro fasi:
1. Preparazione di un “probe” radioattivo sfruttando una reazione di PCR in
presenza di ( -32P ) dATP, che utilizza come stampo il DNA genomico estratto
da linfociti periferici di pazienti che portano la tripletta espansa presa in esame
(nell’esempio la tripletta CAG) in modo tale da creare una sonda marcata
internamente e non terminalmente con la deossinucleotidil transferasi. In questo
modo saranno riconosciute esclusivamente le triplette patologiche. Il primer
“reverse” porta legata al 5’ una molecola di biotina.
2. Separazione del filamento usando delle sferette magnetiche a cui è legata una
molecola di streptoavidina: si fanno reagire i prodotti di PCR con tali sferette e
dopo lavaggio il filamento marcato radioattivamente può essere recuperato
selettivamente.
3. Identificazione delle triplette espanse patologiche per Southern blot in
condizioni di ibridazione stringenti in modo tale da poter rilevare selettivamente
le ripetizioni patologiche.
4. Clonaggio del segmento di DNA genomico contenente l’espansione patologica.
 Un altra metodica adoperata per lo studio di malattie da triplette è la tecnologia RED
(Schalling M, Hudson TJ, Buetow KH, Housman DE. Direct detection of novel expanded
trinucleotide repeats in the human genome. Nat Genet 1993; 4: 135-9.):
Essa è basata sull’uso di DNA genomico, estratto dai linfociti del sangue periferico di
pazienti con atassia dominante, come stampo di vari cicli di “annealing” e “ligation” di
oligonucleotidi specifici complementari alla tripletta ripetuta nello stampo. Gli
oligonucleotidi utilizzati in questi cicli di “annealing”, “ligation” e denaturazione, sono
tutti fosforilati, utilizzando dATP, con una Kinasi. Quando c’è la reazione di “annealing”
gli oligo appaiati sul DNA genomico nelle immediate vicinanze, sono ligati in modo da
formare una molecola di dimensioni maggiori. In questo modo alla fine di “n” cicli si
otteranno molecole di differenti dimensioni, separati su gel di poliacrilamide denaturante e
successivamente trasferiti su filtro di nitrocellulosa. Infine per ibridazione con
oligonucleotidi, marcati terminalmente al 3’ con 32P dATP usando la terminal
deossinucleotidil transferasi, saranno analizzati per autoradiografia.
COME SI DIAGNOSTICANO LE SCA?
La diagnosi su base unicamente clinica difficilmente riesce a distinguere fra le diverse
forme di SCA, è quindi necessario stabilire una corretta diagnosi del paziente che si basa
sia sull’esame neurologico sia sull’utilizzo di specifiche tecniche di genetica molecolare (e
che laddove possibile raccolga informazioni sulla storia familiare).
ANAMNESI: è sufficiente una storia familiare di tre generazioni con attenzione ad
eventuali altri parenti che presentino gli stessi sintomi neurologici sia attraverso l’esame
diretto di questi individui sia attraverso un riesame dei loro registri medici che includono i
risultati dei test di diagnosi molecolare, gli studi di neuro-imaging e i risultati d’esami
d’autopsie.
TEST DI DIAGNOSI MOLECOLARE: circa il 50% delle atassie dominanti ereditarie
(SCA1, SCA2, SCA3, SCA6, SCA7) possono essere identificate con specifici test diretti
mediante PCR, utilizzando primer che ibridizzano con le sequenze fiancheggianti la
ripetizione.
Esistono però una piccola percentuale di SCA di cui non è noto il gene responsabile della
patologia, (SCA 4-5-10-11) ma delle quali si conosce il locus genico.
In questi casi si ricorre ad un’analisi di “linkage” utilizzando dei marcatori genetici noti.
Tali marcatori per essere considerati come tali devono possedere le seguenti caratteristiche:
1. essere polimorfici all’interno della popolazione
2. cosegregare con il gene patologico ignoto
3. essere rappresentativi, essere cioè presenti in almeno il 20% della popolazione affetta
Come marcatori sono utilizzati piccoli blocchi di unità ripetitive (di-tri-tetranucleotidiche)
sparse nei cromosomi che conservano lo stesso numero di ripetizioni nel corso delle
generazioni. Tali sequenze sono chiamate microsatelliti o STR (repliche brevi a tandem).
Dopo averle identificate e aver caratterizzato le sequenze fiancheggianti, è possibile
amplificando tali regioni, risalire all’aplotipo dei familiari dell’affetto in modo da costruire
l’albero genealogico e discriminare tra alleli sani e alleli patologici.
Bioetica
Prima dell’introduzione di un test genetico nella pratica clinica è indispensabile che siano
valutati i benefici ed i rischi associati sia ai risultati positivi che a quelli negativi del test.
