Recupero lezione
annuncio pubblicitario
Recupero lezione Mercoledì 20 aprile 2005 Ore 10.30- Aula 207 I just can't go with the flow anymore. I've been thinking about joining a biofilm. 1 Biologia dei biofilm ... J. Bacte riol. 25, 277-286 (19 33) aus C. E . Zo bell: "The effe ct o f sur faces on bacterial activity", J. Bacterio l. 46, 39 -56 (1943) 2 BIOFILM Comunita‘ ben strutturata di batteri e cellule eucariotiche racchiuse in una matrice polimerica prodotta dalle cellule stesse, e che cresce su superfici (inerti o „biologiche“), soprattutto all‘interfaccia con una fase liquida Ubiquita’ dei biofilm Ecosistemi Placca dentaria Infezioni Depurazione acque Protesi mediche Fanghi acidi da miniere Sistemi industriali 3 4 5 BIOFILM Comunita‘ ben strutturata di batteri e cellule eucariotiche racchiuse in una matrice polimerica prodotta dalle cellule stesse, e che cresce su superfici (inerti o „biologiche“), soprattutto all‘interfaccia con una fase liquida 6 A Cover slip Flow cell chamber A). Side section of a flow cell. Arrows indicate the channels for tubing insertion. The U-shaped bottom part is covered by a slip made of different materials (see text). B B). Schematic representation of the flow cell system. F=flow cell chamber. P= peristaltic pump. W=waste. Air can be pumped into the system to ensure full aeration of the bacterial culture. Visualizzazione di un biofilm 7 Un gene reporter “visuale”: la green fluorescent protein (GFP) Visualizzazione di un biofilm 8 Visualizzazione di un biofilm UNA VISIONE “AGGIORNATA” DEI BIOFILM BATTERICI 9 Formazione del biofilm Adesione Colonizzazione Maturazione Superficie 10 11 Adesione iniziale: importanza dei parametri fisico-chimici 12 La repulsione elettrostatica è il fattore principale nell’adesione iniziale a superfici solide Batterio a carica positiva Batterio a carica negativa Misurazione dell’idrofobicità di superficie: Contact angle 13 Conoscendo idrofobicità e carica è possibile prevedere la colonizzazione di una superficie inerte (?) (Ovviamente) le cose non sono così semplici…….. 14 Assorbimento di materiale idrofobico Some examples of biosurfactants Rhamnolipid Subtilisin Polymixin B 15 Microtiter plate assays Quantification of biofilm development • Overnight culture in m icrotiter plates • OD 600nm measurem ent of planktonic cells • Rem oval of the liquid phase, rinsing w ith w ater • Stain w ith 1% cristal-violet, rinsing w ith w ater, air drying • Elution of C-V in ethanol 80% • OD600nm mesurem ent of attached cells Biofilm= stained attached cells planktonic cells Biofilm formation In microtiter plate • Som e species w ith poor ad hesion properties in colum n assays are d eveloping biofilms • Media w ith low concentration in nutrients stim ulate biofilm form ation instead of rich m edium • Presence of N aCl in LB is a negative component to bacterial attchm ent of m ost of the species 16 Quali geni sono importanti per la formazione del biofilm? Metodiche di inattivazione genica e selezione di mutanti difettivi Flagelli, pili ed adesione 17 Ruolo di flagelli e pili nella formazione del biofilm 3 Ore 8 Ore Numerose mutazioni non inibiscono la formazione di biofilm, ma ne alterano le caratteristiche 18 Numerose mutazioni non inibiscono la formazione di biofilm, ma ne alterano le caratteristiche Curli: an important deteminant for surface attachment and cell-cell communication 19 Curli expression regulation Escherichia coli MG1655 (WT strain) 20 Escherichia coli MG1655ompR234 La formazione di biofilm è correlata con la coniugazione ed il trasferimento orizzontale di materiale genetico Pilus L’espressione del pilus consente la coniugazione batterica e stimola la produzione di biofilm 21 Il polisaccaride alginato e’ coinvolto nella colonizzazione delle superfici Acido β-D-mannuronico-α-L-glucuronico 22 La produzione di alginato viene indotta solo ad adesione avvenuta Luce Epifluorescenza Geni espressi differenzialmente in biofilm e in cellule planctoniche: Inserzione di un gene reporter (lacZ) sul cromosoma batterico e misurazione dell’attività di β-galattosidasi in cellule planctoniche ( ) o biofilm ( ). 23 Genomic analysis of biofilm-dependent gene expression through microarray analysis Biof. Single cells Il numero di geni che si esprime in maniera diversa in singole cellule e nei biofilm comprende una % molto alta del genoma (10-30%). 24 Il numero di geni che si esprime in maniera diversa in singole cellule e nei biofilm comprende una % molto alta del genoma (10-30%). Tutti coinvolti nella formazione del biofilm? L’eterogeneità di espressione genica riflette anche (soprattutto?) le diverse condizioni fisiologiche dei batteri in un biofilm complesso Aerobi, Crescita + veloce [O2], Nutr. Anaerobi, Crescita + lenta 25 „Persistenza“ contro „Resistenza“: Un altro caso di polimorfismo fenotipico? Resistenza: attraverso Mutazioni viene ereditata normalmente specifica per un antibiotico o per una classe di antibiotici (es. β-lattamici) Persistenza: nessuna mutazione rilevabile NON viene ereditata generalmente tolleranza a tutti, o a classi non correlate, di antibiotici „Alive vs. dead“ staining Colorante verde (uptake attivo da parte delle cellule) Colorante rosso (non in grado di attraversare una membrana citoplasmatica intatta) 26 27 Cellule sopravvissute all’esposizione al fago restano sensibili al 99.99% se reinoculate e re-infettate Riassunto di un processo “dinamico” 28
