Dinamiche di popolazioni nella fase stazionaria: il fenomeno GASP Competizione all’interno di popolazioni miste: il futuro è dei vecchi Colture “fresche” (A), non adattate A B Domanda iniziale: La fase di morte* dopo la crescita è dominata da eventi stocastici o determinati? *= la “morte” batterica corrisponde a non coltivabilità/ integrità di membrana GASP: Growth Advantage in Stationary Phase Colture “vecchie” (B), adattate a lunghi periodi di noncrescita La competizione tra batteri originati dallo stesso batterio viene sempre vinta dalle colture con più lunghi periodi di adattamento alla fase stazionaria. Questo suggerisce processi di adattamento e/o di selezione di mutazioni in condizioni di “non crescita”. Natura delle mutazioni GASP • Incremento dell’espressione di sistemi di trasporto per carboidrati Una mutazione frequente che conduce al fenotipo GASP ha luogo nel gene rpoS (fattore sigma alternativo specifico per la fase stazionaria) Eventi di mutazione determinano una costante evoluzione della popolazione batterica • Inattivazione di regolatori globali indotti nella fase stazionaria come relA (sintesi di ppGpp) o rpoS (fattore sigma alternativo σS; mutazioni spesso reversibili) Quindi…… i geni coinvolti nell’adattamento alla fase stazionaria sembrano svantaggiare la sopravvivenza della cellula a lungo termine! 1 Un possibile modello per il fenotipo GASP: i sistemi TA (tossina/antitossina) Diversi sistemi TA sembrano dipendere strettamente da geni di adattamento alla fase stazionaria! ecnAB Un esempio di sistema plasmidico di tossina/antitossina: parD (kis/kid) (membrane poison) Espressione della tossina dipende da σS Tossina: proteina stabile (basso livello di trascrizione) Antitossina: proteina instabile (livello di trascrizione + alto) mazEF (inibitore DNA girasi) I sistemi TA si ritrovano frequentemente su plasmidi ed elementi mobili, con l’unica apparente funzione di eliminare i microrganismi (ricombinanti, segreganti ecc.) che non ne mantenessero la sequenza codificante (cosiddetto “selfish DNA”) Meccanismo d’apoptosi a livello di popolazione: il sacrificio di molti per la sopravvivenza di pochi Rallentamento metabolico Mutazioni bloccano l’attivazione di sistemi TA Crescita “cannibalistica” della subpopolazione mutata Presenza di ppGpp (gene relA) induce l’accumulo della tossina MazF To GASP or not to GASP… this is the question…. Induzione sistemi TA Lisi cellulare Subpopolazione GASP: Rilascio del contenuto intracellulare; nuova disponibilità di sostanze organiche Reversione al fenotipo WT in condizioni di crescita Maggiore sensibilità a stress cellulari Minore competitività nella crescita veloce Favorita in fase stazionaria prolungata Subpopolazione non mutata: Morte da sistemi TA durante prolungata fase stazionaria Favorita in situazione di crescita 2 Biologia dei biofilm ... J. Bacte riol. 25, 277-286 (19 33) aus C. E . Zo bell: "The effe ct o f sur faces on bacterial activity", J. Bacterio l. 46, 39 -56 (1943) Importanza dei biofilm microbici BIOFILM Comunita‘ ben strutturata di batteri e cellule eucariotiche racchiuse in una matrice polimerica prodotta dalle cellule stesse, e che cresce su superfici (inerti o „biologiche“), soprattutto all‘interfaccia con una fase liquida • Biofilm come fattore di virulenza: infezioni da biofilm più virulente, più tendenti a cronicizzarsi e più resistenti alle terapie • Batteri adesi ad una superficie solida o “flocculati” sono utilizzati preferenzialmente in bioreattori industriali e nella depurazione delle acque di scarico • I biofilm sono ubiquitari 3 Un caso “reale” di biofilm misto come osservato in microscopia elettronica Il biofilm come risposta a stress ambientali? Condizioni “non ottimali” di crescita (bassa temperatura, scarsità di sostanze nutritive) favoriscono la formazione di biofilm in piastre microtiter Un sistema semplice per la determinazione del biofilm: la piastra microtiter Adesione Colonizzazione Maturazione Interazioni fisico-chimiche Pili EPS: produzione/organizzazione (idrofobicità, carica elettrica) Polisaccaridi (alginato) Quorum sensing Flagello Fattori di aggregazione cellulare Proteine di membrana (curli, ecc…) esterna, parete cellulare, LPS….. 4 Fattori di virulenza e di adesione: specifici o non-specifici? A diversi fattori importanti nella formazione dei biofilm è stata “assegnata” una funzione specifica di interazione con proteine dell’ospite pili di tipo I curli Curli: un fattore coinvolto sia nell‘adesione a superfici solide che nell‘interazione cellula-cellula Cell-surface interaction Cell-cell aggregation recettore del mannosio fibronectina Ma la funzione di questi fattori è sicuramente più generica….. La regolazione dei fattori di adesione/aggregazione cellulare è spesso complessa e modulata da sistemi di regolazione a due componenti Numerose mutazioni non inibiscono la formazione di biofilm, ma ne alterano le caratteristiche Curli: Espressi a: osmolarità medio-bassa (regolatore positivo: OmpR regolatore negativo: CpxR) Fase stazionaria/crescita lenta (regolatore: σS) bassa temperatura (Crl, regolatori non identificati) 5 Numerose mutazioni non inibiscono la formazione di biofilm, ma ne alterano le caratteristiche La formazione di biofilm è correlata con la coniugazione ed il trasferimento orizzontale di materiale genetico Pilus Due effetti dell’espressione del pilus: consente la coniugazione batterica e stimola la produzione di biofilm Trasferimento genico orizzontale • Permette di trasferire plasmidi coniugativi, (evtl. con trasposoni annessi) o frammenti cromosomali • Tra i geni trasmessi, resistenza ad antibiotici ed enzimi di degradazione di sostanze organiche • Considerato come un’efficiente strategia di adattamento • L’alta frequenza di coniugazione nei biofilm rappresenta quindi un vantaggio di questa forma di organizzazione cellulare Il “sacro Graal” del biofilm: il segnale cellulare di “adesione avvenuta” • Si è identificato un numero crescente di geni/proteine espressi solo o preferenzialmente in cellule adese ad una superficie solida. (alginato, OmpX…) • Il meccanismo molecolare di questo processo (probabilmente mediato da sistemi di regolazione a due componenti) non è ancora stato definito 6