Bisogna, innanzitutto, tenere presente che il numero di malattie genetiche di cui sia possibile
modificare l’insorgenza o il decorso attraverso trattamenti specifici è al momento attuale
molto limitato. Pertanto una diagnosi effettuata attraverso un test genetico non necessariamente
comporta un miglioramento sul piano strettamente clinico (è questo il caso di patologie ad
esordio tardivo ed invalidanti come HD e SCA). Tuttavia, tra i possibili benefici dei test
genetici, ancorché con risultato positivo, è certamente da includere anche una consapevole
programmazione della riproduzione e la eventuale scelta di percorsi che prevengono la
trasmissione alle generazioni future. Questo sembra essere il motivo principale per cui i
soggetti ad alto rischio richiedono test di diagnosi molecolare per HD e SCA. Inoltre, deve
essere considerato il disagio psicologico, talora molto intenso, di chi, essendo a rischio per una
malattia genetica, vive quotidianamente in una condizione di incertezza per il proprio futuro. In
situazioni di questo genere, talora il risultato di un test genetico, anche se sfavorevole, può
comportare un miglioramento della propria condizione psicologica. I dati a questo proposito
sono, però, frammentari e discordanti, in quanto sono stati condotti studi - sulla HD soprattutto
- con un follow-up a breve termine (circa 1 anno post-test), mentre mancano dati relativi a
periodi di tempo più lunghi. Tra i benefici di un risultato negativo vi è la rassicurazione che la
malattia probabilmente non si manifesterà in futuro. Ma anche un risultato negativo può portare
ad effetti indesiderati quali la “sindrome del sopravvissuto” o a crisi di identità. Nel caso della
diagnostica prenatale, i genitori potranno su questa base continuare la gravidanza sapendo che il
figlio non è affetto dalla malattia per cui si era fatto il test. In più, i test genetici possono
rivelare informazioni anche sul futuro stato di salute di consanguinei del soggetto che vi si è
sottoposto. L’eventuale comunicazione del risultato del test a parenti potrebbe costituire una
lesione del loro diritto a non conoscere la propria condizione genetica; ma una mancata
comunicazione potrebbe, invece, costituire la sottrazione di un’informazione importante per la
loro salute o per quella dei loro figli. Infine, il risultato di un test genetico potrebbe essere usato
da compagnie di assicurazione o datori di lavoro per operare una discriminazione nei confronti
di persone ad alto rischio per una malattia genetica. Tra i limiti di un test predittivo per HD e
SCA bisogna sicuramente considerare che la diagnosi molecolare può fornire informazioni sulla
futura manifestazione di una patologia, ma attualmente non fornisce informazioni sull’età di
insorgenza e sulla gravità della malattia. Per sottoporsi ad un test genetico è necessario un
consenso informato volontario nel nostro Paese (nessuno - parente o ente assicurativo, ad es.,
può richiederlo per un altro individuo, al contrario di ciò che accade in altri paesi), come
risultato di un processo che deve aiutare il soggetto a decidere se sottoporsi o meno al test. Il
soggetto al quale viene offerto un test genetico deve ricevere una completa informazione sui
suoi aspetti tecnici, sulle sue finalità, nonché sugli eventuali trattamenti o interventi che
potranno essere attuati a seconda del tipo di risultati. Deve inoltre essere informato dei vantaggi
che ne possono derivare e dei rischi ai quali va incontro, in modo da motivare autonomamente
la volontà di sottoporsi al test. La conoscenza della sensibilità del valore predittivo del test
permette al soggetto di valutare meglio le modificazioni del rischio di malattia che possono
derivare dal risultato del test. A questo proposito, bisogna considerare che la sensibilità, sarà
sicuramente più alta nei test diretti, in cui si analizza direttamente il gene la cui attivazione è
causa della patologia, mentre risulterà inferiore nei test per malattie di cui si conosce solo il
locus genico. È il caso questo di alcune SCA, la cui diagnosi molecolare può essere effettuata
per linkage. I limiti dell’accuratezza di questa tecnica includono la ricombinazione tra i
markers e la mutazione, la struttura del pedigree e la necessità di poter disporre di un alto (
20) numero di individui di una data famiglia. Inoltre, l’analisi per linkage è molto costosa,
richiede tempo e il risultato, come già detto, non è certo. Mentre, infatti, l’accuratezza del test
diretto è del 100%, quella del test per linkage è del 95-99% (in relazione alla vicinanza dei
markers dal putativo sito della mutazione).
Il potenziale utente deve, inoltre, essere informato:
1) della modalità e dei tempi di esecuzione e comunicazione del risultato;
2) delle indicazioni dei possibili risultati;
3) dei sistemi adottati per la tutela della riservatezza dei risultati e di chi abbia accesso ad essi.
Non possono partecipare a programmi di test predittivi per HD e SCA i minorenni, anche
nonostante la richiesta dei genitori e i bambini che devono essere adottati, in quanto non
possono decidere se sottoporsi o meno al test. Sotto questo punto di vista, la diagnosi prenatale
costituisce, invece, un’eccezione. Questa può essere, infatti, effettuata, avvalendosi di tecniche
invasive per il prelievo del DNA fetale e protocolli di diagnosi molecolare e può essere
eventualmente seguita, in caso di risultato positivo al test, da interruzione di gravidanza. Il
risultato del test è protetto dalla legge sulla privacy e solo in circostanze eccezionali (coma
prolungato, morte e etc.) esso può essere comunicato ai membri della famiglia. La consulenza
di supporto non deve essere fornita solo nel periodo pre-test, ma è molto importante anche in
quello post-test, sia in caso di risultato positivo che negativo.
KIT PER LA DIAGNOSI
Le atassie dominanti sono una categoria di malattie neurodegenerative caratterizzate al livello
molecolare da un’espansione di triplette (CAG,CTG), che interessa porzioni diverse di genoma.
Ai fini della diagnosi risulta importante determinare l’entità dell’espansione in modo da
definire se il numero di ripetizioni ricade in un ambito patologico, di premutazione o in un
range normale. A tale scopo per le SCA di cui è noto il gene (1,2,3,6,7,8) si effettua una
reazione di amplificazione dei repeats trinucleotidici suscettibili ad espansione, all’interno del
gene di interesse. La discriminazione tra le varie forme atassiche viene garantita dall’utilizzo di
oligo specifici disegnati in modo da riconoscere selettivamente le diverse regioni contenenti i
repeats. Tali oligo sono studiati in modo da poter usare le stesse condizioni di reazione con la
possibilità di screenare contemporaneamente uno stesso campione per più forme atassiche. Per
le SCA di cui non si conosce il gene interessato, ma solamente il locus (4,5,10,11), la diagnosi
può essere effettuata per linkage, sfruttando la cosegregazione di specifici markers
microsatellitari con l’alterazione responsabile della patologia. Per quel che riguarda SCA 12,
pur essendo stata individuata una regione di triplette ripetute al 5’ del gene, ma non essendo
ancora nota la reale natura della mutazione, non si fornisce kit o servizio di service di diagnosi.
Formulazione di kit nazione specifici
Il kit contiene gli strumenti per la diagnosi diretta delle forme atassiche dominanti in relazione
all’incidenza delle stesse nei differenti paesi europei. Avendo presente, infatti, la peculiare
distribuzione delle SCA, si è pensato ad un kit “nazione specifico” studiato in modo da
effettuare una diagnosi più rapida e mirata.
