Focolai di EncefaloRetinopatia Virale (VER)

FOCOLAI DI ENCEFALO-RETINOPATIA VIRALE (VER) IN IMPIANTI DI
MARICOLTURA IN CALABRIA
OUTBREAKS
OF
VIRAL
ENCEPHALO-RETINOPATHY
AQUACULTURE FARMS IN CALABRIA
IN
MARINE
Foti M., Bottari T., Marino F., De Leo F., Rinaldo D., Vitale F.1 Dipartimento di Sanità
Pubblica Veterinaria, Università degli Studi di Messina; 1IZS A. Mirri,Palermo
Parole chiave: Dicentrarchus labrax, Betanodavirus, Encefalo-Retinopatia Virale, Calabria
Key words: Dicentrarchus labrax, Betanodavirus, Viral Encephalo-Retinopathy, Calabria
SUMMARY – Fish nodavirus are the cause of the Viral Encephalopathy and Retinopathy
(VER) in a wide variety of marine fish species in aquaculture worldwide. During summer 2005,
in 3 marine farms located in calabrian coast, severe mortality outbreaks have been reported in
sea bass (Dicentrarchus labrax). In the diseased fishes abnormal swimming behaviours have
been observed. A total of 90 fish have been sampled for the anatomo- and histo-pathological
examination. Pooled samples of brains from 90 fish were examined for the presence of VERV
by inoculation on SSN-1 cell line at 25° C. CPE was registered after 3-5 days and nodavirus
was verified by IFAT and RT-PCR.
INTRODUZIONE – L’Encefalo-Retinopatia virale (VER) costituisce una patologia emergente
responsabile di gravi problemi sanitari affliggenti la maricoltura in diverse aree geografiche (1).
L’agente eziologico è un virus ad RNA privo di envelope, a simmetria icosaedrica con
dimensioni di 25-30 nm, appartenente alla famiglia Nodaviridae. La malattia è stata segnalata in
allevamenti di branzino (Dicentrarchus labrax), sogliola (Solea solea), ombrina, (Umbrina
cirrosa) e sarago pizzuto (Puntazzo puntazzo) in diversi Paesi del Mediterraneo e dal 1995
anche nei mari italiani (2,3). La VER è stata diagnosticata in tutte le fasi della produzione ed in
tutte le tipologie di allevamento. La sintomatologia include colorazione scura, letargia,
incapacità a mantenere la stazione e nuoto scoordinato. La mortalità può essere significativa con
perdite economiche rilevanti. La relativa diffusione geografica è talvolta difficile da valutare in
quanto alcuni impianti non gradiscono sottoporre il proprio materiale ad alcun tipo di controllo
sanitario nel timore di eventuali interventi repressivi.
Obiettivo del presente lavoro è quello di fornire i primi dati relativi alla presenza della VER in
impianti di ingrasso della Calabria, territorio per il quale a tutt’oggi risultano scarsi o assenti
dati inerenti la presenza e l’epidemiologia di malattie delle specie ittiche allevate.
MATERIALI E METODI – Nel corso dell’estate 2005 sono stati segnalati episodi di
mortalità, compresa tra il 15 ed il 40%, che hanno interessato giovanili di branzino
contemporaneamente in tre impianti del territorio calabrese (azienda 1 nello Ionio; aziende 2 e 3
nel Tirreno). I pesci provenivano da due avannotterie differenti. Le aziende 1 e 2 praticavano
l’ingrasso su giovanili del peso di 5-10 g, mentre i pesci provenienti dall’azienda 3 erano
soggetti di un anno di età e 80-100 g di peso.
30 esemplari per ogni impianto sono pervenuti al laboratorio e sono stati sottoposti ad esame
autoptico. L’intero contenuto della calotta cranica di tutti i soggetti è stato quindi prelevato
sterilmente. Metà di esso è stato sottoposto ad esame istologico e l’altra metà è stata destinata
all’esame virologico ed all’analisi molecolare.
Esame istopatologico: i campioni di SNC sono stati fissati in formalina al 10% e processati per
l’inclusione in paraffina. Sezioni di 5 μm di spessore sono state colorate con EmatossilinaEosina, Cresil-Violetto e Diff-quik.
Isolamento virale: i campioni sono stati sottoposti ad omogeneizzazione in pool di 5.
L’omogenato è stato inoculato in monostrati di cellule SSN-1 (4) coltivati in E-MEM
addizionato con il 10% di siero fetale bovino, L-glutammina (1%), antibiotici ed antimicotici
(1%) (SIGMA). I monostrati sono stati osservati ogni giorno al microscopio ottico per
l’individuazione dell’eventuale effetto citopatico. I monostrati che presentavano effetto
citopatico sono stati criolisati ed utilizzati per l’analisi molecolare.
