Biologia dei biofilm ... J. Bacte riol. 25, 277-286 (19 33) aus C. E . Zo bell: "The effe ct o f sur faces on bacterial activity", J. Bacterio l. 46, 39 -56 (1943) BIOFILM Comunita‘ ben strutturata di batteri e cellule eucariotiche racchiuse in una matrice polimerica prodotta dalle cellule stesse, e che cresce su superfici (inerti o „biologiche“), soprattutto all‘interfaccia con una fase liquida 1 Importanza dei biofilm microbici • Biofilm come fattore di virulenza: infezioni da biofilm più virulente, più tendenti a cronicizzarsi e più resistenti alle terapie • Batteri adesi ad una superficie solida o “flocculati” sono utilizzati preferenzialmente in bioreattori industriali e nella depurazione delle acque di scarico • I biofilm sono ubiquitari Un caso “reale” di biofilm misto come osservato in microscopia elettronica 2 Adesione Colonizzazione Maturazione Interazioni fisico-chimiche Pili EPS: produzione/organizzazione (idrofobicità, carica elettrica) Polisaccaridi (alginato) Quorum sensing Flagello Fattori di aggregazione cellulare Proteine di membrana (curli, ecc…) esterna, parete cellulare, LPS….. La formazione di biofilm è correlata con la coniugazione ed il trasferimento orizzontale di materiale genetico Pilus Due effetti dell’espressione del pilus: consente la coniugazione batterica e stimola la produzione di biofilm 3 Trasferimento genico orizzontale • Permette di trasferire plasmidi coniugativi, (evtl. con trasposoni annessi) o frammenti cromosomali • Tra i geni trasmessi, resistenza ad antibiotici ed enzimi di degradazione di sostanze organiche • Considerato come un’efficiente strategia di adattamento • L’alta frequenza di coniugazione nei biofilm rappresenta quindi un vantaggio di questa forma di organizzazione cellulare Genomic analysis of biofilm-dependent gene expression through microarray analysis Biof. Single cells 4 Il numero di geni che si esprime in maniera diversa in singole cellule e nei biofilm comprende una % molto alta del genoma (10-30%). Tutti coinvolti nella formazione del biofilm? L’eterogeneità di espressione genica riflette anche (soprattutto?) le diverse condizioni fisiologiche dei batteri in un biofilm complesso Aerobi, Crescita + veloce [O2], Nutr. Anaerobi, Crescita + lenta 5 Quorum sensing: da curiosità evolutiva a processo biologico globale Eurpymna scolopes Vibrio fischeri Quorum sensing: espressione genica dipendente dalla concentrazione cellulare Molecola segnale Molecola segnale Attivatore trascrizionale Attivatore trascrizionale Gene target Gene target Bassa concentrazione cellulare Alta concentrazione cellulare 6 La comunicazione intercellulare da quorum sensing è favorita in biofilm piuttosto che in colture liquide Cultura liquida: 108-109 cfu/ml Molecole segnale (in Gram negativi): acil-omoserin-lattoni (AHL o HSL) Quorum Sensing in Pseudomonas aeruginosa: Il sistema lasR/lasI e rhlR/rhlI costituiscono una cascata regolativa C12-HSL C4-HSL 7 Geni regolati da Quorum Sensing in Pseudomonas aeruginosa Tre classi funzionali principali: fattori di virulenza, sintesi di EPS, uptake del ferro Studi genomici stimano al 5-6% la percentuale di geni regolati da QS Il cluster rhlR/rhlI è così chiamato per il suo ruolo nella biosintesi dei rhamnolipidi Rhamnolipidi: un esempio di biosurfattanti e i responsabili della “gliding motility” 8 I promotori QS-dipendenti sono spesso co-regolati da meccanismi legati a stimoli ambientali/fisiologici (sito di legame per LuxR) Geni quorum sensing-dipendenti determinano la “struttura ordinata”all’interno di un biofilm batterico 9 La biosintesi degli AHL ha come unico scopo la creazione di una molecola segnale Le proteine regolatrici della famiglia LuxR sono tipici regolatori di risposta 10 11 Il QS è direttamente coinvolto in meccanismi di patogenesi nei mammiferi Gli induttori (molecole segnale) appartengono a classi chimiche diverse 12 Un caso a sé: gli Streptomyces S. coelicolor Streptomiceti/Attinomiceti: Batteri (Gram +) del suolo (30 °C temperatura ottimale di crescita) Organismo multicellulare (Uniche forme monocellulari: spore e protoplasti) Sporigeno (su substrati solidi, spore in circa 7 gg) Crescita come micelio in terreno liquido Principale produttore di antibiotici Geni regolatori: Numero di ORF predette S. coelicolor E. coli B. subtilis S. cerevisiae 7825 4289 4099 6203 65 fattori sigma TCRS: 