Biol. Mar. Mediterr. (2008), 15 (1): 412-413
M. Celi, M. Vazzana, M.L. Di Bella, V. Arizza, N. Parrinello
Laboratorio di Immunobiologia Marina, Dipartimento di Biologia Animale, Università di Palermo,
Via Archirafi, 18 - 90123 Palermo, Italia.
[email protected]
EFFETTI DEL CADMIO SULL’ESPRESSIONE DELLE HSP70
NELLE CELLULE DEL SANGUE DI SPIGOLA
(DICENTRARCHUS LABRAX L., OSTEICHTHYES, MORONIDAE)
EFFECTS OF CADMIUM ON EXPRESSION OF THE HSP70
IN SEA BASS (DICENTRARCHUS LABRAX L.,
OSTEICHTHYES, MORONIDAE) BLOOD CELLS
Abstract - Blood cells freshly collected from sea bass (Dicentrarchus labrax) were exposed in vitro to
different concentrations of cadmium 10-7M, 10-5M, 10-3M. Hsp70 stress proteins were significantly overexpressed after exposure to metal. Our results show that fish blood cells may constitute an interesting biological model for experimental and applied toxicology, especially in the case of environmental pollution.
Key-words: fish blood cells, stress proteins, Cadmium.
Introduzione - Le proteine da stress più ampiamente studiate sono le heat shock
proteins (hsps), tra cui le hsp70 sono utilizzate come indicatori molecolari (Ryan e
Hightower, 1996). In diverse specie di pesci sono stati condotti studi sull’andamento
delle proteine da stress in risposta a vari agenti stressanti; (Basu et al., 2002; Iwama et
al., 1998). La misurazione dei livelli di espressione delle hsp da parte delle cellule del
sangue risulta interessante nelle analisi tossicologiche. Nel presente studio le cellule del
sangue di spigola sono state esposte in vitro a differenti concentrazioni di CdCl2 ed è
stato dimostrato che l’espressione delle hsp70 è dose e tempo dipendente.
Materiali e metodi - I Campioni di sangue sono stati raccolti per puntura cardiaca
da spigole del peso di 200-250 g, provenienti dall’impianto intensivo “ECO Ittica” di
Marsala. Le cellule del sangue (20×106 ml-1) sono state trattate con concentrazioni
differenti di CdCl2 (10-7M, 10-5M, 10-3M) per 2 e 24 ore. Aumentando le ore fino a 72
è stata introdotta un’ulteriore concentrazione di CdCl2 (10-8M), che è quella presente
in natura. Dopo lisi delle cellule il contenuto proteico totale è stato determinato con il
metodo Bradford. I pattern proteici dei campioni sono stati ottenuti in elettroforesi su
gel di poliacrilammide in presenza di sodio dodecil solfato (SDS-PAGE) ed esaminati
in western blot utilizzando un antisiero monoclonale specifico per hsp70. L’analisi
densitometrica dei pesi molecolari è stata condotta con il software AlphaEaseFC in
triplicato.
Risultati – Dall’analisi densitometrica dell’hsp70 osservata in western blot si trovano variazioni significative tra il controllo e i campioni di sangue trattati con concentrazioni differenti di CdCl2 (10-7 M, 10-5 M, 10-3 M). La densità aumenta in maniera
dose dipendente sia alle 2 che alle 24 ore (Fig. 1 a,b). L’incremento è significativo
dopo 48 ore di trattamento con 10-7 M di CdCl2, diminuisce proporzionalmente a 10-5
e 10-3. Lo stesso andamento si può osservare alle 72 ore, ma alla concentrazione 10-3 M
la banda non è più visibile (Fig. 1 c,d). Tale decremento potrebbe essere attribuito
ad un rapido e diretto effetto negativo dei metalli nei meccanismi di sintesi proteica
(Fulladosa et al., 2006).
Conclusioni - Lo studio degli effetti di xenobiotici sulle cellule dell’immunità
innata, oltre a fornire informazioni sulle condizioni di resistenza immunitaria dei pesci,
Effetti del cadmio sull’espressione delle HSP70 nelle cellule del sangue di spigola
413
potrebbe portare alla messa a punto di metodi per la identificazione di bioindicatori a livello cellulare. Le proteine appartenenti alla famiglia delle heat shock proteins
sono presenti costitutivamente nelle cellule e possono essere indotte in presenza di un
agente stressante promuovendo un meccanismo omeostatico citoprotettivo. I risultati
mostrano che l’espressione delle hsp70 è dose e tempo dipendente in relazione al cloruro di cadmio e suggeriscono che la hsp 70 può essere utilizzata come biomarker per
monitorare il benessere dei pesci sottoposti a situazioni stressanti.
Fig. 1 - Analisi densitometrica del WB di hsp70 in cellule del sangue di D. labrax dopo 2 (a), 24 (b),
48 (c) e 72 (d) ore di trattamento con diverse concentrazioni di CdCl2. I valori sono la media
±SD di tre esperimenti separati. Significatività rispetto ai controlli: **P<0.01, ***P<0.001.
Densitometric analysis of hsp70 WB pattern in D. labrax blood cells after 2 (a), 24 (b), 48 (c) and
72 (d) of treatment with various CdCl2 concentrations. Values are the mean ±SD from three separate
experiments. Significantivity compared to controls: **P<0.01, ***P<0.001.
Bibliografia
BASU N., TODGHAM A.E., ACKERMAN P.A., BIBEAU M.R., NAKANO K., SCHULTE P.M.
AND IWAMA G.K. (2002) - Heat shock protein genes and their functional significance in fish,
Gene, 295: 173–183. Summary Plus.
CURIE S., TUFTS B.L. (1997). - Synthesis of stress protein 70 (Hsp70) in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) red blood cells. J. Exp. Biol., 200: 607-614.
FULLADOSA E., DEANE E., NG A.H.Y., WOO N.Y.S., MURAT J.C., VILLAESCUSA I. (2006) Stress proteins induced by exposure to sublethal levels of heavy metals in sea bream (Sparus
sarba) blood cells. Toxicol. in vitro, 20: 96-100.
IWAMA G.K., THOMAS P.T., FORSYTHE R.B., VIJAYAN M.M. (1998) - Heat shock protein
expression in fish. Rev. Fish Biol. Fish., 8: 35–56.
RYAN J.A., HIGHTOWER L.E. (1996) - Stress proteins as molecular biomarkers for environmental
toxicology. In: U. Feige, R.I. Morimoto, I. Yahara and B. Polla (eds), Stress Inducible Cellular
Responses. Switzerland: 411–424.