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L’RNA virale è stato estratto mediante “High Pure RNA Isolation Kit” (Roche) secondo il
protocollo suggerito dalla casa produttrice. La presenza del nodavirus è stata dimostrata
mediante one step RT-PCR usando la coppia di primers VER1 (5’-GAC-TGG-GAC-ACGCTG-CTA-GA-3’) e VER2 (5’-AGT-CGA-ACA-CTC-CAG-CGA- CA-3’) specifici per una
regione altamente conservata del gene capsidico pari a 347pb in una GeneAmp PCR System
Perkin Elmer 2400. Il prodotto di amplificazione è stato visualizzato dopo corsa elettroforetica
su gel di agarosio al 2%.
Immunofluorescenza indiretta: per il test di Immunofluorescenza sono stati utilizzati monostrati
di SSN-1 sviluppati su vetrini coprioggetto in piastre di Petri. Ogni campione è stato inoculato
con estratto di SNC su tre vetrini al fine di valutare la presenza del virus a 48, 72, e 96 ore p.i.
con siero policlonale antinodavus e siero anti-coniglio coniugato con fluoresceina (Sigma).
Dagli esemplari sono stati infine prelevati campioni di rene, fegato e milza e sono stati condotti
in parallelo esami batteriologici di routine per la ricerca dei principali microrganismi patogeni
per i teleostei mediterranei.
RISULTATI – All’esame anatomo-patologico i soggetti esaminati non presentavano lesioni
macroscopiche ad eccezione di alcuni soggetti provenienti dall’azienda 3 mostranti lesioni
emorragiche cutanee e notevole splenomegalia. L’esame istologico del SNC evidenziava
spongiosi del tessuto cerebrale di tutti gli esemplari.
Tutti i campioni sottoposti ad esame virologico sono risultati positivi per nodavirus. I
monostrati hanno presentato la comparsa di un tipico effetto citopatico evidenziabile al
microscopio ottico a partire dalla terza-quinta giornata.
L’immunofluorescenza su monostrati infettati confermava l’identità del virus evidenziando
singole cellule fluorescenti distribuite nel monostrato.
L’analisi molecolare ha ulteriormente confermato la presenza di nodavirus in tutti i campioni.
CONCLUSIONI – Le osservazioni cliniche e i risultati delle indagini di laboratorio ci
consentono di affermare che gli episodi di mortalità osservati erano da ricondurre ad EncefaloRetinopatia virale. I risultati virologici sono infatti stati confermati dapprima con l’IFAT e
quindi con analisi molecolare mediante l’uso di primers specifici per una regione altamente
conservata del gene codificante la proteina capsidica. E’ da sottolineare che la percentuale di
mortalità è risultata maggiore nell’impianto 3 nel quale è stata dimostrata la contemporanea
presenza di Photobacterium damselae subsp. piscicida.
L’indagine epidemiologica da noi effettuata ci ha indotti ad escludere l’ipotesi della presenza
del virus nelle avannotterie in considerazione del tempo intercorso tra la semina e la prima
comparsa dei sintomi. Inoltre 400 giovanili provenienti dall’avannotteria fornitrice degli
impianti 1 e 2, prelevati immediatamente prima della semina in allevamento dallo stesso lotto in
cui si sono verificati gli episodi e stabulati presso il Centro di Ittiopatologia Sperimentale Sicilia
della nostra Facoltà in vasche sperimentali mantenute alle medesime condizioni degli impianti,
non hanno mostrato segni di VER nè positività agli esami di laboratorio. Ciò ci ha portato a
concludere che, con elevata probabilità, la contaminazione nei nostri focolai avesse un’origine
ambientale. Recenti studi hanno dimostrato infatti l’importanza dell’ambiente circostante gli
impianti ed in particolare il ruolo dei selvatici suscettibili alla malattia e dei carrier nel
condizionare l’insorgenza della VER anche nei nostri mari (3,5). La segnalazione di focolai di
malattia nelle specie ittiche d’allevamento è di fondamentale importanza per comprendere
l’effettiva circolazione del virus in aree differenti della penisola. Il nostro dato rappresenta la
prima dimostrazione di nodavirosi in Calabria e può contribuire a tracciare una mappa
epidemiologica più completa della distribuzione di tale patologia. A tal proposito sono in corso
indagini relative alla reale incidenza dell’infezione da VERV nelle specie ittiche selvatiche
dell’Italia Meridionale soprattutto in vicinanza di impianti di acquacoltura. Inoltre si stanno
effettuando studi filogenetici degli stipiti isolati che permetteranno una migliore comprensione
delle modalità di diffusione dei nodavirus.
BIBLIOGRAFIA –.1) Munday BL et al (2002), J Fish Dis, 25, 127-142. 2) Bovo G et al (1996),
Boll Soc It Patol Ittica, 19, 52-64. 3) Maltese C et al (2005), 12th Int Conf “Diseases of Fish and
Shellfish”, 113. 4) Frerichs GN et al (1996), J Gen Virol, 77, 2067-2071. 5) Castric J et al
(2001), Dis Aqua Org, 47, 33-38.
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