L’endocitosi dell’EGFR
IFOM per la scuola
Lo Studente Ricercatore 2011
Muzio Giulia
Istituto d’Istruzione Superiore Maserati Voghera
Gruppo di lavoro: Determinanti della
trasformazione neoplastica e della progressione
tumorale
Nome tutor: Giusi Caldieri
Ad ogni recettore il suo ligando:
EGFR con l’EGF
L’EGFR (Epidermal Growth
Factor Receptor) è un
recettore di membrana
coinvolto in vari processi
biologici, tra cui
migrazione, adesione e
proliferazione delle cellule.
L’EGFR viene attivato
grazie al suo ligando
specifico, ovvero l’EGF.
Cosa succede dopo l’attivazione?
A seguito del legame con EGF, il recettore:
• va incontro a una variazione conformazionale
• dimerizza, ovvero si lega a un altro complesso
EGFR-EGF
• si autofosforila
• viene internalizzato nella cellula
Il processo tramite cui la cellula internalizza molecole
o corpuscoli presenti nello spazio extracellulare è
chiamato endocitosi.
Il ruolo della membrana nell’endocitosi
Modificato da: Human Physiology (IPHY 3404)
University of Colorado at Boulder
Per permettere
l’internalizzazione delle
molecole, la membrana
plasmatica si curva per
racchiudere in una
vescicola le molecole
da internalizzare.
Questa vescicola viene
convogliata nel
citoplasma tramite i
microtubuli.
L’EGFR è internalizzato sempre nello
stesso modo?
L’EGFR può essere internalizzato attraverso due vie:
CME
Clathrin-Mediated
Endocytosis
È la via sinora meglio
caratterizzata, in cui la
clatrina, proteina di
rivestimento della
membrana, media
l’endocitosi.
NCE
Non-Clathrin
Endocytosis
Non è conosciuta a
livello molecolare. Si sa
però che la clatrina non
gioca un ruolo
determinante.
L’importanza della concentrazione dell’EGF
• La CME si attiva già a basse dosi di EGF (1 mg/ml).
• La NCE si attiva solo con alte dosi di EGF (100 mg/ml).
Modificata da: Sigismund et al., Cell 2008
Cosa comporta seguire CME o NCE?
CME
NCE
Recycling
Ritorno del recettore
alla membrana
plasmatica
Signalling
Tramissione di segnali
che influenzano la
cellula
Degradation
Degradazione del
recettore
CME e NCE
Vitali per la cellula, ma attenzione
• Il signalling attivato durante la CME è un segnale di
sopravvivenza per le cellule. Un’eccessiva
stimolazione, però, può provocare il cancro. Alcuni
tumori, infatti, sono caratterizzati da un’aumentata
attività dell’EGFR nel tessuto tumorale.
• La NCE, invece, diminuisce la quantità di EGFR
promuovendone la degradazione. Quindi può avere
una funzione protettiva.
Importanza dello studio sulla NCE
Controllare l’attività dell’EGFR promuovendone la
degradazione a seguito dell’internalizzazione tramite
NCE potrebbe essere un approccio molecolare
valido nella terapia contro il cancro.
A tal fine bisogna:
• trovare le proteine coinvolte nella NCE
• verificare che le proteine in esame svolgano un
ruolo nell’endocitosi dell’EGFR
• verificare quindi che siano presenti nelle vescicole
internalizzate durante l’endocitosi
Alcune delle proteine coinvolte in NCE:
i reticulon
Tramite esperimenti di screening, tra le proteine convolte
in NCE sono stati identificati i reticulon.
I reticulon sono proteine normalmente associate al
reticolo endoplasmatico che, grazie alla loro forma, sono
in grado di curvare la membrana.
Tratto da: Bauer and Pelkmans, FEBS Letters 2006
Nelle cellule Hela (cellule
tumorali umane
immortalizzate) sono
espresse 4 isoforme di
reticulon (proteine differenti
codificate dallo stesso
gene): A, B, C, D.
Come verificare la presenza dei reticulon
nelle vescicole?
I reticulon possono essere localizzati tramite esperimenti
di immunofluorescenza, ovvero una tecnica che
permette di visualizzare una specifica proteina tramite
l’associazione di un anticorpo specifico coniugato con un
colorante fluorescente.
Modificata da: LaCellula.net
Di cosa ho bisogno per fare
l’immunofluorescenza?
Per fare l’immunofluorescenza servono quindi due
anticorpi:
• un anticorpo primario che riconosca i reticulon
• un anticorpo secondario coniugato ad una
molecola fluorescente che riconosca il primario
Ogni anticorpo prima di poter essere utilizzato negli
esperimenti deve essere validato. Recentemente dal
laboratorio giapponese Tagaya è stato mandato un
anticorpo anti-reticulon. Per vedere se riconosce
effettivamente i reticulon bisogna validarlo.
Come validare l’anticorpo anti-reticulon?
Bisogna fare
l’immunofluorescenza in due
campioni:
• cellule di controllo
• cellule in cui l’espressione
dei reticulon è stata inibita
con la tecnica dell’RNA
interference (RNAi).
La RNAi è una tecnica usata
per silenziare un particolare
mRNA, inducendone la
degradazione. In questo
modo, la proteina non può
essere tradotta.
Validazione di un anticorpo:
cosa mi aspetto dall’immunofluorescenza?
L’anticorpo risulta specifico, quindi valido, se:
• l’immunofluorescenza su cellule di controllo, ovvero
su cui non sono stati effettuati trattamenti, dà un
segnale
• l’immunofluorescenza su cellule trattate con RNAi
per i reticulon dà un segnale molto debole o assente.
L’RNAi infatti silenzia i reticulon e, se l’anticorpo è
specifico, il segnale deve essere molto lieve.
I risultati dell’immunofluorescenza:
coincidenti con le aspettative
Nelle figure vi sono i risultati dell’immunofluorescenza
con l’anticorpo anti-reticulon in cellule di controllo e in
cellule trattate con RNAi per i reticulon: nelle prime il
segnale è chiaramente più forte che nelle seconde.
Cellule di
controllo
Cellule trattate
con siRNA
L’anticorpo inviato dal Giappone è valido?
Gli esperimenti effettuati dicono di SÌ
Basandoci sui risultati ottenuti possiamo affermare
che l’anticorpo anti-reticulon mandato dal
laboratorio giapponese Tagaya è specifico per il
riconoscimento dei reticulon:
• potrà essere utilizzato in futuro per esperimenti di
colocalizzazione tra reticulon ed EGFR
• potrà quindi essere utile a caratterizzare la NCE
