Tecniche base di genetica molecolare Informazioni più dettagliate su http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/publicat/primer/toc.html Elettroforesi L’elettroforesi è il metodo più conveniente per seperare molecole che differiscono per carica elettrica o per dimensioni. Vengono utilizzati vari metodi di elettroforesi, ma tutti si basano sulla separazione di molecole in soluzione mediante un campo elettrico. In base alla carica, le molecole vengono attratte verso uno dei due elettrodi. Le molecole vengono fatte migrare attraverso una matrice la quale, opponendosi al passaggio delle molecole, gioca un ruolo attivo nel separare le molecole in base alla loro dimensione. Le matrici più comunemente usate nell’elettroforesi sono agarosio o poliacrilamide. Per ragioni tecniche, anche se esistono apparati di varie forme sia commerciali che “fatti in casa”, i gel di acrilamide sono normalmente verticali, con i pozzetti nei quali vengono caricati i campioni in alto, mentre i gel di agaropsio vengono generalmente preparati orizzontali, con i pozzetti sulla superficie. matrice Misura delle molecole da separare Agarosio 0.5 - 20 kb 10 - 1000 bp (DNA), 0 - 100 kd (proteine) Gel di agarosio Gel grande: 200-250 ml di TBE 1X Gel piccolo: 50 ml di TBE 1X Pesare l’agarosio (conc. 1% per DNA, 2-3% per le PCR) Es.: Per gel grande da 200 ml, 2 g per DNA e 4 o più grammi per PCR Sciogliere nel microonde fermando prima che bolla unire il bromuro di etidio a conc. Finale di 1ug/ml SOTTO CAPPA senza contaminare o contaminarti- è un mutageno, (mettere 15 ul dello stock sotto cappa) far raffreddare un po’ (quando la beuta riesci a tenerla in mano va bene) colare nel tray con i pettini già inseriti Polymerase Chain Reaction (PCR) L PCR (reazione di polimerizzazione a catena) è un’invenzione che ha rivoluzionato la genetica molecolare, consentendo di produrre grandi quantità di DNA partendo da una singola molecola. È un’applicazione utilizzata in una varietà di campio, quali la scienza forense, l’archeologia, la medicina. Il metodo, inventato da Mullis nel 1993, si basa sulla moltiplicazione artificiale di DNA mediata da un enzima chiamati DNA polimerasi. La DNA polimerasi esiste negli organismi in natura, dove ha la funzione di duplicare il DNA nella divisione cellulare. Lavora attaccandosi ad un singolo filamento di DNA e creandone il filamento complementare. In pratica, la PCR viene utilizzata per amplificare una parte corta e definita di DNA, quale ad esempio una parte di un gene. I componenti della reazione sono DNA stampo, contenente la regione da amplificare 2 primers, che determinano l’inizio e la fine della regione da amplificare DNA polimerasi, che catalizza la reazione Nucleotidi, con i quali la polimerasi crea il nuovo DNA Buffer, che crea l’amiente chimico adatto al funzionamento della polimerasi La reazione viene condotta in un termociclatore, una macchina che in tempi brevi riscalda e raffredda i campioni portandoli all’esatta temperatura richiesta per ogni passaggio. L’intero processo di solito è costituito da circa 30 cicli. Ciascun ciclo è costituito di 3 fasi: 1. denaturazione del DNA per separare i filamenti (94-96°C) 2. annealing, ovvero attaccamento dei primers alle sequenze di DNA complementari ad essi. La temperatura dipende dalla sequenza dei primers stessi. 3. elongazione, fase in cui la polimerasi mette in fila i nucleotidi creando il filamento complementare allo stampo. (generalmente 72°C). Sequenziamento Il metodo Ranger di sequenziamento, o “dideoxy chain termination method”, è il seguente: 1. bisogna ottenere, mediante clonaggio o PCR, il DNA da sequenziale in forma pura 2. I filamenti di DNA devono essere separati (ad esempio clonandoli in un vettore) 3. Un primer si fa attaccare ad una nota sequenza ad una estremità del frammento da sequenziale. 4. Deossinucleotidi trifosfato (dATP, dCTP, dTTP e dGtp) e DNA polimerasi vengono uniti perconsentire la creazione dlla sequenza a partire dal primer 5. nella mistura di reazione vengono anche inseriti dei dideossi nucleotidi marcati con colori fluorescenti. Quando questi vengono inseriti nella sequenza bloccano l’elongazione, mancando del gruppo –OH terminale 6. i prodotti della sintesi vengono separati in base alle dimensioni su un gel di poliacrilamide. Poiché i prodotti passano in un determinato punto del gel uno alla volta, le marcature fluorescenti possono essere lette da uno scanner ed inviate ad un computer.