FOCOLAI DI ENCEFALO-RETINOPATIA VIRALE (VER) IN IMPIANTI DI MARICOLTURA IN CALABRIA OUTBREAKS OF VIRAL ENCEPHALO-RETINOPATHY AQUACULTURE FARMS IN CALABRIA IN MARINE Foti M., Bottari T., Marino F., De Leo F., Rinaldo D., Vitale F.1 Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria, Università degli Studi di Messina; 1IZS A. Mirri,Palermo Parole chiave: Dicentrarchus labrax, Betanodavirus, Encefalo-Retinopatia Virale, Calabria Key words: Dicentrarchus labrax, Betanodavirus, Viral Encephalo-Retinopathy, Calabria SUMMARY – Fish nodavirus are the cause of the Viral Encephalopathy and Retinopathy (VER) in a wide variety of marine fish species in aquaculture worldwide. During summer 2005, in 3 marine farms located in calabrian coast, severe mortality outbreaks have been reported in sea bass (Dicentrarchus labrax). In the diseased fishes abnormal swimming behaviours have been observed. A total of 90 fish have been sampled for the anatomo- and histo-pathological examination. Pooled samples of brains from 90 fish were examined for the presence of VERV by inoculation on SSN-1 cell line at 25° C. CPE was registered after 3-5 days and nodavirus was verified by IFAT and RT-PCR. INTRODUZIONE – L’Encefalo-Retinopatia virale (VER) costituisce una patologia emergente responsabile di gravi problemi sanitari affliggenti la maricoltura in diverse aree geografiche (1). L’agente eziologico è un virus ad RNA privo di envelope, a simmetria icosaedrica con dimensioni di 25-30 nm, appartenente alla famiglia Nodaviridae. La malattia è stata segnalata in allevamenti di branzino (Dicentrarchus labrax), sogliola (Solea solea), ombrina, (Umbrina cirrosa) e sarago pizzuto (Puntazzo puntazzo) in diversi Paesi del Mediterraneo e dal 1995 anche nei mari italiani (2,3). La VER è stata diagnosticata in tutte le fasi della produzione ed in tutte le tipologie di allevamento. La sintomatologia include colorazione scura, letargia, incapacità a mantenere la stazione e nuoto scoordinato. La mortalità può essere significativa con perdite economiche rilevanti. La relativa diffusione geografica è talvolta difficile da valutare in quanto alcuni impianti non gradiscono sottoporre il proprio materiale ad alcun tipo di controllo sanitario nel timore di eventuali interventi repressivi. Obiettivo del presente lavoro è quello di fornire i primi dati relativi alla presenza della VER in impianti di ingrasso della Calabria, territorio per il quale a tutt’oggi risultano scarsi o assenti dati inerenti la presenza e l’epidemiologia di malattie delle specie ittiche allevate. MATERIALI E METODI – Nel corso dell’estate 2005 sono stati segnalati episodi di mortalità, compresa tra il 15 ed il 40%, che hanno interessato giovanili di branzino contemporaneamente in tre impianti del territorio calabrese (azienda 1 nello Ionio; aziende 2 e 3 nel Tirreno). I pesci provenivano da due avannotterie differenti. Le aziende 1 e 2 praticavano l’ingrasso su giovanili del peso di 5-10 g, mentre i pesci provenienti dall’azienda 3 erano soggetti di un anno di età e 80-100 g di peso. 30 esemplari per ogni impianto sono pervenuti al laboratorio e sono stati sottoposti ad esame autoptico. L’intero contenuto della calotta cranica di tutti i soggetti è stato quindi prelevato sterilmente. Metà di esso è stato sottoposto ad esame istologico e l’altra metà è stata destinata all’esame virologico ed all’analisi molecolare. Esame istopatologico: i campioni di SNC sono stati fissati in formalina al 10% e processati per l’inclusione in paraffina. Sezioni di 5 μm di spessore sono state colorate con EmatossilinaEosina, Cresil-Violetto e Diff-quik. Isolamento virale: i campioni sono stati sottoposti ad omogeneizzazione in pool di 5. L’omogenato è stato inoculato in monostrati di cellule SSN-1 (4) coltivati in E-MEM addizionato con il 10% di siero fetale bovino, L-glutammina (1%), antibiotici ed antimicotici (1%) (SIGMA). I monostrati sono stati osservati ogni giorno al microscopio ottico per l’individuazione dell’eventuale effetto citopatico. I monostrati che presentavano effetto citopatico sono stati criolisati ed utilizzati per l’analisi molecolare. 