 Kit “Italia”
SCA 1 - SCA 2
 Kit “Francia/Spagna”
SCA 1 - SCA 2 - SCA 3 SCA 7
 Kit “Portogallo”
SCA 1 - SCA 2 - SCA 3
 Kit “Gran Bretagna/Irlanda” SCA 1 - SCA 2 - SCA 6 - SCA 7
 Kit “Germania/Austria”
SCA 1 - SCA 2 - SCA 3 - SCA 6
 Kit “Scandinavia/Benelux” SCA 1 - SCA 2 - SCA 7
I componenti di ciascun kit permettono la diagnosi di 70 campioni circa, per ogni singola SCA
contenuta nel kit.
Frequenze delle SCA in Europa e nel mondo
Europa
Italia: Sca 1 (frequente nel nord), Sca 2 (50% nel sud)
Spagna: Sca 2 (15%), Sca 3 (15%), Sca 1 (6%; soprattutto in catalogna), Sca 7 (3%),
Sca6(1%), Non classificate (58%)
Germania:Sca 3 (41%), Sca 6 (22%), Sca 2 (10%), Sca 1 (9%)
Inghilterra: Sca 1 (molto frequente), Sca 6( 50% delle ADCA III), Sca 11 (rara: 2 famiglie),
Sca7
Francia: Sca 7, Sca 3
Belgio: Sca 7
Scandinavia: Sca 7
Portogallo: Sca 3
Asia
Giappone: Sca 3
Nord America
USA: Sca 3, Sca 5 (rara, deriva dai nonni paterni di A.Lincoln)
Sud America
Brasile: Sca 3
SERVIZI "SERVICE"
È possibile, inoltre, diagnosticare SCA di cui non è consentita l’identificazione con uno
specifico kit, o acquistandone uno che contenga gli strumenti per detta diagnosi, oppure
avvalendosi di un servizio Service, effettuato dalla ditta produttrice. I servizi Service
comprendono, inoltre, la diagnosi di SCA molto rare (8) e la diagnosi per linkage di SCA
4,5,10,11.
Il kit contiene
a. Kit estrazione DNA da sangue periferico e da amniociti
b. Kit amplificazione per PCR dei repeats trinucleotidici
c. Markers di peso molecolare per gel agarosio 2% idonei per individuare i ranges di
appartenenza dei differenti alleli SCA
d. Markers di peso molecolare per gel acrilammide 5%/8M urea per individuare il numero di
triplette dell’allele SCA, con un massimo di risoluzione nel range premutazionale al limite
con quello sano e patologico.
N.B. il kit contiene le procedure per la produzione dei vari reagenti da parte della ditta
produttrice e i protocolli di utilizzo da parte dell’utente. È a discrezione della ditta produttrice
quali informazioni divulgare sulla costruzione del kit.
Kit estrazione DNA
Il kit permette l’estrazione di DNA da sangue venoso periferico, e da amniociti (per la diagnosi
prenatale). Il kit che permette l’estrazione di DNA da sangue richiede un volume massimo di
partenza di 2 ml con una resa di 200 ng/l; la lisi sequenziale di eritrociti e leucociti con
successiva estrazione con :CHCl3:IAA migliora la resa della reazione ed il grado di purezza
del DNA, limitandone la frammentazione in breve tempo. Il kit di estrazione di DNA da
amniociti (prelevabili per il tipo di analisi già alla 5°-6° settimana) permette di ottenere un’alta
qualità del DNA in modo rapido ed efficiente, partendo da un volume di circa 10ml.
Contenuto del kit
(le quantità dei reagenti sono settate per permettere l’estrazione di DNA da 50 campioni di
sangue e 20 di liquido amniotico)
1) 1l (2 bott. da 500 ml) soluzione A (tampone di lisi per eritrociti): 9 vol NH4Cl 0.15 M,
1vol Tris-HCl 0.15 M pH 7.65
2) 250 ml soluzione B (lavaggio) : NaCl 0.15 M
3) 100 ml soluzione C (tampone di lisi per leucociti) : Tris-HCl 10 mM, EDTA 10 mM,
NaCl 100 mM pH 8.4
4) 75 ml soluzione D : SDS 10%
5) 1 ml soluzione E: RNAsi 10 mg/ml
6) 2.5 ml soluzione F: Proteinasi K 20 mg/ml
7) 400 ml (2 bott da 200 ml) soluzione G: EtOH freddo 100%
8) 20 ml soluzione H: NaAc 3M pH 5.2
9) 40 ml soluzione I: EtOH freddo 70%
10) 12 ml soluzione L (TE) : Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM pH 8
11) 10 ml soluzione M (tampone di lisi per leucociti) : Tris-HCl 50 mM pH 7.5, EDTA 1
mM pH 8, NaCl 100 mM
N.B. le soluzioni E, F, G e I vanno conservate a –20°C, le altre a temperatura ambiente
Reagenti aggiuntivi

Soluzione di estrazione: :CHCl3:IAA (25:24:1)
N.B. la soluzione di estrazione non viene fornita dalla ditta per motivi di sicurezza legati al
trasporto del fenolo.
