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Attività di ricerca
La tecnica che permette di individuare e caratterizzare meglio i vari ceppi di Ctv è il saggio biologico.
Tale tecnica richiede una grande esperienza da parte dell’operatore, sia riguardo alla coltivazione che al
mantenimento delle piante saggiate col virus, e soprattutto da non sottovalutare sono i tempi di valutazione della
tecnica che risultano essere estremamente lunghi e costosi.
Per cercare di ovviare a questi problemi nel corso degli anni, sono state messe a punto diverse tecniche che però
non sono riuscite mai a raggiungere l’efficienza data dal saggio biologico.
La tecnica più comunemente usata per differenziare i ceppi di Closterovirus è l’ SSCP (Single Strand
Conformation Polymorphism).
La tecnica si basa sull’alterazione della conformazione del DNA a singola elica, determinata da una sostituzione
nucleotidica che causa una diversa velocità di migrazione, sul gel di poliacrilammide, del frammento di DNA in
cui è avvenuta la mutazione.
Il DNA a doppia elica è denaturato con calore e formammide e raffreddato rapidamente per evitare la
rinaturazione.
Il DNA a singola elica assume conformazioni diverse: la migrazione su gel di poliacrilammide non denaturante
sarà determinata dalla conformazione piuttosto che dalle dimensioni.
Il pattern di conformazioni è sequenza-dipendente: anche una singola sostituzione nucleotidica altera la
conformazione.
La tecnica su citata presenta il vantaggio di essere un buon metodo identificativo di varianza genica (mutazioni,
delezioni ecc.). Gli svantaggi associati alla tecnica sono:
 amplificazione di frammenti corti (150-300 bp)
• denaturazione completa
• composizione della matrice del gel
• composizione del tampone
• lunghezza del gel, durata elettroforesi e temperatura
• concentrazione del DNA
• impossibile predire la mobilità elettroforetica del SS (singolo filamento)
Per colmare questi gap si è pensato di utilizzare tecnica su esposta, sfruttando l’utilizzo dell’analizzatore genetico
Genetic Analyzer ABI 3130 dell’ Applyed Biosystems.
I vantaggi forniti da tale tecnica rispetto alla precedente sono:
 amplificazione anche di frammenti superiori a 300 bp)
•
possibilità di usare temperature diverse, aumentando enormemente la sensibilità
•
controllo preciso della temperatura
•
grande riproducibilità
•
possibilità di usare un controllo interno
•
normalizzazione della mobilità: identificazione anche di mutazioni che causano una piccola alterazione
della mobilità;
•
La presenza di un rivelatore che riconosce le fluorescenze emesse dai fluorocromi colpiti dal raggio laser
e rileva la diversa mobilità di ogni filamento marcato.
Questa tecnica che viene indicata con l’acronimo CE-SSCP non è mai stata utilizzata per la caratterizzazione di
virus in pianta.
Stabilire una correlazione tra i picchi dati dalla diversa mobilità elettroforetica dei geni presi in esame e la
sintomatologia espressa dalle piante esposte a tali ceppi di virus è l’obiettivo che porterà ad avere rapide risposte
sull’evolversi della malattia in pieno campo, dando così risposte certe agli agricoltori che si domandano
costantemente se risulta economicamente più vantaggioso per loro, avendo le piante infette, continuare a
coltivare tali piante anche se si ottiene una produzione più bassa (ceppo di ctv che causa una sintomatologia
blanda) o estirpare l’intera piantagione e innestare piante più resistenti a ctv .