85 sensor kinases 79 response regulators “A factor”: OH O O O identificato in S. griseus Mutanti incapaci di produrre A factor sono Spo-, StrS and StrA factor aggiunto esternamente ripristina il fenotipo originario A factor lega il repressore ArpA, inibendone l’attività E’ in grado di agire a concentrazioni nM Coinvolto nella produzione di numerosi composti antimicrobici 13 OH A factor, S. griseus O O O OH O O OH S. bikiniensis, S. cyanofuscatus, S. viridochromogenes OH S. virginiae O O OH γ-butirrolattoni in Streptomyces OH S. bikiniensis, S. cyanofuscatus O O OH OH S. virginiae O O OH OH S. virginiae O O OH OH S. virginiae O O OH OH S. virginiae O O OH OH Streptomyces sp. FRI-5 O O OH Quorum sensing in batteri Gram + • Molecole segnale: peptidi (modificati) • Processi biologici regolati da QS: Coniugazione, virulenza, produzione di enzimi extracellulari, adesione cellulare, formazione di biofilm Competenza Produzione di peptidi antimicrobici 14 Peptidi segnale (auto-induttori) in batteri Gram positivi Sistemi agr e com: una struttura comune agrD (virulenza in S. aureus) comX (competenza in B. subtilis) 15 Secrezione e uptake del peptide AgrD AgrC/A: sistema a due componenti AgrB: secrezione/modificazione AgrC: sensore PO4 A AgrA regolatore di risposta Il sistema agr si autoregola tramite un RNA (hld) hld modula l’attività di AgrA e di altri regolatori globali 16 Schema generale del QS in Gram + Confronto tra processi di QS in Gram - e Gram + Molecole segnale o “feromoni” Feromoni: HSL Libera diffusione attraverso la membrana Sistemi a due componenti (entrambi citoplasmatici) Feromoni: peptidi Secrezione attiva Sistemi a due componenti: Un sensore inserito nella membrana Un regolatore citoplasmatico 17 La “doppia vita” dei peptidi segnale: attività antimicrobica • Un vasto gruppo di peptidi segnale presenta un’attività antimicrobica (generalmente mediata da destabilizzazione della membrana) particolarmente spiccata contro altri batteri Gram+ (plantaricina, enterocina, lantibiotici) • Particolarmente presenti in batteri lattici (importanti per biotecnologie alimentari) Un peptide antimicrobico “utile”: la nisina Prodotta da lactobacilli; espressione richiede alta densità cellulare (QS) unitamente a fase stazionaria di crescita. Ampio spettro d’azione contro Gram + (a concentrazioni nM) Prodotta spontaneamente (o aggiunta) nella preparazione dei formaggi 18 Se ricordiamo lo schema generale del QS in Gram+……. …..possiamo comprendere il sistema di produzione e processamento della nisina! Oltre al sistema di modificazione/esporto e di trasduzione del segnale, i ceppi produttori di nisina posseggono geni per l’immunità 19 Biosintesi e processamento dei lantibiotici • Auto-regolazione (+ regolazione da segnali ambientali e fisiologici) • Largo numero di geni coinvolti in: modificazione, esporto, trasduzione del segnale ed immunità (da 10 a 18) • Interesse come “nuovo” agente antimicrobico e per applicazioni biotecnologiche (ind. alimentare) Anche i geni dell’immunità sono sotto il diretto controllo della nisina 20 Nisin-controlled expression (NICE) Espressione di geni letali tramite induzione con nisina Enzimi intracellulari di lactobacillo sono essenziali nella maturazione dei formaggi La lisi “controllata” potrebbe accelerare e standardizzare questo processo 21 Referenze biofilm/QS • Winzer, Hardie, and Williams. Bacterial cell-to-cell communication: sorry, can’t talk now — gone to lunch! Current Opinion in Microbiology 2002, 5:216–222 • Withers, Swift, and Williams. Quorum sensing as an integral component of gene regulatory networks in Gram-negative bacteria. Current Opinion in Microbiology 2001, 4:186–193 • O‘ Toole and Kolter. Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Mol Microbiol. 1998, 30:295-304 • O‘ Toole, Kaplan, and Kolter. Biofilm formation as microbial development. Annu Rev Microbiol. 2000, 54:49-79. • Davies, Parsek, Pearson, Iglewski, Costerton, and Greenberg. The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm. Science 1998, 10:295-298 • Kleerebezem. Quorum sensing control of lantibiotic production; nisin and subtilin autoregulate their own biosynthesis Peptides 2004, 25:1405-1414 • • • Web: http://www.erc.montana.edu/ http://gasp.med.harvard.edu/ http://www.nottingham.ac.uk/quorum/ (University of Montana) (Kolter lab) (Quorum sensing network) 22