Protocollo (estrazione del DNA dal sangue)
1. 2 ml di sangue periferico
2. Aliquotare 10 ml di soluzione A e riscaldare 10’ a 37°C
3. Versare 2 ml di sangue in falcon 15 ml; aggiungere 10 ml soluzione di lisi per eritrociti;
agitare per inversione
4. Incubare 15’ a 37°C
5. Pellettare a 2500 rpm per 10’ ed eliminare il sovranatante
6. Aggiungere al pellett 2 ml di soluzione B
7. Pellettare a 2500 rpm 10’ ed eliminare il sovranatante
8. Risospendere il pellet in 2-4 ml di soluzione C
9. Aggiungere 40 l di soluzione D e 20 l di soluzione E
10.Incubare 30’ a 37°C
11.Aggiungere 1.34 ml dio soluzione D e 20 l di soluzione F
12.Incubare 10’ a 60°C
13.Estrarre con un volume di soluzione di estrazione ed agitare
14.Centrifugare a 3000 rpm per 10’
15.Prelevare il sovranatante evitando di toccare l’interfacie
16.Precipitare con 2 volumi di soluzione G e 350 l soluzione H
17.Mescolare per inversione fino alla comparsa di un precipitato translucido (DNA),
raccogliere il precipitato con una bacchetta di vetro sterile ed immergerlo in un eppendorf
contenente 500 l di soluzione I fredda
18.Lasciare asciugare all’aria
19.Risospendere in 200 l di soluzione L e lasciare per 1h in agitazione a 4°C
20.Conservare il campione a 4°C
Protocollo (estrazione del DNA da amniociti)
1. Trasferire il liquido amniotico in un falcon da 15 ml ed aggiungere la soluzione B fino a
riempirlo
2. Centrifugare per 20’ a 4000 rpm 4°C
3. Eliminare il sovranatante
4. Aggiungere al pellet:
a. 300 l di soluzione M
b. 60 l di soluzione F
c. 19 l di soluzione D
5. Incubare 1h a 56°C
6. Aggiungere 2 volumi (750 l) + 2 volumi (750 l) di cloroformio/IAA
7. Centrifugare per 5’
8. Prelevare il sovranatante (~400l) e aggiungere
a. 135 l di soluzione H 6M pH 7.5
b. 800 l di soluzione G fredda
9. Incubare 30’ a –80°C
10. Centrifugare 15’ a 10000 rpm a 4°C
11. Eliminare il sovranatante e lavare con soluzione I; lasciare seccare il pellet
12. Risospendere in 50 l di soluzione L
Kit amplificazione
Il kit permette di amplificare i diversi alleli SCA, utilizzando primers specifici per le regioni
che fiancheggiano i repeats trinucleotidici. I primers sono stati disegnati in maniera da
standardizzare le condizioni di PCR, esibendo Tm simili (70-75°C) al fine di effettuare un
annealing comune a 65°C. La standardizzazione della razione premette di effettuare su uno
stesso campione la diagnosi contemporanea di più SCA, minimizzando i tempi ed evitando
continui settaggi delle apparecchiature utilizzate per la PCR. La PLATINUM pfx DNA
polimerasi permette di migliorare sia la specificità che la sensibilità nonché la resa della
reazione grazie alle sue peculiari caratteristiche:
 Attività proofreading esonucleasica 3’ – 5’
 Hot start di reazione (dovuto al complessamento con un anticorpo rilasciato solo ad alte
temperature), che riduce o elimina l’amplificazione non specifica ed aumenta il tempo
di attività dell’enzima, migliorando la resa della reazione.
Componenti del kit
 70 eppendorfs da 0.250 ml con 48 l di Master mix SCA specifica
 250 unità totali di Platinum pfx DNA polimerasi (2.5 unità per l)
MASTER MIX SCA-SPECIFICA
10 pfx ampl buffer
PCR enhancer solution
50 mM MgSO4
Primer forward 10 M
Primer reverse 10 M
10 mM dNTPs
H2O distillata sterile
totale
1X
1X
1 mM
0.3 M each
0.3 M each
0.3 mM each
5 l
5 l
1 l
1.5 l
1.5 l
1.5 l
32.5 l
48 l
Il buffer PCR per enhancher solution 10X in associazione con il pfx amplification buffer 10X
abbassa la temperatura di melting (Tm) del DNA. In questo modo la temperatura di annealing
del primer è abbassata approssimativamente di 2°C per il buffer pfx amplification. La
combinazione di questi 2 buffer è ottimale per l’amplificazione di regioni ricche in GC.
Le sequenze dei primer SCA specifici sono allegate alla fine del fascicolo. Esse sono state
elaborate con il software “Primer 3” introducendo la sequenza contenente e fianceggiante
l’espansione e settando range di Tm, GC% e lunghezza dell’amplificato.
Protocollo:
 Scongelare in ghiaccio l’eppendorf contenente la master mix
 Aggiungere il DNA stampo (200 ng)
 Aggiungere Platinum pfx DNA pol 2-5 unità/l  0.4-1.0 l (10/2.5 unità)
Per l’amplificazione delle regioni ripetute di dimensioni comprese tra un minimo di 100 bp ed
un massimo di 300 bp, non considerando i massimi alleli patologici di SCA 1-3-7 (in
quest’ultimo caso si può avere un frammento di oltre 700 bp corrispondenti a >200 repeats),
bastano 1.25 unità di platinum pfx DNA pol.
Condizioni di amplificazione*
Denaturazione 94°C  2 min
Denaturazione 94°C  15 sec
Annealing
65°C  30 sec
Extend
68°C  1 min
Final extend 68°C  10 min
25-35 cicli
*= le condizioni di amplificazione sono state testate su Perkin-Elmer GeneAmp PCR System
9600
I frammenti amplificati vanno corsi su gellino di agarosio 2% per circa 60-90’ a 100V in TBE
0.5X ed evidenziati con etidio bromuro sotto lampada UV. In queste condizioni si dovrebbe
ottenere una completa separazione delle bande corrispondenti ai marcatori di peso molecolare
utilizzati, con la possibilità di individuare il range di appartenenza degli alleli SCA (normale,
premutazionale, patologico). Quando la migrazione degli alleli non risulta chiara, è opportuno
passare ad un’analisi più dettagliata su gel di acrilammide 5%/8M urea. I criteri per
approfondire l’analisi degli amplificati verranno illustrati in seguito.
Marker per gel di agarosio
I marcatori di peso molecolare utilizzati per la corsa su gel di agarosio consentono una discreta
individuazione del peso molecolare degli alleli SCA. Questi sono stati ottenuti digerendo il
plasmide pBR322 con l’enzima di restrizione Hinf I, che produce i seguenti frammenti:










1631
517
506
396
344
298
221
220
154
75
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
Preparazione del marker
Digestione di 10g del plasmide pBR322 con l'enzima di restrizione Hinf I a 37°C per 4h
-
DNA 10 g
Buffer 10X 50l
-
Hinf I 10 U
H2O fino a 500l
Il buffer 10X dell’enzima Hinf I è costituito da: Tris-HCl 500 mM, MgCl2 100 mM, NaCl 1M,
DTE 10 mM
Dopo che è completamente digerito (si vede se su gel d’agarosio si ottiene il suddetto pattern di
bande che ci si aspetta) aggiungere 166.6 l di dye 6X e 334 l di H2O (quindi il volume finale
sarà 1ml). In tal modo si otterrà un marker la cui concentrazione sarà 100 ng/l. Per ogni corsa
elettroforetica diagnostica si consiglia di caricare 10 l.
La corsa su gel di agarosio consente, tuttavia, un’analisi di prima generazione utile per la
diagnosi solo se la taglia dell’allele ricade sicuramente in un range normale o patologico.
