Natura delle mutazioni GASP

Dinamiche di popolazioni nella fase
stazionaria: il fenomeno GASP
Competizione all’interno di popolazioni
miste: il futuro è dei vecchi
Colture “fresche” (A),
non adattate
A
B
Domanda iniziale:
La fase di morte*
dopo la crescita è
dominata da eventi
stocastici o
determinati?
*= la “morte” batterica corrisponde a non coltivabilità/ integrità di membrana
GASP: Growth Advantage in
Stationary Phase
Colture “vecchie” (B),
adattate a lunghi
periodi di noncrescita
La competizione tra batteri originati dallo stesso batterio viene sempre vinta dalle
colture con più lunghi periodi di adattamento alla fase stazionaria.
Questo suggerisce processi di adattamento e/o di selezione di mutazioni in
condizioni di “non crescita”.
Natura delle mutazioni GASP
• Incremento dell’espressione di sistemi di
trasporto per carboidrati
Una mutazione frequente che
conduce al fenotipo GASP ha
luogo nel gene rpoS (fattore
sigma alternativo specifico per
la fase stazionaria)
Eventi di mutazione determinano una costante
evoluzione della popolazione batterica
• Inattivazione di regolatori globali indotti nella
fase stazionaria come relA (sintesi di ppGpp) o
rpoS (fattore sigma alternativo σS; mutazioni
spesso reversibili)
Quindi…… i geni coinvolti nell’adattamento alla
fase stazionaria sembrano svantaggiare la
sopravvivenza della cellula a lungo termine!
1
Un possibile modello per il fenotipo GASP:
i sistemi TA (tossina/antitossina)
Diversi sistemi TA sembrano dipendere strettamente
da geni di adattamento alla fase stazionaria!
ecnAB
Un esempio di sistema
plasmidico di tossina/antitossina:
parD (kis/kid)
(membrane poison)
Espressione della tossina
dipende da σS
Tossina: proteina stabile (basso
livello di trascrizione)
Antitossina: proteina instabile
(livello di trascrizione + alto)
mazEF
(inibitore DNA girasi)
I sistemi TA si ritrovano frequentemente su plasmidi ed elementi
mobili, con l’unica apparente funzione di eliminare i microrganismi
(ricombinanti, segreganti ecc.) che non ne mantenessero la sequenza
codificante (cosiddetto “selfish DNA”)
Meccanismo d’apoptosi a livello di popolazione: il
sacrificio di molti per la sopravvivenza di pochi
Rallentamento
metabolico
Mutazioni bloccano
l’attivazione di sistemi TA
Crescita “cannibalistica”
della subpopolazione mutata
Presenza di ppGpp (gene relA)
induce l’accumulo della tossina
MazF
To GASP or not to GASP…
this is the question….
Induzione sistemi TA
Lisi cellulare
Subpopolazione
GASP:
Rilascio del contenuto
intracellulare; nuova
disponibilità di sostanze
organiche
Reversione al fenotipo WT
in condizioni di crescita
Maggiore sensibilità a
stress cellulari
Minore competitività
nella crescita veloce
Favorita in fase
stazionaria
prolungata
Subpopolazione non
mutata:
Morte da sistemi TA
durante prolungata
fase stazionaria
Favorita in
situazione di
crescita
2
Biologia dei biofilm
...
J. Bacte riol. 25, 277-286 (19 33)
aus C. E . Zo bell: "The effe ct o f sur faces on bacterial activity", J. Bacterio l. 46, 39 -56 (1943)
Importanza dei biofilm microbici
BIOFILM
Comunita‘ ben strutturata
di batteri e cellule eucariotiche
racchiuse in una matrice polimerica
prodotta dalle cellule stesse, e che cresce su
superfici (inerti o „biologiche“), soprattutto
all‘interfaccia con una fase liquida
• Biofilm come fattore di virulenza: infezioni da
biofilm più virulente, più tendenti a
cronicizzarsi e più resistenti alle terapie
• Batteri adesi ad una superficie solida o
“flocculati” sono utilizzati preferenzialmente in
bioreattori industriali e nella depurazione
delle acque di scarico
• I biofilm sono ubiquitari
3
Un caso “reale” di biofilm misto come osservato in microscopia elettronica
Il biofilm come risposta a stress ambientali?
Condizioni “non ottimali”
di crescita (bassa
temperatura, scarsità di
sostanze nutritive)
favoriscono la formazione
di biofilm in piastre
microtiter
Un sistema semplice per la determinazione del biofilm:
la piastra microtiter
Adesione
Colonizzazione
Maturazione
Interazioni fisico-chimiche
Pili
EPS: produzione/organizzazione
(idrofobicità, carica elettrica)
Polisaccaridi (alginato)
Quorum sensing
Flagello
Fattori di aggregazione cellulare
Proteine di membrana
(curli, ecc…)
esterna,
parete cellulare, LPS…..
4
Fattori di virulenza e di adesione:
specifici o non-specifici?
A diversi fattori importanti nella formazione dei
biofilm è stata “assegnata” una funzione
specifica di interazione con proteine dell’ospite
pili di tipo I
curli
Curli: un fattore coinvolto sia nell‘adesione a superfici
solide che nell‘interazione cellula-cellula
Cell-surface interaction
Cell-cell aggregation
recettore del mannosio
fibronectina
Ma la funzione di questi fattori è sicuramente più generica…..
La regolazione dei fattori di adesione/aggregazione cellulare è spesso
complessa e modulata da sistemi di regolazione a due componenti
Numerose mutazioni non inibiscono la
formazione di biofilm, ma ne alterano le
caratteristiche
Curli:
Espressi a:
osmolarità medio-bassa
(regolatore positivo: OmpR
regolatore negativo: CpxR)
Fase stazionaria/crescita lenta
(regolatore: σS)
bassa temperatura
(Crl, regolatori non identificati)
5
Numerose mutazioni non inibiscono la
formazione di biofilm, ma ne alterano le
caratteristiche
La formazione di biofilm è correlata con la
coniugazione ed il trasferimento orizzontale
di materiale genetico
Pilus
Due effetti dell’espressione
del pilus:
consente la coniugazione
batterica e stimola la
produzione di biofilm
Trasferimento genico
orizzontale
• Permette di trasferire plasmidi coniugativi, (evtl.
con trasposoni annessi) o frammenti
cromosomali
• Tra i geni trasmessi, resistenza ad antibiotici ed
enzimi di degradazione di sostanze organiche
• Considerato come un’efficiente strategia di
adattamento
• L’alta frequenza di coniugazione nei biofilm
rappresenta quindi un vantaggio di questa forma
di organizzazione cellulare
Il “sacro Graal” del biofilm:
il segnale cellulare di “adesione
avvenuta”
• Si è identificato un numero crescente di
geni/proteine espressi solo o
preferenzialmente in cellule adese ad una
superficie solida. (alginato, OmpX…)
• Il meccanismo molecolare di questo
processo (probabilmente mediato da
sistemi di regolazione a due componenti)
non è ancora stato definito
6