Recupero lezione

Recupero lezione
Mercoledì 20 aprile 2005
Ore 10.30- Aula 207
I just can't go with the flow anymore.
I've been thinking about joining a biofilm.
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Biologia dei biofilm
...
J. Bacte riol. 25, 277-286 (19 33)
aus C. E . Zo bell: "The effe ct o f sur faces on bacterial activity", J. Bacterio l. 46, 39 -56 (1943)
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BIOFILM
Comunita‘ ben strutturata
di batteri e cellule eucariotiche
racchiuse in una matrice polimerica
prodotta dalle cellule stesse, e che cresce su
superfici (inerti o „biologiche“), soprattutto
all‘interfaccia con una fase liquida
Ubiquita’ dei biofilm
Ecosistemi
Placca dentaria
Infezioni
Depurazione acque
Protesi mediche
Fanghi acidi da miniere
Sistemi industriali
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BIOFILM
Comunita‘ ben strutturata
di batteri e cellule eucariotiche
racchiuse in una matrice polimerica
prodotta dalle cellule stesse, e che cresce su
superfici (inerti o „biologiche“), soprattutto
all‘interfaccia con una fase liquida
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A
Cover slip
Flow cell chamber
A). Side section of a flow cell. Arrows indicate the channels for tubing insertion. The U-shaped bottom part is covered by a slip
made of different materials (see text).
B
B). Schematic representation of the flow cell system. F=flow cell chamber. P= peristaltic pump. W=waste. Air can be pumped
into the system to ensure full aeration of the bacterial culture.
Visualizzazione di un biofilm
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Un gene reporter “visuale”: la green fluorescent protein (GFP)
Visualizzazione di un biofilm
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Visualizzazione di un biofilm
UNA VISIONE “AGGIORNATA” DEI BIOFILM BATTERICI
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Formazione del biofilm
Adesione
Colonizzazione
Maturazione
Superficie
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Adesione iniziale: importanza dei parametri fisico-chimici
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La repulsione elettrostatica è il fattore principale
nell’adesione iniziale a superfici solide
Batterio a carica positiva
Batterio a carica negativa
Misurazione dell’idrofobicità di superficie:
Contact angle
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Conoscendo idrofobicità e carica è possibile prevedere
la colonizzazione di una superficie inerte (?)
(Ovviamente) le cose non sono così semplici……..
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Assorbimento di materiale idrofobico
Some examples of biosurfactants
Rhamnolipid
Subtilisin
Polymixin B
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Microtiter plate assays
Quantification of biofilm development
• Overnight culture in m icrotiter plates
• OD 600nm measurem ent of planktonic cells
• Rem oval of the liquid phase, rinsing w ith w ater
• Stain w ith 1% cristal-violet, rinsing w ith w ater, air drying
• Elution of C-V in ethanol 80%
• OD600nm mesurem ent of attached cells
Biofilm=
stained attached cells
planktonic cells
Biofilm formation
In microtiter plate
• Som e species w ith poor
ad hesion properties in colum n
assays are d eveloping biofilms
• Media w ith low concentration in
nutrients stim ulate biofilm
form ation instead of rich
m edium
• Presence of N aCl in LB is a
negative component to bacterial
attchm ent of m ost of the species
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Quali geni sono importanti per la formazione del biofilm?
Metodiche di inattivazione genica e selezione di mutanti difettivi
Flagelli, pili ed adesione
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Ruolo di flagelli e pili nella formazione del biofilm
3 Ore
8 Ore
Numerose mutazioni non inibiscono la formazione
di biofilm, ma ne alterano le caratteristiche
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Numerose mutazioni non inibiscono la formazione
di biofilm, ma ne alterano le caratteristiche
Curli: an important deteminant for surface attachment and
cell-cell communication
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Curli expression regulation
Escherichia coli MG1655 (WT strain)
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Escherichia coli MG1655ompR234
La formazione di biofilm è correlata con la
coniugazione ed il trasferimento orizzontale di
materiale genetico
Pilus
L’espressione del pilus
consente la coniugazione
batterica e stimola la
produzione di biofilm
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Il polisaccaride alginato e’ coinvolto nella
colonizzazione delle superfici
Acido β-D-mannuronico-α-L-glucuronico
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La produzione di alginato viene indotta solo ad adesione avvenuta
Luce
Epifluorescenza
Geni espressi differenzialmente
in biofilm e in cellule
planctoniche:
Inserzione di un gene reporter (lacZ) sul
cromosoma batterico e misurazione
dell’attività di β-galattosidasi in cellule
planctoniche ( ) o biofilm ( ).
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Genomic analysis of biofilm-dependent gene expression
through microarray analysis
Biof.
Single
cells
Il numero di geni che si
esprime in maniera
diversa in singole
cellule e nei biofilm
comprende una %
molto alta del genoma
(10-30%).
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Il numero di geni che si
esprime in maniera
diversa in singole
cellule e nei biofilm
comprende una %
molto alta del genoma
(10-30%).
Tutti coinvolti nella
formazione del
biofilm?
L’eterogeneità di espressione genica riflette anche (soprattutto?)
le diverse condizioni fisiologiche dei batteri in un biofilm complesso
Aerobi,
Crescita + veloce
[O2],
Nutr.
Anaerobi,
Crescita + lenta
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„Persistenza“ contro „Resistenza“:
Un altro caso di polimorfismo fenotipico?
Resistenza:
attraverso Mutazioni
viene ereditata
normalmente specifica per un antibiotico
o per una classe di antibiotici (es. β-lattamici)
Persistenza:
nessuna mutazione rilevabile
NON viene ereditata
generalmente tolleranza a tutti, o a classi
non correlate, di antibiotici
„Alive vs. dead“ staining
Colorante verde
(uptake attivo da parte delle cellule)
Colorante rosso
(non in grado di attraversare una
membrana citoplasmatica intatta)
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Cellule sopravvissute
all’esposizione al fago restano
sensibili al 99.99% se
reinoculate e re-infettate
Riassunto di un processo “dinamico”
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