Qualora l’operatore non riuscisse ad estrapolare un risultato di certezza, o volesse un’analisi
alla tripletta, è possibile ricorrere al gel di acrilammide.
Data la taglia degli amplificati degli alleli SCA……
Minimo allele
Massimo allele
sano
sano
SCA 1
149 bp
263 bp
(6 repeats)
(44 repeats)
SCA 2
113 bp
173 bp
(14 repeats)
(34 repeats)
SCA 3
107 bp
185 bp
(12 repeats)
(38 repeats)
SCA 6
120 bp
156 bp
(4 repeats)
(16 repeats)
SCA 7
137 bp
182 bp
(4 repeats)
(19 repeats)
......per analizzare i risultati della corsa si consiglia
I  allele  G
SCA 1
G  allele  F
Allele > F
allele  I
SCA 2
I  allele  H
allele  G
allele  I
SCA 3
I  allele  F
allele > F
allele  I
SCA 6
I  allele  H
allele > H
allele  I
SCA 7
I  allele  F
Minimo allele
patologico
248 bp
(39 repeats)
179 bp
(36 repeats)
239 bp
(56 repeats)
171 bp
(21 repeats)
236 bp
(37 repeats)
Massimo allele
patologico
380 bp
(83 repeats)
263 bp
(64 repeats)
329 bp
(86 repeats)
201 bp
(31 repeats)
425 bp (>725 bp)
(100
(>200)repeats)
normale
Analisi acrilammide
Patologico
normale
Analisi acrilammide
Patologico
normale
Analisi acrilammide
Patologico
normale
Analisi acrilammide
Patologico
normale
Analisi acrilammide
allele > F
Patologico
Al fine di ottenere una diagnosi di estrema precisione per stabilire il numero di ripetizioni
dell’allele analizzato, si effettua una corsa su gel di acrilammide 5%/8M urea in condizioni di
potenza costante di 40 W (voltaggio e amperaggio al massimo) per almeno 90’.
Marker per gel di acrilammide
La discriminazione su gel di acrilammide prevede l’utilizzo di due tipi di marker di peso
molecolare: lo small ladder ed il long ladder. Il primo consente la distinzione tra alleli che
differiscono per una singola tripletta, con un massimo di risoluzione nella zona compresa tra
150 e 250 nucleotidi ( range premutazionale degli alleli SCA, al limite tra il normale ed il
patologico); il marker in esame è costituito da un oligonucleotide di sintesi, caratterizzato da
una sequenza di triplette ripetute. Il long ladder marker, invece, è costituito da bande che
migrano come sequenze oligonucleotidiche pari a multipli di 39 nucleotidi, per consentire
all’operatore di orientarsi rispetto allo small ladder.
Preparazione dello small ladder marker
1) Sintesi chimica di un oligonucleotide (AAC)13 di 39 basi
2) Reazione di fosforilazione con l’enzima polinucleotide chinasi (PNK) per inserire un
gruppo fosfato al 5’ dell’oligonucleotide
a. Oligonucleotide (1X)
b. Buffer PNK 10X (500 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 5 mM
DTT, 1 mM spermidina pH 8.2)
c. PNK (almeno 2 volumi per g DNA)
d. H2O per volume finale di 20 l  30’ a 37°C
3) Precipitazione con 2 l NaAc 3M pH 5.2 e 50 l EtOH 100% e risospendere in H2O
4) Reazione di ligazione con enzima ligasi a 22°C:
Buffer 10X (660 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl2, 10 mM DTT, 10 mM ATP)
Enzima ligasi 1 volume per g
DNA
H2O per un volume finale di 20 l  over night
5) Precipitazione della ligation con NaAc ed EtOH
6) Purificazione da gel di acrilammide 5%/8M urea del pezzo di 195 basi
7) Ligation con sequenza non specifica di DNA ss di sintesi di 45 basi con sito Eco RI
all’estremità 5’
8) Purificazione da gel di acrilammide 5%/8M urea di una banda di 240 basi
9) Sintesi di oligo di sequenza casuale di 30 basi con sito Hind III all’estremità 3’
10) Reazione di chinasi dell’oligo di 30 bp per aggiungere il fosfato all’estremità 5’
11) Ligation del pezzo di 240 bp del pezzo di 240 bp con l’oligo da 30 a 22°C
12) Purificazione della banda di 270 bp da gel di acrilammide 5%/8M urea
13) Reazione di sequenza con un primer complementare all’oligonucleotide aspecifico di 45
basi e solamente con ddCTP
14) Il pattern di bande aspettato è: 48,51,54,57,60,63 fino a 240 (sempre di 3 in 3) segue la
sequenza del tratto di 30 bp, dove le C sono inserite in modo casuale
Preparazione del long ladder marker
1) Eseguire le prime 6 reazioni della preparazione dello short ladder
2) Purificazione da gel di acrilammide denaturante dei pezzi rimanenti (dimeri,trimeri fino
a 13x).
3) Il pattern di bande aspettato é: 78,117,156,234,273,312,351,390,429,468,507.
I due marker vanno caricati (4l each) in pozzetti diversi al fine di risultare: il long ladder di
riferimento per lo short ladder e quest’ultimo di riferimento per il campione.
Operazioni da effettuare per il mantenimento del marker per gel di acrilammide in batteri
Questa parte è rivolta alla ditta produttrice cui sarà affidato il compito,una volta ottenuto, di
mantenere il marker di peso molecolare per gel di acrilammide.
1) Reazione di PCR utilizzando come templato il pezzo purificato di 270 basi e come
primer 2 oligo complementari alle sequenze fiancheggianti la regione ripetuta AAC
(detti primer F e R).
Purificazione su gel di agarosio 1.5% dell’amplificato di 270 bp.
Digestione in alti sali EcoRI-Hind III della banda di 270 bp
Estrazione con Φ:CHCl3:IAA
Precipitazione con 2.5 volumi di ET-OH 100% e 0.1 volumi sodio acetato 3M pH=5.2
Preparazione del vettore di clonaggio (che possiede polilinker con i siti EcoRI e Hind III
e il gene che conferisce la resistenza all’ampicillina) : digestione EcoRI-Hind III in alti
sali del vettore, purificazione su gel di agarosio 1%, estrazione con Φ:CHCl3:IAA e
precipitazione con 2.5 volumi di ET-OH 100% e 0.1 volumi sodio acetato 3M pH=5.2.
