Tecniche base di genetica molecolare

Tecniche base di genetica molecolare
Informazioni più dettagliate su
http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/publicat/primer/toc.html
Elettroforesi
L’elettroforesi è il metodo più conveniente per seperare molecole che differiscono per
carica elettrica o per dimensioni. Vengono utilizzati vari metodi di elettroforesi, ma tutti si
basano sulla separazione di molecole in soluzione mediante un campo elettrico.
In base alla carica, le molecole vengono attratte verso uno dei due elettrodi. Le molecole
vengono fatte migrare attraverso una matrice la quale, opponendosi al passaggio delle
molecole, gioca un ruolo attivo nel separare le molecole in base alla loro dimensione. Le
matrici più comunemente usate nell’elettroforesi sono agarosio o poliacrilamide. Per
ragioni tecniche, anche se esistono apparati di varie forme sia commerciali che “fatti in
casa”, i gel di acrilamide sono normalmente verticali, con i pozzetti nei quali vengono
caricati i campioni in alto, mentre i gel di agaropsio vengono generalmente preparati
orizzontali, con i pozzetti sulla superficie.
matrice
Misura delle molecole da
separare
Agarosio 0.5 - 20 kb
10 - 1000 bp (DNA),
0 - 100 kd (proteine)
Gel di agarosio
Gel grande: 200-250 ml di TBE 1X
Gel piccolo: 50 ml di TBE 1X
Pesare l’agarosio (conc. 1% per DNA, 2-3% per le PCR)
Es.: Per gel grande da 200 ml, 2 g per DNA e 4 o più grammi per PCR
Sciogliere nel microonde fermando prima che bolla
unire il bromuro di etidio a conc. Finale di 1ug/ml SOTTO CAPPA senza contaminare o
contaminarti- è un mutageno, (mettere 15 ul dello stock sotto cappa)
far raffreddare un po’ (quando la beuta riesci a tenerla in mano va bene)
colare nel tray con i pettini già inseriti
Polymerase Chain Reaction (PCR)
L PCR (reazione di polimerizzazione a catena) è un’invenzione che ha rivoluzionato la
genetica molecolare, consentendo di produrre grandi quantità di DNA partendo da una
singola molecola. È un’applicazione utilizzata in una varietà di campio, quali la scienza
forense, l’archeologia, la medicina.
Il metodo, inventato da Mullis nel 1993, si basa sulla moltiplicazione artificiale di DNA
mediata da un enzima chiamati DNA polimerasi.
La DNA polimerasi esiste negli organismi in natura, dove ha la funzione di duplicare il DNA
nella divisione cellulare. Lavora attaccandosi ad un singolo filamento di DNA e creandone
il filamento complementare.
In pratica, la PCR viene utilizzata per amplificare una parte corta e definita di DNA, quale
ad esempio una parte di un gene.
I componenti della reazione sono
 DNA stampo, contenente la regione da amplificare
 2 primers, che determinano l’inizio e la fine della regione da amplificare
 DNA polimerasi, che catalizza la reazione
 Nucleotidi, con i quali la polimerasi crea il nuovo DNA
 Buffer, che crea l’amiente chimico adatto al funzionamento della polimerasi
La reazione viene condotta in un termociclatore, una macchina che in tempi brevi riscalda
e raffredda i campioni portandoli all’esatta temperatura richiesta per ogni passaggio.
L’intero processo di solito è costituito da circa 30 cicli. Ciascun ciclo è costituito di 3 fasi:
1. denaturazione del DNA per separare i filamenti (94-96°C)
2. annealing, ovvero attaccamento dei primers alle sequenze di DNA complementari
ad essi. La temperatura dipende dalla sequenza dei primers stessi.
3. elongazione, fase in cui la polimerasi mette in fila i nucleotidi creando il filamento
complementare allo stampo. (generalmente 72°C).
Sequenziamento
Il metodo Ranger di sequenziamento, o “dideoxy chain termination method”, è il seguente:
1. bisogna ottenere, mediante clonaggio o PCR, il DNA da sequenziale in forma pura
2. I filamenti di DNA devono essere separati (ad esempio clonandoli in un vettore)
3. Un primer si fa attaccare ad una nota sequenza ad una estremità del frammento da
sequenziale.
4. Deossinucleotidi trifosfato (dATP, dCTP, dTTP e dGtp) e DNA polimerasi vengono
uniti perconsentire la creazione dlla sequenza a partire dal primer
5. nella mistura di reazione vengono anche inseriti dei dideossi nucleotidi marcati con
colori fluorescenti. Quando questi vengono inseriti nella sequenza bloccano
l’elongazione, mancando del gruppo –OH terminale
6. i prodotti della sintesi vengono separati in base alle dimensioni su un gel di
poliacrilamide. Poiché i prodotti passano in un determinato punto del gel uno alla
volta, le marcature fluorescenti possono essere lette da uno scanner ed inviate ad
un computer.