191 L’RNA virale è stato estratto mediante “High Pure RNA Isolation Kit” (Roche) secondo il protocollo suggerito dalla casa produttrice. La presenza del nodavirus è stata dimostrata mediante one step RT-PCR usando la coppia di primers VER1 (5’-GAC-TGG-GAC-ACGCTG-CTA-GA-3’) e VER2 (5’-AGT-CGA-ACA-CTC-CAG-CGA- CA-3’) specifici per una regione altamente conservata del gene capsidico pari a 347pb in una GeneAmp PCR System Perkin Elmer 2400. Il prodotto di amplificazione è stato visualizzato dopo corsa elettroforetica su gel di agarosio al 2%. Immunofluorescenza indiretta: per il test di Immunofluorescenza sono stati utilizzati monostrati di SSN-1 sviluppati su vetrini coprioggetto in piastre di Petri. Ogni campione è stato inoculato con estratto di SNC su tre vetrini al fine di valutare la presenza del virus a 48, 72, e 96 ore p.i. con siero policlonale antinodavus e siero anti-coniglio coniugato con fluoresceina (Sigma). Dagli esemplari sono stati infine prelevati campioni di rene, fegato e milza e sono stati condotti in parallelo esami batteriologici di routine per la ricerca dei principali microrganismi patogeni per i teleostei mediterranei. RISULTATI – All’esame anatomo-patologico i soggetti esaminati non presentavano lesioni macroscopiche ad eccezione di alcuni soggetti provenienti dall’azienda 3 mostranti lesioni emorragiche cutanee e notevole splenomegalia. L’esame istologico del SNC evidenziava spongiosi del tessuto cerebrale di tutti gli esemplari. Tutti i campioni sottoposti ad esame virologico sono risultati positivi per nodavirus. I monostrati hanno presentato la comparsa di un tipico effetto citopatico evidenziabile al microscopio ottico a partire dalla terza-quinta giornata. L’immunofluorescenza su monostrati infettati confermava l’identità del virus evidenziando singole cellule fluorescenti distribuite nel monostrato. L’analisi molecolare ha ulteriormente confermato la presenza di nodavirus in tutti i campioni. CONCLUSIONI – Le osservazioni cliniche e i risultati delle indagini di laboratorio ci consentono di affermare che gli episodi di mortalità osservati erano da ricondurre ad EncefaloRetinopatia virale. I risultati virologici sono infatti stati confermati dapprima con l’IFAT e quindi con analisi molecolare mediante l’uso di primers specifici per una regione altamente conservata del gene codificante la proteina capsidica. E’ da sottolineare che la percentuale di mortalità è risultata maggiore nell’impianto 3 nel quale è stata dimostrata la contemporanea presenza di Photobacterium damselae subsp. piscicida. L’indagine epidemiologica da noi effettuata ci ha indotti ad escludere l’ipotesi della presenza del virus nelle avannotterie in considerazione del tempo intercorso tra la semina e la prima comparsa dei sintomi. Inoltre 400 giovanili provenienti dall’avannotteria fornitrice degli impianti 1 e 2, prelevati immediatamente prima della semina in allevamento dallo stesso lotto in cui si sono verificati gli episodi e stabulati presso il Centro di Ittiopatologia Sperimentale Sicilia della nostra Facoltà in vasche sperimentali mantenute alle medesime condizioni degli impianti, non hanno mostrato segni di VER nè positività agli esami di laboratorio. Ciò ci ha portato a concludere che, con elevata probabilità, la contaminazione nei nostri focolai avesse un’origine ambientale. Recenti studi hanno dimostrato infatti l’importanza dell’ambiente circostante gli impianti ed in particolare il ruolo dei selvatici suscettibili alla malattia e dei carrier nel condizionare l’insorgenza della VER anche nei nostri mari (3,5). La segnalazione di focolai di malattia nelle specie ittiche d’allevamento è di fondamentale importanza per comprendere l’effettiva circolazione del virus in aree differenti della penisola. Il nostro dato rappresenta la prima dimostrazione di nodavirosi in Calabria e può contribuire a tracciare una mappa epidemiologica più completa della distribuzione di tale patologia. A tal proposito sono in corso indagini relative alla reale incidenza dell’infezione da VERV nelle specie ittiche selvatiche dell’Italia Meridionale soprattutto in vicinanza di impianti di acquacoltura. Inoltre si stanno effettuando studi filogenetici degli stipiti isolati che permetteranno una migliore comprensione delle modalità di diffusione dei nodavirus. BIBLIOGRAFIA –.1) Munday BL et al (2002), J Fish Dis, 25, 127-142. 2) Bovo G et al (1996), Boll Soc It Patol Ittica, 19, 52-64. 3) Maltese C et al (2005), 12th Int Conf “Diseases of Fish and Shellfish”, 113. 4) Frerichs GN et al (1996), J Gen Virol, 77, 2067-2071. 5) Castric J et al (2001), Dis Aqua Org, 47, 33-38. 192