7) Reazione di ligazione a 16°C tra il vettore e la banda entrambi digeriti EcoRI-Hind III,
che non danno estremità compatibili, così che l’inserimento della banda nel vettore può
avvenire in un unico modo.
8) Trasformazione per elettroporazione di ceppi batterici incapaci di attuare
ricombinazione perché hanno perso il gene RecA; le condizioni di elettroporazione sono
25μF 200Ω 2500V.
9) Piastramento su piastre di ampicillina → Inoculo→ Estrazione di DNA plasmidico
10) Come controllo della qualità del DNA plasmidico preparato che conterrà clonata la
banda con la sequenza ripetuta sono possibili varie strategie:
 Digestione diagnostica EcoRI-Hind III del DNA plasmidico e controllo su gel di
agarosio 1.5% del rilascio della banda di 270 bp.
 Reazione di PCR con i primer F e R usando come stampo il DNA plasmidico e
controllo su gel di agarosio 1.5% della presenza di un amplificato di 270 bp.
Reazione di sequenza del DNA plasmidico con primer F e/o R.
2)
3)
4)
5)
6)
Rivelazione delle bande su acrilammide
L’ evidenziazione delle bande su gel di acrilammide si basa sulla tecnica del Silver staining,
evitando l’utilizzo di radioattivo o di fluorocromi; la procedura risulta rapida e semplice.
Per ulteriore semplificazione alleghiamo il
Protocollo








Porre il gel in EtOH 10% per 5’
Ossidare il gel in soluzione di acido nitrico 1%
Sciacquare in H2O distillata per pochi secondi
Porre il gel in una soluzione di nitrato di argento 12 mM per 20’
Effettuare un rapido lavaggio in H2O distillata
Ridurre il gel in una soluzione di carbonato di sodio anidro 0.28 M e 0.019% formalina,
cambiando la soluzione riducente ogni volta che diventa scura e incubando il gel fino a
che l’immagine raggiunge l’intensità desiderata
Bloccare il processo di riduzione ponendo il gel in acido acetico glaciale 10% per 2’
Infine sciacquare il gel in H2O distillata per pochi secondi e lasciare così tutta la notte per
avere un’immagine permanente
Nota: Il gel va fatto aderire sulla lastra per una più facile manipolazione (Si lava la lastra con
2ml di Repel silano e, dopo asciugatura, si effettua un lavaggio con EtOH)
DIAGNOSI PER LINKAGE DI SCA
La diagnosi molecolare per linkage richiede l’analisi di markers polimorfici che vengono
coereditati in associazione con l’alterazione responsabile della patologia. Tali marcatori sono
rappresentati dalle diverse forme alleliche di sequenze di microsatelliti, localizzate nelle strette
vicinanze del locus contenente l’espansione trinucleotidica. Quanto più il microsatellite è vicino
alla regione di interesse, tanto minore è la probabilità di ricombinazione marker-alterazione ()
ed è tanto maggiore la loro associazione e la certezza diagnostica (95-99%). La probabilità di
associazione viene preventivamente valutata tramite il parametro statistico del “LOD score”, al
fine di definire la significatività del linkage: un LOD score >3 è considerato statisticamente
valido. L’analisi di un cospicuo numero di individui appartenenti alla famiglia del soggetto in
esame consente di determinare l’aplotipo associato alla patologia. L’aplotipo di un individuo è
determinato dalla presenza di un particolare allele microsatellitare polimorfico per individuare
il quale è necessaria una reazione di amplificazione. Il confronto degli aplotipi dei diversi
familiari con l’aplotipo associato alla patologia consente di diagnosticare la patologia anche in
coloro in cui non si è ancora manifestata (diagnosi preclinica e prenatale). Di alcune SCA
(4,5,10 e 11) non si conosce il gene, per cui l’unico mezzo per la diagnosi è rappresentato
proprio dal linkage
Diagnosi di SCA4
SCA4 risulta associata a 3 marcatori presenti sul cromosoma 16: D16S422, D16S514,
D16S397
D16S422: è un repeat dinucleotidico presente in 9 forme alleliche nella popolazione caucasica.
Le forme più rappresentate sono la 3 (200bp) e la 7 (208bp) con una frequenza del 28%
ciascuna e la 6 (206bp) con una frequenza del 6%. L’associazione di D165422 con SCA4 è data
da un LOD score = 4.08 e  = 0.00.
I primers utilizzati per l’amplificazione sono:
- AFM249XC5a
5’- CAGTGTAACCTGGGGGC - 3’
- AFM249XC5m
5’- CTTTCGATTAGTTTAGCAGAATGAG - 3’
La lunghezza minima dell’amplificato è 188bp; quella massima 212bp.
Le condizioni di amplificazione sono:
[Mg2+] : 15 mM
T annealing : 55°C
conc primers : 1 M
Protocollo :
- Temperatura iniziale di denaturazione : 96C
- Tempo iniziale di denaturazione : 5’
- Temperatura finale di estensione : 72C
- Tempo finale di estensione : 10’
- Concentrazione KCl: 500 mM
- Concentrazione DNA stampo: 160 ng/100 l
- Concentrazione primers : 1M
- Concentrazione dNTP : 1250M
- Concentrazione Tris-HCl: 100 mM
- Concentrazione Taq polimerasi: 1U
- Gelatina 0.1%
- pH 9
- Volume di reazione: 50 l
D16S397: è un repeat dinucleotidico. L’associazione con SCA4 è espressa da un LOD score=
5.93 e  =0.00.
I primers utilizzati per l’amlificazione sono:
295
296
5’ – TCTGGAGACCACTAACTGTA – 3’
5’ – ACTCTCCATGAGTCCTGATG – 3’
la lunghezza minima dell’amplificato è 104bp mentre la masima è 112bp
Protocollo:
- 50 ng DNA stampo
- 10 p moli primer forward
- 10 p moli primer reverse
- 3 p moli di ciascun dNTP
- 10 mM Tris-HCl (pH 8.4)
- 40 mM KCl
- 1.5 mM MgCl2
- 0.5 U Taq polimerasi
- Volume di reazione 25l
- 1 ciclo a 94C per 4’
- 25 cicli : 94C per 1’, 55C per 1’, 72C per 1‘
- 1 ciclo 72C per 7’
D16S514: è un repeat dinucleotidico.
I primers utilizzati per l’amplificazione sono:
-
AFM330vd9d
AFM330vd9m
5’ - CTATCCACTCACTTTCCAGG – 3’
5’ - TCCCACTGATCATCTTCTC – 3’
La lunghezza minima dell’amplificato è 122bp
Le condizioni di amplificazione sono:
[Mg2+]: 15 mM
Temperatura di annealing : 55°C
Concentrazione primer : 1 M
Protocollo:
- Temperatura iniziale di denaturazione: 96°C
- Tempo iniziale di denaturazione: 5’
- Temperatura finale di estensione: 72°C
- Tempo finale di estensione: 10’
- Concentrazione KCl: 500 mM
- Concentrazione DNA stampo: 80 ng/100 l
- Concentrazione primers: 1M
- Concentrazione Tris-HCl: 100 mM
- Concentrazione Taq polimerasi: 1 U
- Gelatina: 0.1%
- pH 9
- Volume di reazione: 50 l
Gli amplificati possono essere separati in gel di acrilammide 7%/5.6M urea, 32% formammide,
90 mM Trius-borato (pH7.5), 2 mM EDTA. La “prerun” dei gel va effettuata a 80W per 60’,
dopo il caricamento dei campioni la corsa deve essere fatta in un buffer di corsa 90 mM Trisborato (pH 7.5) e 2 mM EDTA ad 80W; l’individuazione delle bande viene effettuata per Silver
staining.
Diagnosi di SCA5
SCA5 risulta associata a 3 marcatori presenti sul cromosoma 11: D11S871, D11S1385
(GATA2A01) e D11S913.
D11S871: è un repeat dinucleotidico; l’associazione di questo microsatellite con SCA5 è
espressa da LOD score= 5.05 e = 0.12.
I primers utilizzati per l’amplificazione sono:
- 507
- 508
5’ – GGCAGGAGAATGGCTTGAA – 3’
5’ – GATGGACTTCACATCCATAA – 3’
La lunghezza minima dell’amplificato è 186bp, quella massima 194bp
D11S1385: è un repeat tetranucleotidico (ATCT); l’associazione di questo microsatellite con
SCA5 è espressa da LOD score= 10.3 e = 0.064
I primers utilizzati per l’amplificazione sono:
- CHLC.GATA2A01.P6500.forward
- CHLC.GATA2A01.P6500.riverse
5’ – CCGAGGCTATTGCTGTTTTA – 3’
5’ – AACCTACTGTGCTGCCAGTC – 3’
La lunghezza minima dell’amplificato è 211bp.
D11S913: è un repeat dinucleotidico; l’associazione di questo microsatellite con SCA5 è
espressa da LOD score= 12.27 e = 0.03.
I primers utilizzati per l’amplificazione sono:
- AFM164zf12d
- AFM164zf12m
5’ – CATTTGGGAAATCCAGAAGA – 3’
5’ – TAGGTGTCTTATTTTTTGTTGCTTC – 3’
La lunghezza minima dell’amplificato è 220bp.
Le condizioni di amplificazione dei tre microsatelliti sono:
[Mg2+]: 15 mM
Temperatura di annealing: 55°C
Concentrazione primers: 1M
Protocollo:
- Temperatura iniziale di denaturazione: 96°C
- Tempo iniziale di denaturazione: 5’
- Temperatura finale di estensione: 72°C
- Tempo finale di estensione: 10’
- Concentrazione KCl: 500 mM
- Concentrazione DNA stampo: 160 ng/100 l
- Concentrazione primers: 1M
- Concentrazione di dNTP: 1250 M
- Concentrazione Tris-HCl: 100 mM
- Concentrazione Taq polimerasi: 1 U
- Gelatina: 0.1%
- pH 9
- Volume di reazione: 50 l
Gli amplificati vengono analizzati su gel di acrilammide 4-6.5%/8M urea e poi colorati con
Silver staining
Diagnosi di SCA10
SCA10 risulta associata a 3 marcatori presenti sul cromosoma 22: D22S1177, D22S1161 e
D22S928.
D22S1177: è un repeat dinucleotidico presente in 6 forme all’eliche nella popolazione
caucasica; le forme più rappresentate sono la 1 con una frequenza del 41% e la 2 e la 4 con
16%.
I primers utilizzati per l’amplificazione sono:
- AFMa046zd5d
- AFMa046zd5m
5’ – GCCACTCTGGCACCAT – 3’
5’ – AGCTGTNAGCAAGCAGG – 3’
la lunghezza minima dell’amplificato è 182bp.
D22S1161: è un repeat dinucleotidico (CA) presente in 6 forme all’eliche nella popolazione
caucasica; le forme all’eliche più rappresentate sono la 3, la 2 e la 5 con una frequenza,
rispettivamente, del 46,28 e 13%. L’associazione di questo marcatore con SCA10 è data da un
LOD score = 4.3 e = 0.
I primers utilizzati per l’amplificazione sono:
-
AFMb043zd9a
AFMb043zd9m
5’ – ACGGAGCATCTGTCCC – 3’
5’ – AGCCACGAGTTTGTGGT – 3’
D22S928: è un repeat dinucleotidico presente in 9 forme all’eliche nella popolazione caucasica;
le diverse forme sono più o meno egualmente rappresentate esibendo frequenze molto simili
(15-18%). L’associazione di questo marcatore con SCA10 è data da un LOD score = 4.30 e  =
0.
I primers utilizzati per l’amplificazione sono:
-
AFMd048wdSd
AFMd048wdSm
5’ – TGCAAAGTGCTGGAGG – 3’
5’ – TGAAGATGGCTAGTACGGG – 3’
La lunghezza minima dell’amplificato è 178bp
Le condizioni di amplificazione dei tre microsatelliti sono:
[Mg2+]: 1.5 mM
Temperatura di annealing: 55°C
Concentrazione primers: 1M
Protocollo:
- Temperatura iniziale di denaturazione: 96°C
- Tempo iniziale di denaturazione: 5’
- Temperatura finale di estensione: 72°C
- Tempo finale di estensione: 10’
- Concentrazione KCl: 500 mM
- Concentrazione DNA stampo: 160 ng/100 l
- Concentrazione primers: 1M
- Concentrazione di dNTP: 125 M
- Concentrazione Tris-HCl: 10 mM
- Concentrazione Taq polimerasi: 1 U
- Gelatina: 0.1%
-
pH 9
Volume di reazione: 50 l
Gli amplificati possono essere separati su gel di acrilammide 6%/8M urea ed evidenziati dopo
colorazione per Silver staining.
Diagnosi di SCA11
SCA10 risulta associata a 3 marcatori microsatellitari presenti sul cromosoma 15: D15S146,
D15S1016 e D15S1039.
D15S146: è un repeat dinucleotidico (CA).
I primers utilizzati per l’amplificazione sono
-
AFM070xd7d
AFM070xd7m
5’ – GGAAGCCTGACTTTATATCCG – 3’
5’ – ATGTCTGTTCAGATCCTTTGC – 3’
La lunghezza minima dell’amplificato è 217bp.
D15S1016: è un repeat dinucleotidico (CA) presente nella popolazione caucasica in 13 forme
all’eliche; le forme più rappresentate sono la 6 (255bp) con una frequenza del 26% e la 8
(259bp) con una frequenza dell’11%.
I primers utilizzati per l’amplificazione sono:
-
AFMb324yh9d
AFMb324yh9m
5’ – GATCCGTCACATAATGGC –3’
5’ – ACACCTCAGCTTTCCTGG – 3’
La lunghezza minima dell’amplificato è 239bp, quella massima 267bp.
D15S1039: è un repeat dinucleotidico (CA).
I primers utilizzati per l’amplificazione sono:
-
AFM359tf9d
AFM359tf9m
5’ – TGCCGGTAGTAACATCTG – 3’
5’ – CCAAGGATAAAGTATTTGTGTC – 3’
La lunghezza minima dell’amplificato è 257bp.
Le condizioni di amplificazione dei tre microsatelliti sono:
[Mg2+]: 1.5 mM
Temperatura di annealing: 55°C
Concentrazione primers: 1M
Protocollo:
- Temperatura iniziale di denaturazione: 96°C
- Tempo iniziale di denaturazione: 5’
- Temperatura finale di estensione: 72°C
- Tempo finale di estensione: 10’
- Concentrazione KCl: 50 mM
-
Concentrazione DNA stampo: 160 ng/100 l
Concentrazione primers: 1M
Concentrazione di dNTP: 125 M
Concentrazione Tris-HCl: 10 mM
Concentrazione Taq polimerasi: 1 U
Gelatina: 0.1%
pH 9
Volume di reazione: 50 l
Gli amplificati possono essere separati su gel di acrilammide 6%/8M urea ed evidenziati dopo
colorazione per Silver staining.
Diagnosi di SCA8
Essendo SCA8 una forma patologica molto rara, i mezzi per diagnosticarla non verranno inclusi
in alcun kit SCA nazione-specifico. Qualora ce ne fosse la necessità, è comunque possibile
richiedere la diagnosi alla ditta che produce il kit che ha messo a disposizione un servizio di
“service” per la diagnosi molecolare di SCA meno frequenti. La diagnosi di SCA8 si effettua
per PCR diretta essendone stato individuato il gene sul cromosoma 13q21. la lunghezza dei
repeats dinucleotidici segue una distribuzione tetramodale:
 15-21 repeats (19%)
 22-37 repeats (80%) il più comune è 24 CTG
 40-91 repeats (0.7%)
 100-155 repeats: patologico
I primers utilizzati per l’amplificazione sono:
-
pSCA8 forward
pSCA8 reverse
3’
5’ – CCCCAATGACCAGGGAGAATGAAGA – 3’
5’ – AGTAAGAGATAATCAGTATGAGGAAGTATGGAAAAA –
Protocollo:
- Temperatura di annealing: 63°C
- 10x pfx amplification buffer  1x: 5l
- 10x PCR enhancer solution  1x : 5l
- 50 mM MgSO4  1 mM : 1l
- primer forward 10nM  0.3 nM: 1.5l
- primer reverse 10 nM  0.3 nM: 1.5l
- 10 mM dNTPs  0.3 mM (ciascuno): 1.5l
- platinum pfx DNA polimerasi 2.5 U/l: 0.4-1l
- DNA stampo 200 ng
- H2O distillata sterile fino a volume 50l
- Condizioni di amplificazione (vd kit)
Gli amplificati vengono analizzati su gel di agarosio 2%
 Gli alleli alti 583-748bp  patologici
 Gli alleli fino a 556bp con una maggiore frequenza a 365bp  normali
Appendice A- Sequenze dei primer SCA specifici
SCA 1
Left primer:
Right primer:
5’ - ACTCTGCTGGCCAACATGGGCAGTCT – 3’
5’ – TGGGACGTACTGGTTCTGCTGGGCTGGT – 3’
SCA 2
Left primer:
Right primer:
5’ – GTGTATGGGCCCCTCACCATGTGC – 3’
5’ – CCGCCGGGCTTGCGGACATT – 3’
SCA 3
Left primer:
Right primer:
5’ – TGTTTCAGACAGCAGCAAAAGCAGCAA – 3’
5’ – CTGGTGGCTGGCCTTTCACATGGAT – 3’
SCA 6
Left primer:
Right primer:
5’ – CCCCCGGCCACACGTGTCCTAT – 3’
5’ – TACCTCCGAGGGCCGCTGGT – 3’
SCA 7
Left primer:
Right primer:
5’ – GGAGCGGGCCGCGGATGAC – 3’
5’ – GCGGTGGCGGGTGCTGCTG – 3’
Bibliografia:
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http://www3.ncbi.nlm.nih.gov:80/htbin-post/Omim/
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603680(sca8)
604326(sca12)
604432(sca11)
143100(corea di Huntington)
Autori:
Bonetti Alessandro
Campana Vincenza
Catalanotti Federica
D’Agostino Diego
Gianni Davide
Puggioni Dania
328/63
328/28
328/30
328/18
328/19
328/62